Name: 人类多能干细胞分化为产生胰岛素的胰岛簇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习利用静态悬浮培养技术将胰腺祖细胞分化为分泌胰岛素的胰岛样细胞簇，该方法可减少细胞应激并显著提高分化成功率，为基础研究人员提供可靠的糖尿病治疗研究方案。

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我们衷心感谢 STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、干细胞网络（Stem Cell Network）、JDRF 以及加拿大卫生研究院（Canadian Institutes of Health Research）提供的支持。Jia Zhao 和 Shenghui Liang 是 Michael Smith Health Research BC 培训生奖的获得者。Mitchell J.S. Braam 是 Mitacs Accelerate 博士后奖学金的获得者。Diepiriye G. Iworima 是亚历山大·格拉汉姆·贝尔加拿大研究生奖学金以及加拿大大学妇女联合会 1989 年纪念埃科尔理工学院奖（CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award）的获得者。我们诚挚感谢来自 MCRI 及莫纳什大学（Monash University）的 Edouard G. Stanley 博士提供 Mel1 INS GFP/W 细胞系，以及阿尔伯塔糖尿病研究所胰岛核心实验室（Alberta Diabetes Institute Islet Core）在人胰岛的分离与分发方面提供的支持。我们同时感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所成像与流式细胞术平台（Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry facilities at the University of British Columbia）提供的技术支持。图 1 使用 BioRender.com 制作。

