Name: 纳米巴支持的脂质双层系统，用于体外研究膜曲率传感蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 了解纳米棒支撑脂质双层系统用于体外研究膜曲率传感蛋白的方法。该技术通过高分辨率纳米制造技术实现精确曲率控制，帮助研究人员深入探索蛋白质与弯曲膜相互作用的动态机制。

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感谢南洋理工大学（NTU）的南洋纳米制造中心（N2FC）和颠覆性光子技术中心（CDPT）在纳米结构制备和扫描电子显微镜成像方面提供的支持，感谢NTU生物科学学院蛋白质生产平台（PPP）在蛋白质纯化方面的协助，以及NTU化学与生物医学工程学院提供的共聚焦显微镜设备。本研究由新加坡教育部（MOE）（W. Zhao，项目编号RG112/20、RG95/21和MOE-T2EP30220-0009）、在卓越研究中心计划下由MOE资助的数字分子分析与科学研究所（IDMxS）（W. Zhao）、人类前沿科学计划基金会（W. Zhao，项目编号RGY0088/2021）、NTU启动基金（W. Zhao）、NTU化学与生物医学工程学院的研究奖学金（X. Miao）以及中国国家留学基金管理委员会的研究奖学金（J. Wu）资助。

1. 纳米芯片的清洗
<ol>
	<li>将纳米芯片置于10 mL烧杯中，有图案的一面朝上。 
	注意：该石英纳米芯片已经制备完成 通过 电子束光刻，如前所述21芯片上纳米结构的几何形状和排列方式可进行定制化设计。此处使用的梯度纳米条尺寸为：长度2000 nm，高度600 nm，宽度范围100至1000 nm（步长100 nm）。</li>
	<li>小心地将1 mL 98%硫酸加入烧杯中，确保酸液完全覆盖芯片的正面和背面。 
	注意：98% 硫酸具有极强腐蚀性，接触皮肤或眼睛后可迅速造成组织损伤和严重的化学灼伤。应在通风橱中使用，并做好适当防护。</li>
	<li>缓慢旋转烧杯，并逐滴加入200 µL 30%过氧化氢，直至整个烧杯变热。确保硫酸与过氧化氢充分混合，形成芬顿溶液，以去除纳米芯片上的有机分子17在洁净的亲水性表面上制备SLB还有其他可选技术，例如前文所述的紫外光和臭氧处理。23. 
	注意：该反应为强放热反应，可能导致溶液沸腾，因此需将过氧化氢逐滴加入硫酸中，并持续旋转容器。</li>
	<li>将烧杯放入次级玻璃容器中，并使纳米芯片在piranha溶液中浸泡过夜，以彻底清除杂质。 
	注意：将烧杯置于通风橱内，不要加盖，以防反应产生气体。</li>
	<li>将烧杯取出，小心地用移液管将piranha溶液转移至酸性废液容器中。</li>
	<li>将5 mL去离子水加入烧杯中，以稀释残留酸液，并将溶液倒入酸废液桶中。重复此步骤五次，并使用5 M NaOH中和酸废液。</li>
	<li>用镊子夹取芯片，并用去离子水持续冲洗，以彻底去除残留酸液。用99.9%氮气吹干芯片，以形成SLB。22.</li>
</ol>
2. 小单层囊泡（SUVs）的制备
<ol>
	<li>向棕色小瓶中加入 100 µL 氯仿。 
	注意：氯仿是一种高度挥发性的无色液体，吸入或吞咽可能具有毒性。请在通风橱中佩戴口罩和手套操作。</li>
	<li>将 500 µg 脂质混合物溶解于氯仿中。此处所用脂质混合物的组成为：89.5 mol% 卵磷脂酰胆碱（PC）、10 mol% 脑磷脂酰丝氨酸（PS）和 0.5 mol% 德州红 1,2-二十六烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺三乙基铵盐（Texas Red DHPE）。</li>
	<li>用纯度为 99.9% 的氮气吹干小瓶中的脂质混合物，直至氯仿完全挥发，脂质混合物干燥。 
	注意：此步骤应在通风橱中进行。吹干过程中避免液体飞溅。</li>
