Een pijplijn om structurele hartafwijkingen in de foetale muis te karakteriseren

Dit protocol schetst geavanceerde methoden voor het genereren van hoge resolutie beeldvormingsgegevens voor het diagnosticeren van aangeboren hartafwijkingen. We voeren functionele beoordelingen uit met niet-invasieve foetale echocardiografie in combinatie met obductie gevolgd door episcopale confocale microscopie histopathologie om seriële 2D-beeldstapels en 3D-reconstructies te genereren voor uitgebreide CHD-diagnose. Deze methode kan de gedetailleerde anatomische veranderingen ophelderen, niet alleen bij aangeboren hartaandoeningen, maar kan ook worden gebruikt om structurele geboorteafwijkingen in andere organen te onderzoeken, waaronder schedelgezichtsdefecten, ledemaat- en skeletafwijkingen, evenals defecten van de hersenen en andere viscerale organen.

Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang en Benjamin Glennon, allen onderzoekers van ons laboratorium, demonstreren deze procedures. Nadat u de muis hebt voorbereid op de procedure, warmt u de ultrasone gel op tot een lichaamstemperatuur en brengt u deze royaal aan op het beeldvormingsgebied. Plaats vervolgens de transducer op de buik georiënteerd in een horizontaal vlak en identificeer de blaas op het scherm.

Zodra de blaas is geïdentificeerd, scant u craniaal van de blaas, zoekt u naar de foetus en bepaalt u de zwangerschapsduur door de kroon tot de romplengte te meten. Gebruik vervolgens de kleur doppler om de bloedstroom uit het hart te analyseren. Om fixatieve penetratie in de inwendige organen mogelijk te maken, maakt u incisies in de laterale thorax en buik met behulp van een tang of een ontleedschaar en laat u het monster gedurende ten minste 24 uur in een koude kamer fixeren.

Stel vervolgens de software in om de afbeeldingen met een naam op te slaan, inclusief de identificatie van het monster, de microscoopvergroting en de inhoud van de afbeelding. Speld het monster door zijn polsen en enkels. Voordat u de huid langs de mediane as naar de staart snijdt, tilt u de huid in het midden van de nek op met behulp van een tang en snijdt u de huid naar beide oksels met de schaar.

Snijd vervolgens de huid van de navel naar de benen. Nadat u de monsters hebt ingesloten, past u de laserprojectiepositie aan in het midden van het monster op het scherm en stelt u de zoomknop in op 20x. Om de resolutie te optimaliseren, stelt u de versterking in op 1, 250V.

Maximaliseer het blauwe gebied met behulp van de scherpstelknop en stel de versterking vervolgens in op ongeveer 750 V voor beeldvorming. Schakel vervolgens de snijmethode over naar automatisch. Stel de dikte in op ongeveer 50 micrometer en laat de dia’s lopen.

Stop met snijden wanneer de longen en luchtwegen in zicht zijn. Kies een snijdikte tussen acht en 10 micrometer en stop de live view open. Open Microtome Communicator om de beeldvorming te starten.

Zorg ervoor dat de tijdelijke opslagmap leeg is voordat u afbeeldingen verzamelt. Stop de beeldverzameling wanneer er geen harde structuur zichtbaar is. Voer de tijdelijk opgeslagen bestanden uit in één TIFF-afbeeldingsreeks.

Voor 3D-beeldreconstructie sleept u de afbeeldingsbestanden naar de beeldverwerkingssoftware. Zodra het pop-upvenster verschijnt, selecteert u de koppelingen of de bestanden die u naar de database wilt kopiëren. Zodra het bestand is geopend, klikt u op het menu 2D 3D-reconstructietools op de werkbalk en selecteert u 3D MPR.

Voor pixel X-resolutie en pixel Y-resolutie voert u de afbeeldingsresolutie in door de zoom te geven die wordt gebruikt tijdens ECM-beeldvorming. Voer voor het segmentinterval de segmentdikte in die wordt gebruikt om te snijden tijdens ECM-beeldvorming. Gebruik vervolgens het hulpprogramma WWWL om de vensterbreedte en het vensterniveau aan te passen.

Klik en sleep het gereedschap op de afbeelding omhoog om de helderheid van de afbeelding te verlagen en naar beneden om het te verhogen. Klik en sleep het gereedschap op de afbeelding naar rechts om het afbeeldingscontrast te verlagen en het linkerwoord om het te vergroten. Sleep de afbeeldingen naar de gewenste posities met het gereedschap Pannen.

Gebruik het gereedschap Zoomen om de afbeelding te vergroten of te verkleinen en het gereedschap Roteren om de afbeelding naar wens te roteren. Klik nu op de gekleurde as van het eerste paneel en sleep deze. Merk op hoe het draaien van deze as de oriëntatie van de andere twee panelen verandert.

Draai de drie panelen assen totdat de drie panelen coronale, sagittale en dwarse weergaven van het monster vertegenwoordigen. Zodra alle drie de panelen op de juiste manier zijn geplaatst, georiënteerd en verhelderd, klikt u op het paneel dat de coronale weergave vertegenwoordigt. Klik vervolgens op Filmexport aan de rechterkant van de menubalk.

Klik op batch en sleep de schuifregelaars van en naar om de hele interesseregio te omvatten. Selecteer voor interval de optie hetzelfde als dikte en sla de video op die de weergaverichting aangeeft. De echo toont een intact ventrikelseptum zonder intraventriculaire shunt en normaal gerelateerde grote slagaders in de normale controle, wat werd bevestigd door ECM.

Het frontale zicht toont communicatie tussen LA, RA, LV en RV in zowel echo als ECM, wat wijst op atrioventriculaire septumdefect. De kleurenstroom demonstreert de stroom over LV en RV die ventrikelseptumdefect aangeeft. Echo en ECM toonden een dubbele uitlaat van de rechter ventrikel met een ventrikelseptumdefect tussen LV en RV met naast elkaar grote slagaders.

Echografie diagnose van persisterende truncus arteriosus toont communicatie tussen LV en RV met een enkel uitstroomkanaal dat beide ventrikels overschrijft, ook bevestigd door ECM in het E14.5-stadium. De secties verzameld uit ECM-histologie kunnen verder worden verwerkt voor immunostaining, hematoxyline- en eosinekleuring en zelfs nucleïnezuurextractie voor genotypering en transcriptionele profilering of eiwitextractie voor proteomische analyse. De beelden van driedimensionale reconstructie kunnen verder worden verwerkt voor beoordelingen van kwantitatieve perimeters zoals oppervlakte of volume.

Nauwkeurige fenotypering om defecten in de cardiovasculaire anatomie te identificeren is essentieel voor het vaststellen van genetisch gemanipuleerde en gemuteerde muismodellen van aangeboren hartaandoeningen om de pathhomemechanismen van aangeboren hartaandoeningen op te helderen. Dit kan leiden tot potentiële kansen die therapieën en interventies ontwikkelen om de klinische uitkomst bij patiënten met aangeboren hartaandoeningen te verbeteren.