本方案基于在无饲养层条件下对人多能干细胞（hPSC）系（包括H1、HUES4 PDXeG和Mel1 INSGFP/W）的研究。本节详细描述了具体操作步骤，并在代表性结果部分提供了Mel1 INSGFP/W分化的支持性数据。我们建议，当使用本文未提及的其他人多能干细胞系时，可能需要进一步优化条件。有关本方案中使用的所有试剂和溶液的详细信息，请参见材料表。
1. 分化培养基与溶液的制备
注意：所有待配制的溶液见表1，分化培养基见表2。
<ol>
	<li>在无菌生物安全柜中准备所有细胞培养用培养基和试剂。使用前，将与细胞培养相关的溶液和基础培养基在水浴中短暂预热至 37 °C。 
	&#8203;注意：如下所述，每天新鲜配制分化培养基，加入添加剂后当日使用。或者，根据生产商说明书，胰腺前体细胞试剂盒也支持预先配制较大体积的培养基，可在数天内分次使用。两种培养基配制方法均有效。请注意，不建议将培养基长时间置于水浴中。若每日新鲜配制培养基，建议将添加剂分装保存，以避免反复冻融。</li>
</ol>
2. 将人多能干细胞分化为胰腺前体细胞
<ol>
	<li>将未分化的hPSCs在Matrigel包被的培养容器中，使用mTeSR1完全培养基进行培养，并每日更换培养基。在维持培养期间，当细胞汇合度达到约70%时，每3-4天使用细胞解离试剂按照制造商说明书进行传代。为启动分化，将细胞解离为单细胞，并接种至6孔或12孔组织培养处理板（每孔培养基体积分别为2 mL或1 mL）。 
	注：有关内胚层基础培养基及其分装保存的说明，请参见表1。</li>
	<li>使用hESC认证的Matrigel（按制造商说明书推荐，用预冷的DMEM/F12稀释）预包被培养孔，并将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>将Matrigel包被的培养板转移至室温（需在3小时内使用）。</li>
	<li>吸除hPSC培养物中的废弃培养基，用DPBS冲洗一次。在37 °C下使用细胞解离酶将hPSC培养物解离为单细胞，持续3-5分钟。加入预温的DMEM/F12培养基冲洗细胞，转移至15 mL或50 mL锥形管中，以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>用干细胞完全培养基重悬细胞沉淀，并添加10 µM Y-27632，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行活细胞（台盼蓝阴性）计数。吸除稀释的Matrigel，立即将活细胞以1.60–1.80 × 105/cm2的密度接种至Matrigel包被的培养孔中，于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养24小时。随后进入第1阶段。 
	注：此接种密度可使起始汇合度约为95%。根据制造商说明书，推荐接种密度为2.6 × 105/cm2。建议测试不同接种密度以确定特定细胞系的最佳值，并检测细胞活力。若细胞活力低于80%，则不应继续进行分化。细胞活力低下可能由收获过程中消化过度、吹打过度，或接种前细胞在DMEM/F12培养基中放置时间过长所致。</li>
	<li>在第1阶段第1天，将内胚层基础培养基在37 °C水浴中短暂预热，并解冻补充剂MR和CJ。通过将补充剂MR和CJ加入内胚层基础培养基中配制第1A阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>吸除各孔中的废弃培养基，加入第1A阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。 
	&#8203;注：无需洗涤步骤。在更换培养基前，轻轻摇动培养板以去除未贴壁的细胞。更换培养基时，避免移液枪头接触孔底，且添加培养基时动作应轻柔，以防止破坏单层细胞结构。</li>
	<li>在第1阶段第2天，将内胚层基础培养基在37 °C水浴中短暂预热，并解冻补充剂CJ。通过将补充剂CJ加入内胚层基础培养基中配制第1B阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>吸除各孔中的废弃培养基，加入第1B阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>在第1阶段第3天，重复步骤2.8–2.9。随后进入第2阶段。</li>
	<li>在第2阶段第1天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂2A和2B。通过将补充剂2A和2B加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第2A阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>吸除各孔中的废弃培养基，加入第2A阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>在第2阶段第2天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂2B。通过将补充剂2B加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第2B阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>吸除各孔中的废弃培养基，加入第2B阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>在第2阶段第3天，重复步骤2.13–2.14。随后进入第3阶段。</li>
	<li>在第3阶段第1天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂3。通过将补充剂3加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第3阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>吸除各孔中的废弃培养基，加入第3阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>在第3阶段第2天和第3天，重复步骤2.16–2.17。随后进入第4阶段。</li>
	<li>在第4阶段第1天，将胰腺第2–4阶段基础培养基在37 °C水浴中预热，并解冻补充剂4。通过将补充剂4加入胰腺第2–4阶段基础培养基中配制第4阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>吸除各孔中的废弃培养基，加入第4阶段培养基，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>在第4阶段第2天至第4天，重复步骤2.19–2.20。随后进入聚集体形成步骤。</li>
</ol>
3. 使用直径为 400 µm 的微孔板将细胞聚集成胰腺前体细胞簇
<ol>
	<li>在第4阶段第5天，用500 µL抗黏附冲洗液预处理每个微孔（例如24孔板格式）。</li>
	<li>准备一个配平板，将微孔板在1,300 × g 条件下离心5分钟。 
	注意：在显微镜下检查微孔板，确保微孔中无残留气泡。若仍有气泡滞留在微孔中，需再次离心5分钟。</li>
	<li>吸除各孔中的抗黏附冲洗液，用1 mL DPBS冲洗一次。吸除DPBS后，向每孔加入1 mL聚集培养基。</li>
	<li>移除胰腺前体细胞培养物中的用过的培养基，用DPBS洗涤一次。使用解离试剂在37 °C条件下将细胞解离为单细胞，持续10–12分钟。用预热的DMEM/F12将细胞冲洗下来，转移至离心管中，在300 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>用聚集培养基重悬细胞沉淀，并进行活细胞计数。每孔接种总计240万至360万个细胞（即每微孔2,000–3,000个细胞），并向每孔添加聚集培养基至终体积为2 mL。</li>
	<li>使用P1000移液器枪头轻柔地将细胞上下吹打数次，以确保细胞在孔内均匀分布。操作过程中避免在微孔中引入气泡。将微孔板在300 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉降至微孔中。将微孔板置于37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中培养24小时以形成聚集体，随后进入第5–7阶段的分化。 
	&#8203;注意：在聚集体形成期间应避免扰动微孔板。为获得最佳聚集体形成效果，可能需要长达48小时的培养时间。</li>
</ol>
4. 将试剂盒来源的胰腺前体细胞簇分化为人多能干细胞来源的胰岛
<ol>
	<li>在第5阶段第1天，将第5-7阶段基础培养基置于37 °C水浴中预热，并解冻添加剂（见表1和表2）。通过向第5-7阶段基础培养基中添加添加剂（达到最终工作浓度）来配制第5阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>在细胞聚集体形成后，使用P1000移液器枪头轻轻反复吹打聚集体数次，使未聚集的细胞悬浮。让聚集体依靠重力自然沉降（静置约1分钟）。尽可能小心地吸除上清废液（含有悬浮的未聚集细胞），避免吸走聚集体。</li>