	<li>将未加盖的棕色小瓶放入铝箔包裹的真空干燥器中，然后使用真空泵抽真空干燥 3 小时，以彻底挥发残留的氯仿。</li>
	<li>向小瓶中加入 250 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）。涡旋振荡溶液，直至均匀。 
	注意：PBS 缓冲液含有 150 mM NaCl，不含钙、镁和酚红；pH 值调节至 7.2，用于形成 PC 和 PS 脂双层。</li>
	<li>将脂质混合物置于浴式超声仪中，在 50 kHz 频率下超声处理 30 分钟。随后将脂质混合物转移至 1.5 mL 离心管中，并用封口膜密封。</li>
	<li>将脂质混合物在液氮中冷冻 20 秒，然后在 42 °C 水浴中解冻 2 分钟。重复冻融循环 30 次。完成后，脂质混合物呈现为澄清液体。 
	警告：液氮沸点约为 −195.8 ˚C，可导致冻伤或低温灼伤。请在开放空间中操作，并佩戴隔热手套。</li>
	<li>分别用乙醇、氯仿和甲醇依次冲洗两个玻璃气密注射器及微型挤出器连接头，重复冲洗五次以预清洁装置。将其置于通风橱中，直至有机溶剂完全挥发。</li>
	<li>组装微型挤出器装置，并让 500 µL PBS 缓冲液通过连接头，以预润湿装置，然后从另一端注射器中弃去缓冲液。此步骤可去除杂质并促进后续挤出过程。</li>
	<li>将微型挤出器装置装配带有 100 nm 孔径的聚碳酸酯滤膜。 
	注意：滤膜的孔径决定了脂质体的直径。</li>
	<li>用其中一个注射器吸取 500 µL PBS 缓冲液，缓慢推动其通过滤膜，使缓冲液填充另一端的空注射器。来回挤出三次，检查装置是否泄漏，并从第二个注射器中弃去缓冲液。</li>
	<li>用脂质混合物通过微型挤出器置换 PBS 缓冲液，然后来回挤出 20 次以形成小单室脂质体（SUVs）。若挤出次数不足，囊泡可能保留多层结构，这将影响支撑脂双层（SLB）的形成23。</li>
	<li>从第二个注射器中收集 SUVs，以减少大颗粒污染，并将其转移至 1.5 mL 离心管中。 
	注意：拆卸时应将注射器笔直拔出连接头，以防注射器断裂。</li>
	<li>用铝箔包裹离心管，防止荧光标记脂质发生漂白，并于 4 ˚C 保存。通常 SUVs 可保存最多 7 天。</li>
</ol>
3. 纳米芯片上支撑脂双层的形成
<ol>
	<li>用镊子小心地从去离子水中取出清洗后的纳米芯片，并用99.9%的氮气吹干。</li>
	<li>对纳米芯片进行1小时的空气等离子体处理，以完成表面清洁。</li>
	<li>将纳米芯片组装到聚二甲基硅氧烷（PDMS）腔室中，该腔室由两片PDMS组成——中间PDMS和顶部PDMS（图1A）。中间PDMS较薄（约0.5 mm），中心有一个较大的椭圆形开口，以确保纳米条纹图案充分暴露。顶部PDMS较厚（约4.0 mm），在大椭圆形开口区域内有两个小孔，作为液体操作的进样口和出样口。
	<ol>
		<li>将芯片放置在清洁的表面上，图案面朝上。</li>
		<li>轻轻将中间PDMS覆盖在芯片上，并确保整个图案暴露于中间PDMS中心大椭圆形开口的中央区域。</li>
		<li>将顶部PDMS覆盖在中间PDMS上，并使其两个小孔位于中间PDMS大椭圆孔的范围内。此时PDMS腔室即组装完成。 
		注：PDMS是最广泛使用的硅基有机聚合物。它具有生物相容性、透明性，并且可变形，可设计成定制形状用于芯片组装及显微镜下的成像。更重要的是，经过等离子体处理后，PDMS可与另一层PDMS或玻璃共价紧密结合，因此适合作为制备支持性脂双层（SLB）的腔室。此步骤确保每层PDMS紧密贴合，避免产生缝隙或泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液枪从顶部PDMS的两个小孔之一将小单层脂质体（SUVs）加入PDMS腔室中，在室温下孵育15分钟，以形成支持性脂双层（SLB）。</li>