	<li>用力将新鲜的第5阶段培养基加入微孔板表面，以使聚集体从微孔中脱离。将聚集体转移至超低吸附（ULA）6孔板中。用第5阶段培养基冲洗一次，以完全回收微孔中的所有聚集体。</li>
	<li>收集ULA 6孔板中的全部聚集体，用第5阶段培养基重悬，并调整密度至每100 µL含20个聚集体（例如，预计每个孔可回收约1,200个聚集体；将1,200个聚集体重悬于6 mL第5阶段培养基中）。使用多通道移液器向ULA平底96孔板的每个孔中加入50 µL第5阶段培养基。向四角和边缘孔中加入200 µL DPBS。 
	注意：避免在边缘孔中培养聚集体，因其更易发生蒸发；否则，应使用专为减少边缘蒸发设计的96孔板（例如带内置护沟的96孔板），或将培养板置于高湿度微环境细胞培养孵育箱中。</li>
	<li>向ULA平底96孔板的每孔中加入100 µL聚集体重悬液，使每孔总体积为150 µL，平均含20个聚集体。 
	注意：每次向96孔板加样前，均需轻轻混匀聚集体重悬液。</li>
	<li>将培养板置于水平台面上，放入加湿的37 °C、5% CO2孵育箱中培养24小时。</li>
	<li>在第5阶段第2天，按照步骤4.1的方法配制第5阶段培养基。</li>
	<li>使用多通道移液器从每孔中移除约90 µL废培养基，并更换为100 µL第5阶段培养基。</li>
	<li>在第5阶段第3天，重复步骤4.7–4.8。随后进入第6阶段。</li>
	<li>在第6阶段第1天，将第5-7阶段基础培养基置于37 °C水浴中预热，并解冻添加剂（见表1和表2）。通过向第5-7阶段基础培养基中添加添加剂（达到最终工作浓度）来配制第6阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>使用多通道移液器从每孔中移除约90 µL废培养基，并更换为100 µL第6阶段培养基。</li>
	<li>在第6阶段第2天至第8天，重复步骤4.10–4.11。随后进入第7阶段。</li>
	<li>在第7阶段第1天，将第5-7阶段基础培养基置于37 °C水浴中预热，并解冻添加剂（见表1和表2）。通过向第5-7阶段基础培养基中添加添加剂（达到最终工作浓度）来配制第7阶段培养基。充分混匀后立即使用。</li>
	<li>使用多通道移液器从每孔中移除约90 µL废培养基，并更换为100 µL第7阶段培养基。</li>
	<li>在第7阶段第2天至第12天，重复步骤4.13–4.14。随后进行体外表征分析。</li>
</ol>
5. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>移除培养基，并用DPBS洗涤一次。使用解离试剂在37 °C孵育10–12分钟，将培养物（平面型前体细胞或分化中的细胞簇）解离为单细胞。用FACS缓冲液冲洗后，在300 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中并进行细胞计数。在300 × g离心5分钟。将单细胞重悬于500 µL固定/破膜缓冲液中，在室温孵育10分钟。 
	注意：使用前将固定/破膜缓冲液恢复至室温。该缓冲液含有甲醛（PFA），请在通风橱中小心操作，并根据机构规定妥善处理。</li>
	<li>在500 × g离心3分钟，用500 µL 1×破膜/洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于300 µL 1×破膜/洗涤缓冲液中。将100 µL单细胞悬液（每份含2.5–3 × 105个细胞）分别转移至三个微量离心管中，用于未染色对照、同型对照和抗体染色（抗体样本及稀释信息见材料表）。室温孵育45分钟，并用铝箔包裹避光。</li>
	<li>在500 × g离心3分钟，用500 µL 1×破膜/洗涤缓冲液洗涤两次。将样品重悬于100 µL FACS缓冲液中，并使用流式细胞仪及配套软件（例如FlowJo）分析染色细胞（特定阶段标志物的胞内染色信息见材料表）。 
	&#8203;注意：若样品不能立即检测，请避光保存于4°C。门控策略如下：首先根据散射特性（FSC-A和SSC-A）设门以去除细胞碎片，再结合FSC-A与FSC-宽度参数识别单细胞群体。阳性与阴性门控的设定依据干细胞对照和/或未染色对照、同型对照来确定。</li>
</ol>
6. 全胚胎免疫染色
<ol>
	<li>在微量离心管中收集细胞簇，静置使其自然沉降。吸除废液，并用 1 mL 磷酸盐缓冲液（含钙和镁）清洗一次。加入 1 mL 4% 多聚甲醛，在 4°C 下固定过夜。</li>
	<li>用 PBST 清洗一次，将 20–30 个细胞簇置于含 0.3% TritonX-100 的 500 µL 溶液中，在室温下于倾斜摇床（倾斜角度适宜）孵育至少 6 小时进行通透处理。 
	注：对于较大的细胞簇，可能需要更长的通透时间（最长可达 24 小时）。</li>
	<li>将细胞簇在 100 µL 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时（置于倾斜摇床上）。移除封闭液后，加入 100 µL 用抗体稀释缓冲液稀释的一抗溶液，在室温下于倾斜摇床上孵育过夜。 
	注：若成像时背景较强，建议在 4 °C 下孵育一抗。</li>
	<li>在倾斜摇床上用 500 µL PBST 彻底清洗 3 次，每次 30 分钟（倾斜角度设为 8，转速设为 20）。</li>
	<li>加入 100 µL 用抗体稀释缓冲液稀释的二抗溶液，在室温下于倾斜摇床上孵育过夜。用铝箔包裹离心管，避光操作。 
	注：若成像时背景较强，建议在 4 °C 下孵育二抗。</li>
	<li>用 500 µL PBST 清洗一次，加入 100 µL DAPI 染色液（DAPI 浓度为 10 µg/mL，溶于 PBST），室温避光染色 10–15 分钟。用铝箔包裹，防止光照。</li>
	<li>在倾斜摇床上用 500 µL PBST 彻底清洗 3 次，每次 30 分钟。清洗过程中需用铝箔包裹离心管，避光操作。</li>
	<li>按照制造商说明书及已发表的实验方案20,21，将细胞簇固定于预先涂有组织粘附剂的成像腔室载玻片（见材料表）上。</li>
	<li>使用组织透明介质（含 80% 甘油的 PBS 溶液）封片，并加盖盖玻片。避光保存，直至进行共聚焦显微成像。 
	&#8203;注：若样品不能立即成像，请避光保存于 4 °C 环境中。</li>
</ol>
7. 静态GSIS检测
<ol>
	<li>将低葡萄糖克雷布斯-林格碳酸氢盐（3.3G KRB）缓冲液、高葡萄糖（16.7G）KRB缓冲液以及30 mM KCl KRB缓冲液在37 °C水浴中预热。</li>
	<li>手工挑选大小一致的胰岛细胞团簇，用2 mL预热的3.3G KRB缓冲液冲洗。将细胞团簇转移至未经组织培养处理的6孔板中，每孔加入2 mL预热的3.3G KRB缓冲液，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中平衡孵育1小时。</li>
	<li>平衡完成后，在检测室（见材料表）中加入100 µL预热的3.3G KRB缓冲液。手工挑选5个细胞团簇并转移至检测室中央，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育30分钟。 
	注意：转移细胞团簇时应使用10 µL枪头，尽量减少携带的液体体积。</li>
	<li>小心收集约100 µL上清液，于-30 °C保存，用于后续基础胰岛素分泌量的测定（见步骤7.9）。此步骤中不得使细胞团簇干燥或丢失。立即向检测室中加入100 µL预热的16.7G KRB缓冲液，并将同一组细胞团簇在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续孵育30分钟。</li>
	<li>小心收集约100 µL上清液，于-30 °C保存，用于后续葡萄糖刺激的胰岛素分泌量测定（见步骤7.9）。立即向检测室中加入100 µL预热的30 mM KCl KRB缓冲液，并将同一组细胞团簇在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续孵育30分钟。</li>
	<li>小心收集约100 µL上清液，于-30 °C保存，用于后续KCl刺激的胰岛素分泌量测定（见步骤7.9）。立即向检测室中加入100 µL RIPA裂解缓冲液，并将含有全部5个细胞团簇的裂解液转移至微量离心管中。</li>
	<li>（可选）使用P200移液枪头剧烈吹打，手动破碎细胞团簇。涡旋振荡30秒，冰上孵育30分钟，再进行30秒涡旋振荡。 
	注意：通过充分涡旋及足够的冰上孵育时间，确保细胞完全裂解。</li>
	<li>以8,000 × g离心1分钟。收集上清液，于-30 °C保存，用于后续总胰岛素含量的测定（见步骤7.9）。</li>
	<li>根据试剂盒制造商说明书及已发表的实验方案20,22，使用人胰岛素ELISA试剂盒检测上清液样品中的人胰岛素含量。 
	注意：避免上清液样品反复冻融。经历超过三次冻融循环的样品不应再用于检测。</li>
</ol>

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<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+insulin-secreting+islet+clusters+in+a+multiwell-based+static+3D+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system.</a> Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+beta-cell+function+reveals+glucose-mediated+heterogeneity+of+beta-cell+functional+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development.</a> Elife. 8, e41540(2019).</li>
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<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+enhances+calcium+transients+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta-cells+by+activating+phospholipase+C+signal+pathway+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
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<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules.</a> Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Mamidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosignalling+via+integrins+directs+fate+decisions+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors.</a> Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
</ol>

Timothy J. Kieffer 在撰写本文期间是 ViaCyte 的员工。其他作者声明无竞争利益。

本文描述了一种七阶段杂交方案，可在培养40天内生成能够在葡萄糖刺激下分泌胰岛素的人多能干细胞胰岛 体外在这些多个步骤中，高效诱导定型内胚层被认为对最终的分化结果具有重要的起始作用18,27,28. 根据制造商的操作说明，接种密度为 2.6 × 105/cm2 建议启动分化，细胞在第1阶段培养基中培养2天。为确保细胞在第1天达到接近汇合状态（90%-100%），我们强烈建议在使用新的hPSC细胞系时测试接种密度，因为最佳接种密度可能有所不同。例如，在我们实验室测试的三个hPSC细胞系中，接种密度为1.6-1.80 × 105/cm2，而不是 2.60 × 105/cm2，被确定为最佳接种密度。将第1阶段的培养时间从2天延长至3天，并在第1B阶段培养基中额外培养1天，可提高FOXA2的纯度+</su...