	<li>从一侧小孔轻轻加入PBS缓冲液至PDMS腔室，并用棉签从另一侧小孔吸除废液，以洗去未结合的SUVs。随后获取在纳米芯片上形成的SLB（SLB的质量通过荧光漂白后恢复（FRAP）进行检测，如步骤4.4所示，并在代表性结果部分中讨论）。 
	&#8203;注：向腔室中加入PBS缓冲液时，移液枪尖端应充满缓冲液并接触液面，以避免引入气泡。</li>
</ol>
4. 在纳米芯片上成像SLB及曲率感应蛋白的结合
注意：本部分将取决于实验可用的显微镜系统。此处将描述成像操作的总体指南。不同显微镜装置之间的详细设置可有所调整。
<ol>
	<li>使用100倍（数值孔径1.4）油镜建立激光扫描共聚焦显微镜系统。打开ZEN软件，选择可激发脂质和蛋白质荧光的激发激光功率。选择 采集模式 &#62; Smart Setup &#62; Texas Red DHPE / EGFP。</li>
	<li>通过调焦旋钮调节焦距，定位芯片上的纳米条，直至在脂质通道下纳米条边缘清晰。</li>
	<li>设置以下扫描参数，以在添加蛋白质前获取脂质通道的对照图像：帧大小 = 512 px × 512 px（512像素 × 512像素，像素尺寸为124 nm），每像素位数 = 16（16位深度），扫描速度 = 5，以及 平均次数 = 4（每行平均4次）。</li>
	<li>通过漂白随机单个纳米条区域上的荧光标记脂双层进行FRAP实验。
	<ol>
		<li>选中 实验区域 和 漂白 复选框。绘制一个直径为5 µm的圆形区域，使其包含位于中心的整个纳米条（纳米条尺寸为2 µm），并将其添加至 实验区域。输入时间序列成像参数，示例如下：选择 扫描速度 = 9 和 平均次数 = 1。选择 时间序列 &#62; 持续时间 = 100个循环 和 时间间隔 = 2 s。输入漂白参数，示例如下：选中 在 # 张图像后开始 复选框，并选择 三 张图像。</li>
		<li>选中执行FRAP的激光复选框，并将功率调整为 100.0%。点击 开始实验 开始FRAP实验。 
		注意：FRAP是一种用于表征细胞分子运动性的常用方法。若SLB具有良好的流动性，漂白区域的荧光将逐渐恢复，因为漂白的荧光分子扩散出去，而未漂白的荧光分子从其他区域扩散进入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将蛋白质溶液注入PDMS腔室，并在室温下孵育5分钟，以使蛋白质结合到SLB上。 
	注意：在 图2G、H 中用于演示脂质组分促进蛋白质在纳米条曲面SLB上结合所使用的蛋白质为74 µM GFP和79 µM GFP-His。这两种蛋白质分别为无His标签和带有His标签的绿色荧光蛋白。在 图4 和 图5 中用于曲率感知研究的蛋白质为16 µM F-BAR、16 µM IDRFBP17 和16 µM FBAR+IDRFBP17。这三种蛋白质均来源于FBP17，该蛋白是一种典型的BAR蛋白，通常被认为既是曲率生成者也是曲率感知者。每种蛋白质体积为20 µL。</li>
	<li>重新对焦纳米条，并重复步骤4.3，对脂质和蛋白质通道进行成像，以检测蛋白质的曲率感知。</li>
	<li>重复步骤4.4，对脂质和蛋白质通道分别进行FRAP实验，并进行时间序列成像，以表征曲率感知蛋白的运动性。</li>
</ol>
5. 纳米芯片的重复使用
<ol>
	<li>用镊子夹取纳米芯片，并在盛有去离子水的 50 mL 烧杯中小心地将其从 PDMS 腔室上剥离。 
	注意：此步骤至关重要。避免镊子接触纳米结构，切勿强行分离芯片，以防产生裂纹。</li>
	<li>用无水乙醇彻底清洗纳米芯片，以去除表面附着的有机残留物。 
	注意：在使用无水乙醇清洗前，先用洁净的擦镜纸擦去表面水分。 
	警告：无水乙醇为高度挥发性且具有一定危险性的化学品。避免接触皮肤和眼睛。应在通风橱内佩戴口罩和手套操作。</li>
	<li>用大量去离子水彻底冲洗芯片，以去除残留的乙醇。然后用纯度为 99.9% 的氮气吹干芯片。 
	注意：进入下一步操作前，必须彻底清除芯片上所有乙醇残留，因为 piranha 酸（piranha solution）会与有机溶剂剧烈反应，可能引发爆炸。</li>
	<li>将芯片放入洁净的 10 mL 小烧杯中，使图案面朝上，并使用 piranha 溶液清洗芯片以供重复使用，具体步骤与“纳米芯片清洗”相同。</li>
</ol>
6. 图像定量分析
<ol>
	<li>旋转显微镜获取的图像，使纳米棒阵列在Fiji软件中后续分析时处于垂直位置。</li>
	<li>使用自定义编写的MATLAB代码“c_pillarmask_averaging”，通过一个方形掩模（51像素 × 51像素）在脂质通道和蛋白质通道中分别定位单个纳米棒。 
	注意：该MATLAB代码专为纳米芯片设计，可通过GitHub&#160;via&#160;链接获取：&#160;https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX。</li>
	<li>使用MATLAB代码“BarGra_avg”中的meshgrid函数，根据图像四个角上的三个感兴趣区域（ROI，5像素 × 5像素）减去每幅图像的背景信号。该操作旨在校正由于显微镜设置或芯片在显微镜载物台上未完全水平所导致的潜在不均匀背景噪声。</li>
	<li>使用MATLAB代码“BarGra_avg”生成相同尺寸纳米棒的平均图像，其中每个像素点的值为所有个体纳米棒方形掩模中对应位置像素值的均值。在Fiji软件中生成平均图像的三维表面图，以直观显示纳米棒周围信号的平均分布情况。选择 分析 &#62; 表面图 &#62;，输入 100 作为 多边形倍增因子，并勾选 阴影、绘制坐标轴 和 平滑 选项。</li>
	<li>使用MATLAB代码“avg_nanobar_quantification”将每个纳米棒划分为三个区域，包括两个纳米棒末端区域和一个纳米棒中心区域，分别提取其荧光强度。纳米棒感兴趣区域（ROI）的大小根据“position”文件中纳米棒的尺寸进行调整。</li>
	<li>将MATLAB代码“avg_nanobar_quantification”提取的纳米棒末端区域的蛋白质强度除以脂质强度，得到排除表面面积效应的纳米棒末端密度。</li>
	<li>在GraphPad Prism中绘制不同浓度下的纳米棒末端密度，获得结合曲线。打开 分析 菜单，选择 非线性回归（曲线拟合）&#62; 结合-饱和 &#62; 带Hill斜率的特异性结合 函数，使用Hill方程拟合曲线，并计算KD值和Hill系数。</li>
	<li>使用MATLAB代码“avg_nanobar_quantification”将脂质和蛋白质强度归一化为在同一图像中600 nm纳米棒中心处对应的强度。</li>
	<li>对于相同尺寸的纳米棒，使用纳米棒末端区域归一化后蛋白质强度最亮的九个像素值除以棒中心区域的值，量化蛋白质的曲率感知能力，该值命名为 &#34;末端-中心比值&#34;。对于不同尺寸的纳米棒，使用归一化后的蛋白质强度与归一化脂质强度的比值来量化蛋白质的曲率感知范围，该值命名为 &#34;归一化纳米棒末端密度&#34;。这些数值由MATLAB代码“avg_nanobar_quantification”计算得出。</li>
	<li>在Fiji软件中加载FRAP时间序列图像。选择FRAP区域并生成感兴趣区域（ROI）。选择 更多 &#62; 多次测量 功能，测量每个时间点FRAP区域的强度。在GraphPad Prism中绘制强度变化，生成FRAP恢复曲线。</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