胰腺β细胞可响应血糖水平升高而分泌胰岛素。由于1型糖尿病（T1D）中β细胞遭受自身免疫破坏1，或2型糖尿病（T2D）中β细胞功能障碍2，导致胰岛素分泌不足的患者，通常需要外源性胰岛素治疗。尽管这种疗法可挽救生命，但其对血糖的调控远不如功能性β细胞动态分泌胰岛素那样精确。因此，患者常面临危及生命的低血糖事件，以及由长期高血糖波动引发的其他并发症。移植人尸体来源的胰岛可成功恢复T1D患者的严格血糖控制，但受限于胰岛供体的可获得性，以及难以纯化出适合移植的健康胰岛3,4。这一难题原则上可通过使用人多能干细胞（hPSCs）作为替代起始材料来解决。
由人多能干细胞生成分泌胰岛素的胰岛：当前策略 体外 通常旨在模拟胚胎胰腺发育过程 体内5,6这需要了解相关的信号通路，并在特定时间添加相应的可溶性因子，以模拟胚胎胰腺发育的关键阶段。胰腺发育程序始于定型内胚层的形成，该阶段以转录因子叉头盒A2（FOXA2）和Y染色体性别决定区蛋白17（SOX17）的表达为标志。7定型内胚层的连续分化涉及原始肠管的形成，并模式化为表达胰腺和十二指肠同源框1（PDX1）的后部前肠7,8,9以及上皮细胞向共同表达PDX1和NK6同源框1（NKX6.1）的胰腺前体细胞的扩展10,11.
内分泌胰岛细胞的进一步分化伴随着促内分泌主调控因子神经源素3（neurogenin-3, NGN3）的瞬时表达12，以及关键转录因子神经元分化1（neuronal differentiation 1, NEUROD1）和NK2同源框2（NK2 homeobox 2, NKX2.2）的稳定诱导13。随后，程序化生成主要的激素表达细胞，例如产生胰岛素的β细胞、产生胰高血糖素的α细胞、产生生长抑素的δ细胞以及产生胰多肽的PPY细胞。基于这些认识，以及大规模高通量药物筛选研究的发现，近年来的技术进展已能够生成含类似β细胞的人多能干细胞来源胰岛（hPSC-islets），这些细胞具备分泌胰岛素的能力14,15,16,17,18,19。
已有分步方案报道用于生成葡萄糖响应性β细胞6,14,18,19基于这些研究，本方案采用胰腺前体细胞试剂盒来生成PDX1+NKX6.1+ 平面培养中的人胰腺前体细胞，随后在微孔板中聚集成大小均一的细胞簇，并通过R-protocol在静态三维悬浮培养中进一步分化为可分泌胰岛素的人多能干细胞来源胰岛样细胞（hPSC-islets）。通过流式细胞术、免疫染色和功能评估等质量控制分析，对分化过程中的细胞进行严格表征。本文详细描述了定向分化的每一步操作，并概述了 体外 表征方法