作者声明本工作中不存在竞争性财务利益。

本文所述的纳米棒-支持性脂双层（nanobar-SLB）系统结合了多种现有体外（in vitro）检测方法的优势。该系统能够高效揭示蛋白质对高度弯曲膜的优先结合特性，类似于脂质体漂浮或沉降实验，但所需样品量显著减少，并且在单个纳米棒上可提供更精确控制的曲率8,29。它还像SLiC实验一样，可在同一平台上实现多种精确调控曲率的并行比较，同时由于SLB具有流动性并能紧密覆盖所有尺寸的纳米棒，因此无需担忧不同曲率下脂质组成的变化，也避免了因结构尺寸低于光衍射极限而无法检测到的形貌或曲率变化30。nanobar-SLB还允许观察蛋白质在弯曲膜上的动态行为，类似于拴绳拉拔实验，但不受制备膜管通量的限制，也无需依赖光镊操作的技术经验13。尽管SMrT实验可高通量生成膜纳米管，但膜管上的曲率沿长度方向变化，使得研究蛋白质对曲率的敏感性更加困难16。更有意义的是，与其他基于图案...

膜曲率是细胞的一个关键物理参数，在形态发生、细胞分裂和细胞迁移等多种细胞过程中均会呈现1。目前普遍认为，膜曲率不仅仅是细胞活动的简单结果，而已被证实可有效调控蛋白质相互作用和细胞内信号传导。例如，研究发现参与网格蛋白介导的内吞作用的多种蛋白质更倾向于结合弯曲的膜结构，从而形成内吞作用的热点区域2。导致膜变形的原因多种多样，包括细胞骨架作用力对膜的牵拉、具有不同大小头部基团的脂质不对称分布、呈圆锥形的跨膜蛋白的存在、BAR结构域蛋白（以Bin、amphiphysin和Rvs蛋白命名）等膜塑形蛋白的聚集，以及两亲性螺旋结构域插入膜中1。有趣的是，这些蛋白质和脂质不仅能引起膜变形，还可感知膜曲率并表现出优先富集的特性1。因此，研究不同曲率的膜是否以及如何改变其上附着的蛋白质和脂质的分布与动态行为，及其对相关细胞内过程的潜在影响，具有重要意义。
已开发出多种技术用于分析活细胞和固定细胞中弯曲膜与蛋白质之间的相互作用 体外 系统。活细胞系统提供了具有丰富脂质多样性和动态蛋白质信号调控的真实细胞环境2,3,4,5,6,7然而，由于细胞内环境存在不确定性和波动性，这种复杂的系统难以研究。因此， 体外 利用由已知脂质种类和纯化蛋白组成的合成膜，已成为表征蛋白质与弯曲膜之间关系的有力重构系统。传统上，通过挤出法制备不同直径的脂质体，以检测对膜曲率敏感的蛋白质。 通过 使用离心力的共沉淀实验或利用密度梯度的共漂浮实验，以避免蛋白质聚集8,9然而，挤出的脂质体曲率受到挤出器中所用膜滤器孔径大小的限制10单个脂质体曲率（SLiC）检测已被证实可克服这一局限，该方法通过荧光标记不同直径的脂质体并将其固定于表面，从而通过荧光强度标记曲率11然而，在小囊泡中观察到脂质组成存在显著变异，这会影响曲率测量的准确性12拖曳实验通过光镊从巨大单层囊泡（GUVs）中拉出瞬态膜管，能够更准确地测量膜管曲率，其中曲率可通过膜张力精确控制13,14该方法适用于研究感知正曲率或负曲率的蛋白质，但受限于纳米管生成的通量。10支持性膜管（SMrT）检测可利用微流控流动，从同一脂质储库中同时生成多根膜管。然而，膜曲率在纳米管轴向上具有内在的不均匀性，这会降低基于荧光强度的曲率测量的准确性15,16。相比之下，使用小单层囊泡（SUVs，直径 &#60;100 nm17在具有通过纳米加工或纳米材料精确设计的形貌的表面上形成支撑脂双层（SLB），可高精度地生成由预定曲率控制的单层脂双层膜18,19,20.
本文介绍了一种在具有纳米条阵列结构的制备型纳米芯片表面形成支持性脂双层（SLB）的实验方案，并阐述了如何利用该系统研究蛋白质对膜曲率的敏感性。 体外如图所示 图1，该实验包含六个基本组分：A）清洗芯片并装配带有微流控腔室的芯片；B）SUVs的制备&#160;具有明确脂质组成的SLB；C）在纳米芯片上形成SLB并与曲率敏感蛋白结合；D）通过荧光显微镜对SLB及曲率敏感蛋白进行成像与表征；E）清洗芯片以供重复使用；F）图像处理以定量分析蛋白的曲率感知能力。详细实验步骤如下所述。

<table><tbody><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Diamond</td><td>RN0879999FU</td><td></td></tr><tr><td>棕色小瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27115-U</td><td></td></tr><tr><td>脑源性磷脂酰丝氨酸：L-&amp;alpha;-磷脂酰丝氨酸（脑组织，猪源）（钠盐）</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>840032</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 烧杯</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211060804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 烧杯</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211061706</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 烧杯</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211065408</td><td>第二个容器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800117</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Watsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18:1 DGS-NTA(Ni)：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]（镍盐）</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>蛋源性磷脂酰胆碱：L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱（蛋黄，鸡源）</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>840051</td><td></td></tr><tr><td>F-BAR</td><td>新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台</td><td></td><td>蛋白质与多肽</td></tr><tr><td>F-BAR+IDR</td><td>新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台</td><td></td><td>蛋白质与多肽</td></tr><tr><td>GFP</td><td>新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台</td><td></td><td>蛋白质与多肽</td></tr><tr><td>GFP-His</td><td>新加坡南洋理工大学生物科学学院蛋白质生产平台</td><td></td><td>蛋白质与多肽</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>V9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30%（ACS认证）</td><td>Thermo Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>人源FBP17的IDR片段</td><td>上海桑谷生物医药有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>1.50d</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>LSM 800 配备 Airyscan</td><td>100倍（数值孔径1.4）油镜</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher scientific</td><td>10010240</td><td></td></tr><tr><td>微型挤出器&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 亲水性膜，0.1 &amp;mu;m</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）交联剂</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>HARRICK PLASMA</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>石英纳米芯片</td><td>东海县阿尔法石英制品有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red DHPE：Texas Red 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺，三乙基铵盐</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Gooi</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Elma</td><td>D-78224</td><td></td></tr><tr><td>Voterx</td><td>Scientific Industries</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>NUCERITE</td><td>5312</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Julabo</td><td>TW8</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究膜曲率感应蛋白的纳米棒支撑脂双层系统 体外

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

膜曲率发挥着重要作用&#160;在细胞的多种基本过程中，如细胞迁移、细胞分裂和囊泡运输中发挥重要作用。它不仅由细胞活动被动产生，还能主动调控蛋白质相互作用，并参与多种细胞内信号传导。因此，研究膜曲率在调控蛋白质与脂质分布及动态行为中的作用具有重要意义。近年来，已发展出多种技术用于研究弯曲膜与蛋白质之间的关系 体外与传统技术相比，新开发的纳米条支撑脂质双层（SLB）通过在具有预定义膜曲率和局部平坦对照的纳米条图案化阵列上形成连续的脂质双层，实现了高通量和更精确的膜曲率生成。利用荧光显微成像，可对脂质流动性及蛋白质对曲率膜的敏感性进行定量表征。本文详细介绍了在含有纳米条阵列的制备玻璃表面形成SLB的具体操作步骤。&#160;并介绍了在该类支持性脂双层（SLB）上曲率敏感蛋白的表征方法。此外，还涵盖了纳米芯片重复使用及图像处理的实验方案。除纳米条形SLB外，本方案可直接适用于各类用于曲率感知研究的纳米结构化玻璃芯片。

建议使用纳米棒结构来研究感知正曲率的蛋白质，该结构两端各包含一个半圆形，其曲率由纳米棒的宽度定义，并在中心局部设有一个平坦/零曲率的对照区域（图2A，B）。在纳米棒上成功形成支持性脂双层（SLB）后，脂质标记信号在整个纳米棒表面均匀分布，如图2C所示。通过平均多个单独纳米棒的图像，可将多个纳米棒的信号合并（图2D），从而最小化不同纳米棒之间的随机差异。此前的一项电子显微镜研究表明，细胞质膜能够完全贴合地包裹整个纳米结构24。因此，合成脂双层也被认为能紧密附着于纳米结构表面，这在200 nm纳米棒上形成了衍射极限宽度的线条，如图4E所示。此外，纳米棒曲面SLB上的膜流动性还可通过荧光漂白恢复（FRAP）实验进行表征，其中单个纳米棒上的荧光信号可被单独漂白，以实现对膜流动性的分析（<stro...