<table><tbody><tr><td>3,3&amp;rsquo;,5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>甲状腺激素</td></tr><tr><td>4% PFA 溶液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>应在通风橱中操作</td></tr><tr><td>96孔超低吸附平底板</td><td>Corning Costar (VWR)</td><td>CLS3474</td><td>平底；用于最后三个阶段的静态悬浮培养</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>第4阶段细胞的解离试剂</td></tr><tr><td>Aggrewell400 板</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34415</td><td>直径为 400 &amp;micro;m 的微孔板</td></tr><tr><td>Aggrewell800 板</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>直径为 800 &amp;micro;m 的微孔板</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗人 FOXA2（山羊 IgG）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>IC2400G</td><td>流式细胞术中按 1:100 稀释；用于检测第1阶段细胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊 IgG 同型对照</td><td>R&amp;D Systems</td><td>IC108G</td><td>流式细胞术中按 1:100 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 小鼠抗人 SST（小鼠 IgG2B）</td><td>BD Sciences</td><td>566032</td><td>流式细胞术中按 1:250 稀释；用于检测第7阶段细胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 小鼠 IgG2B 同型对照</td><td>R&amp;D Systems</td><td>IC0041G</td><td>流式细胞术中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 小鼠抗人 C-肽（小鼠 IgG1&amp;kappa;）</td><td>BD Pharmingen</td><td>565831</td><td>流式细胞术中按 1:2,000 稀释；用于检测第7阶段细胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 小鼠抗人 INS（小鼠 IgG1&amp;kappa;）</td><td>BD Sciences</td><td>565689</td><td>流式细胞术中按 1:2,000 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 小鼠抗人 NKX6.1（小鼠 IgG1&amp;kappa;）</td><td>BD Sciences</td><td>563338</td><td>流式细胞术中按 1:33 稀释；用于检测第4阶段细胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 小鼠抗人 SOX17（小鼠 IgG1&amp;kappa;）</td><td>BD Sciences</td><td>562594</td><td>流式细胞术中按 1:50 稀释；用于检测第1阶段细胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 小鼠 IgG1&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Sciences</td><td>557714</td><td>流式细胞术中按 1:50 稀释</td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Cayman Chemicals</td><td>14794</td><td>TGF-β 信号通路抑制剂</td></tr><tr><td>Anti-Adherence Rinsing Solution&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td>微孔清洗液</td></tr><tr><td>检测腔室</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td>用于静态葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）实验和共聚焦成像</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>用于免疫染色程序</td></tr><tr><td>CK19 抗体</td><td>DAKO</td><td>M0888</td><td>整体免疫荧光中按 1:50 稀释</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>用于细胞核复染</td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td>基质稀释液</td></tr><tr><td>驴抗山羊 Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A21432</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗山羊 Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A21447</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A31570</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A31571</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗兔 Alexa Fluor 555</td><td>Life technologies</td><td>A31572</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗兔 Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A31573</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>驴抗绵羊 Alexa Fluor 647</td><td>Life technologies</td><td>A21448</td><td>整体免疫荧光中按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>ELISA，胰岛素，人源</td><td>Alpco</td><td>80-INSHU-E01.1</td><td>用于人胰岛素测定</td></tr><tr><td>游离脂肪酸 BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>固定和通透溶液试剂盒</td><td>BD Sciences</td><td>554714</td><td>包含 Fix/Perm 和 10x Perm/Wash 溶液</td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>用于维持培养期间 hPSCs 的团块传代</td></tr><tr><td>胰高血糖素抗体</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td>整体免疫荧光中按 1:400 稀释</td></tr><tr><td>GLUT1 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-37782</td><td>整体免疫荧光中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I（100x）</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-谷氨酰胺补充剂</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>用于组织透明化和封片</td></tr><tr><td>GSi XX</td><td>Sigma Millipore</td><td>565789</td><td>Notch 抑制剂</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>ITS-X（100x）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500056</td><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺；培养基添加剂</td></tr><tr><td>LDN193189&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72147</td><td>BMP 拮抗剂</td></tr><tr><td>MAFA 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab26405</td><td>整体免疫荧光中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>Matrigel，hESC 级别</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-774-552</td><td>用于血管表面包被的细胞外基质</td></tr><tr><td>MCDB131 培养基</td><td>Life technologies</td><td>10372019</td><td>基础培养基</td></tr><tr><td>mTeSR1 完全试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>包含干细胞培养基和 5x 补充剂</td></tr><tr><td>N-Cys（N-乙酰半胱氨酸）</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>抗氧化剂</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>NEUROD1 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2746</td><td>整体免疫荧光中按 1:20 稀释</td></tr><tr><td>NKX6.1 抗体</td><td>DSHB</td><td>F55A12-c</td><td>整体免疫荧光中按 1:50 稀释</td></tr><tr><td>胰多肽抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF6297</td><td>整体免疫荧光中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PDX1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>整体免疫荧光中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 GCG（小鼠 IgG1&amp;kappa;）</td><td>BD Sciences</td><td>565860</td><td>流式细胞术中按 1:2,000 稀释；用于检测第7阶段细胞</td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 NKX6.1（小鼠 IgG1k）</td><td>BD Sciences</td><td>563023</td><td>流式细胞术中按 1:250 稀释</td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人 PDX1（小鼠 IgG1k）</td><td>BD Sciences</td><td>562161</td><td>流式细胞术中按 1:200 稀释；用于检测第4阶段细胞</td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG1&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Sciences</td><td>554680</td><td>流式细胞术中按 1:2,000 稀释</td></tr><tr><td>PE 小鼠抗人嗜铬粒蛋白 A（CHGA，小鼠 IgG1k）</td><td>BD Sciences</td><td>564563</td><td>流式细胞术中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>R428&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>21523</td><td>AXL 酪氨酸激酶抑制剂</td></tr><tr><td>全反式视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>对光敏感</td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液，10x</td><td>Sigma</td><td>20-188</td><td>用于激素提取</td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Sigma</td><td>S4572</td><td>SHH 抑制剂</td></tr><tr><td>SLC18A1 抗体</td><td>Sigma</td><td>HPA063797</td><td>整体免疫荧光中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>生长抑素抗体</td><td>Sigma</td><td>HPA019472</td><td>整体免疫荧光中按 1:100 稀释</td></tr><tr><td>STEMdiff 胰腺前体细胞试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05120</td><td>包含基础培养基和补充剂</td></tr><tr><td>突触素抗体</td><td>Novus</td><td>NB120-16659</td><td>整体免疫荧光中按 1:25 稀释</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>用于通透处理</td></tr><tr><td>Trolox&amp;nbsp;</td><td>Sigma Millipore</td><td>648471</td><td>维生素 E 类似物</td></tr><tr><td>TrypLE 酶快速型</td><td>Life technologies</td><td>12604-021</td><td>用于 hPSCs 单细胞传代的细胞解离酶试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶1/2/3 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3586</td><td>整体免疫荧光中按 1:25 稀释</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>ROCK 抑制剂</td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td>培养基添加剂</td></tr></tbody></table>

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

将人类多能干细胞（hPSCs）分化为可分泌胰岛素的β细胞，为研究β细胞功能及糖尿病治疗提供了重要材料。然而，在获得能够充分模拟天然人类β细胞特性的干细胞来源β细胞方面，仍存在挑战。在既往研究基础上，已生成hPSC来源的胰岛样细胞，进而建立了一种可提高分化效率与一致性的实验方案。本方案在第1至第4阶段采用胰腺前体细胞试剂盒，第5至第7阶段则采用基于2014年先前发表论文所改进的方案（以下简称“R-方案”）。本方案详细描述了使用胰腺前体细胞试剂盒及直径为400 µm的微孔板生成胰腺前体细胞簇、在96孔静态悬浮体系中采用R-方案进行内分泌分化，以及 体外 人多能干细胞衍生胰岛的表征与功能评估也包含在内。该完整方案首先需要1周时间进行人多能干细胞的初始扩增，随后约5周时间获得可产生胰岛素的人多能干细胞胰岛。具备基本干细胞培养技术以及生物学检测培训经验的人员均可重复本方案。

我们开发了一种七步法混合策略，用于将干细胞分化为可分泌胰岛素的人多能干细胞来源的胰岛（hPSC-islets）。该策略在前四个阶段采用胰腺前体细胞试剂盒进行平面培养，随后基于先前报道的方法改进并实施后续步骤。6 在静态悬浮培养条件下进行最后三个阶段（图1）。根据本方案，在细胞接种后24小时（第0阶段）确保培养物达到接近完全汇合（90%–100%）对于大多数hPSC系的有效分化起始至关重要（图2A）。强烈建议测试不同的接种密度，以确定特定细胞系的最佳培养条件。在第1阶段培养期间，由于存在悬浮的死细胞，培养基可能会呈现浑浊状态，这在此阶段较为常见。只要贴壁细胞已完全覆盖培养容器表面，该现象不会影响试剂盒的分化效率。在第2至第4阶段，随着细胞增殖和细胞死亡减少，单层细胞逐渐变得更加致密，耗尽的培养基也不再像第1阶段那样浑浊（图2A）。如使用胰岛素报告基因 Mel1 INS 所示GFP/W hESC...