在此，开发了一种基于纳米棒支撑的脂质双层系统，以构建具有确定曲率的合成膜，从而实现对具有曲率感知能力的蛋白质进行表征 体外.

膜曲率在细胞的多种基本过程中发挥着重要作用，例如细胞迁移、细胞分裂和囊泡运输。它……

这种纳米柱支撑的脂双层系统可用于研究膜曲率在细胞活动过程中调控蛋白质和脂质动态分布中的作用。该技术通过在具有预定义膜曲率的专利纳米柱阵列上形成连续的脂双层，实现了对膜曲率的高亚微米级精度和良好的控制。首先，将纳米芯片放入一个10毫升的烧杯中，使图案面朝上。小心地向烧杯中加入一毫升98%硫酸，确保酸液完全覆盖芯片的正面和背面。缓慢旋转烧杯，并逐滴加入200微升30%过氧化氢，直至整个烧杯变热。确保硫酸和过氧化氢充分混合，形成Piranha溶液，以去除纳米芯片上的有机分子。将烧杯放入一个次级玻璃容器中，使纳米芯片在 Piranha 溶液中浸泡过夜，以彻底清除杂质。取出烧杯，小心地用移液器将 Piranha 溶液转移至酸性废液容器中。向烧杯中加入 5 毫升去离子水以稀释残留的酸液，随后将其弃入酸性废液容器。重复此步骤五次。用镊子夹住芯片，并用去离子水持续冲洗，以彻底去除残留酸。用99.9%氮气吹干芯片，以形成SLB。将脂质混合物超声处理30分钟。在液氮中冷冻脂质混合物20秒，然后在42摄氏度水浴中解冻2分钟。重复冻融循环30次。随后，脂质混合物呈现为澄清的液体。将脂质混合物通过微型挤出器，来回挤出20次。从另一侧的注射器中收集小单层囊泡（SUVs），以减少较大颗粒或外来物质的污染，并将其转移至1.5毫升离心管中。用镊子小心地将清洗后的纳米芯片从去离子水中取出，并用纯度为99.9%的氮气吹干。对纳米芯片进行一小时的空气等离子体处理以完成表面清洁。将纳米芯片组装至PDMS腔室中。首先将芯片放置在清洁的表面上，图案面朝上。用中间的PDMS轻轻覆盖芯片，并确保整个图案暴露在中间PDMS中央大椭圆形开口的中央区域。再将顶部PDMS覆盖在中间PDMS上，并使其两个小孔位于中间PDMS大椭圆孔的范围内。然后组装PDMS腔室。用移液枪从顶部PDMS的两个小孔之一将SUV加入PDMS通道中，并在室温下孵育15分钟以形成SLB。从一侧小孔轻轻加入PBS缓冲液至PDMS通道中，同时用棉签从另一侧小孔吸除废液，以洗去未结合的SUV。然后获取在纳米芯片上形成的SLB。使用100倍油镜设置激光扫描共聚焦显微镜。打开Zen软件，选择能够激发脂质和蛋白质荧光的激发激光功率。选择采集模式，然后依次点击智能设置（Smart Setup）和德克萨斯红（Texas Red）。使用调焦旋钮调节焦距，找到芯片上的纳米条，直至在脂质通道下纳米条边缘清晰可见。在添加蛋白质之前，设置扫描参数以获取脂质通道的对照图像。通过在随机的单个纳米条区域对荧光标记的脂双层进行漂白来开展荧光漂白恢复（FRAP）实验。选中“实验区域”和“漂白”复选框。绘制一个直径为五微米的圆形区域，确保整个纳米棒位于中心，并将其添加至实验区域。输入延时成像参数，选择时间序列。然后点击持续时间。选择 100 个循环，间隔为两秒。输入漂白参数。选择执行FRAP的激光复选框，并将功率调整为100%。点击“开始实验”以启动FRAP实验。将蛋白质溶液加载到PDMS通道中，并在室温下孵育五分钟，使蛋白质与SLB结合。重新对焦纳米条，并设置扫描参数，以同时获取脂质和蛋白质通道的图像，用于检测蛋白质的曲率感应。选择实验区域，并在脂质和蛋白质通道上进行荧光漂白后恢复（FRAP）实验，同时进行时间序列成像以表征曲率感应蛋白的流动性。两者均显示在宽度为300纳米、涂覆有支持性脂双层（SLB）的单个纳米条带末端富集增加。此处SLB含有10%磷脂酰丝氨酸（PS），以通过静电作用增强蛋白质结合。这三种蛋白质的末端与中心比值均高于脂质，脂质的该比值约为一。在比较IDR FBP17与F-Bar时，IDR FBP17更高的末端与中心比值表明其曲率感知能力强于F-Bar。当曲率直径降至400纳米以下时，所有三种蛋白质均优先富集于纳米棒末端的弯曲膜区域。在这三个蛋白质结构域中，IDR FBP17 产生的纳米棒信号强度和密度最高，表明其具有最强的曲率感应能力，而 F-Bar 结构域的值最低。通过逐步增加蛋白质浓度可绘制出蛋白质结合曲线，结果显示 IDR FBP17 具有强烈的协同性曲率感应能力。与纳米棒上脂质信号的快速恢复相比，F-Bar 在两分钟内无法恢复，表明其在弯曲膜位点的膜流动性及结合动态性显著降低。令人意外的是，与F-Bar的行为不同，IDR FBP17信号在同一时间段内表现出明显的恢复，表明IDR FBP17在弯曲膜上聚集具有动态特性。然而，在洗去溶液中未结合的IDR FBP17后，IDR FBP17通道中的相同恢复现象不再如先前观察到的那样出现。在研究弯曲膜与蛋白质相互作用时，SLB的质量至关重要。因此，在本实验中，FRAP 实验对于验证膜流动性是必要的。该系统将帮助研究人员研究各种影响蛋白质与弯曲膜相互作用的参数，例如曲率感应结构域、脂质组成，以及开展关于弯曲膜的动态研究，如相分离行为。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