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。

将人类多能干细胞（hPSCs）分化为可分泌胰岛素的β细胞，可为研究β细胞功能以及……提供材料

本方案采用静态悬浮培养策略，将胰腺前体细胞分化为胰岛样细胞簇，减少了细胞在摇动培养过程中所承受的应激压力，显著提高了分化成功率。该硬件方案对初学者友好，可节省前四个阶段优化所需的时间。具备基本干细胞培养技术的人员均可成功重复本方案，并有较大概率获得具有功能的胰岛样细胞簇。首先，用预冷的 DMEM/F12 培养基稀释适用于 hESC 的 Matrigel 包被培养孔，并将培养板置于湿润、37°C、含 5% 二氧化碳的培养箱中孵育 30 分钟。吸除 hPSC 培养物中的废弃培养基，并用 DPBS 洗涤一次。在 37°C 条件下，使用细胞解离酶将 hPSC 培养物解离为单细胞，孵育时间为 3 至 5 分钟。消化后，加入温热的DMEM/F12培养基清洗细胞，并转移至15或50毫升的锥形离心管中。将细胞悬液在300 G条件下离心5分钟，然后将沉淀重悬于含有10 µM Y-27632的干细胞完全培养基中。随后，使用血细胞计数板进行活细胞计数。计数后，将稀释的基质胶吸出，并立即在基质胶包被的孔板中以每平方厘米1.6至1.8 × 10⁵的密度接种活细胞。将细胞置于湿润培养箱中培养24小时。接着，在第一阶段第一天，配制阶段1A培养基。将耗尽的培养基更换为第1A阶段培养基，并培养24小时。次日，将孔中的耗尽培养基更换为 freshly prepared 第1B阶段培养基。在第二阶段的第一天，制备第2A阶段培养基，并将孔中的培养基更换为第2A阶段培养基。加入2B阶段培养基前，先孵育24小时；第三阶段第一天，吸除孔中的废弃培养基，然后加入新鲜配制的3阶段培养基，并在湿润培养箱中孵育。第四阶段第一天，用新鲜配制的4阶段培养基替换废弃培养基，并在湿润培养箱中孵育。第四阶段第五天，每孔加入500 µL抗黏附冲洗液对微孔进行预处理。将微孔板在1,300 G下离心5分钟，并在显微镜下观察，确保微孔中无气泡残留。接着，吸去孔中的洗涤液，并用1毫升DPBS洗涤一次。然后，向每孔中加入1毫升聚集培养基。从胰腺前体细胞培养物中移除用过的培养基后，先用 DPBS 清洗培养物一次，然后在 37 摄氏度下使用消化试剂消化 10 至 12 分钟，使其解离为单细胞。用预温的 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，并将其转移至离心管中，在 300 ×g 条件下离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于成团培养基中，并进行活细胞计数。每孔接种 240 万至 360 万个细胞，并向每孔加入聚集培养基，使每孔终体积为 2 毫升。使用 P-1000 移液器吸头轻轻吹打细胞，使其均匀分布。将细胞悬液在 300 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉降至微孔中，随后在湿润培养箱中孵育 24 小时，以启动细胞聚集。聚集后，轻轻吹打聚集体数次，使未聚集的细胞悬浮。待聚集体沉降后，小心移除含有悬浮未聚集细胞的废弃培养基，避免吸走聚集体。将新鲜的第5阶段培养基加入微孔板表面，使聚集体从微孔中脱离，并将其转移至超低吸附六孔板中。将所有团块收集到超低吸附六孔板后，用第5阶段培养基重悬，调整密度至每100微升含20个团块。然后，使用多通道移液器将50微升第5阶段培养基加入超低吸附ULA平底96孔板的每个孔中。在角落和边缘孔中加入200微升DPBS。每次分装前轻轻混匀细胞团重悬液。然后，将100微升细胞团重悬液加入超低吸附平底96孔板的每孔中。将培养板置于湿润培养箱内的水平表面上，孵育24小时。第二天或第五阶段的第二天，使用多通道移液器，从每个孔中轻轻吸出90 µL的用过的培养基，并加入100 µL第五阶段培养基进行更换。在第六阶段的第一天，将每个孔中的90 µL用过的培养基替换为100 µL第六阶段培养基。在第七阶段的第一天，移除用过的培养基，并为每个孔加入100 µL第七阶段培养基。本研究中，利用微孔板可一次性生成数千个大小和形态均一的胰腺前体细胞簇，平均聚集效率约为74%。重要的是，这些细胞簇在聚集后仍能维持PDX1和NKX6.1的高水平表达。随着时间推移，在活体培养中可观察到内分泌细胞簇内胰岛素表达细胞逐渐被诱导，表现为胰岛素GFP信号随时间逐渐增强。细胞簇的尺寸在第五至第七阶段之间，平均直径从150微米增加至220微米。细胞组成表征显示，通过混合方案生成的第7阶段人多能干细胞（hPSC）胰岛主要为内分泌细胞，包含四种主要的胰岛细胞类型。该混合方案主要产生单激素胰岛细胞，以及少量双激素细胞。分化形成的β细胞表达NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1和GLUT1。此外，在第七阶段的培养中，可诱导出60%的胰岛素和PDX1双阳性细胞以及50%的C肽和NKX6.1双阳性细胞。体外静态葡萄糖刺激胰岛素分泌实验表明，第七阶段的hPSC胰岛在高葡萄糖刺激和直接去极化条件下能够分泌高水平的胰岛素。hPSC胰岛的总胰岛素含量约为尸体来源胰岛的一半。基于多孔板的静态培养系统可用于生成干细胞来源的胰岛，支持多种原位检测，并可作为方案开发和小规模筛选研究的合适平台。在96孔板中进行静态培养时，为尽量减少细胞聚集体的融合，在更换培养基时切勿倾斜培养板，应始终将培养板水平放置于平整表面上。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人类多能干细胞分化为产生胰岛素的胰岛簇

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。...

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

本文描述了一种从人胎儿胰腺细胞中分离、培养和成像胰岛细胞簇（ICCs）的实验方案。...

人胎儿胰腺细胞簇的分离、培养与成像

本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。...

一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外...

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

人类多能干细胞（hPSCs）具有分化并自组织形成特定组织结构的内在能力；然而这一过程需要空间环境梯度的引导。本文介绍了一种简单且可靠的模板微图形化技术，可用于构建生化和力学梯度，从而调控hPSCs的分化模式。...

用于研究分化命运空间组织的人类多能干细胞模板微图形化技术

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。...

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

学习利用静态悬浮培养技术将胰腺祖细胞分化为分泌胰岛素的胰岛样细胞簇，该方法可减少细胞应激并显著提高分化成功率，为基础研究人员提供可靠的糖尿病治疗研究方案。

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

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