纳米巴支持的脂质双层系统，用于体外研究膜曲率传感蛋白

膜蛋白的功能受细胞膜脂质组成调控。本文视频详细介绍了如何使用双层膜片电极形成膜片，以及如何利用短杆菌肽通道作为报告系统来检测膜性质的改变。...

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许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。...

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

细胞中有许多蛋白质能够感知并诱导膜曲率。本文介绍一种从脂质囊泡中拉取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质或任何具有曲率活性的分子与弯曲膜之间的相互作用 体外.

从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

我们提供一种实验方案 体外 在开放腔室中进行支撑脂双层上 MinD 和 MinE 的自组织实验。此外，我们还描述了如何将实验体系封闭于脂质包被的 PDMS 微区室中以模拟 体内...

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一种基于定量荧光显微镜的单个脂质体检测方法用于分析单个脂质体之间的组分不均一性

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

Septins 是细胞骨架蛋白。它们可与脂质膜相互作用，并能够在微米尺度上感知甚至产生膜曲率。本实验方案中，我们描述了自下而上的体外（in vitro）方法，用于分析膜形变、对曲率敏感的 septin 结合行为以及 septin...

自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

无细胞重建是研究细胞骨架组装的关键工具，过去十年的研究已建立了在简化系统中研究 septin 动态的方法。本文介绍了三种互补的方法，用于在不同膜环境中观察 septin...

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利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

了解纳米棒支撑脂质双层系统用于体外研究膜曲率传感蛋白的方法。该技术通过高分辨率纳米制造技术实现精确曲率控制，帮助研究人员深入探索蛋白质与弯曲膜相互作用的动态机制。

一种用于研究膜曲率感应蛋白的纳米棒支撑脂双层系统体外

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