Name: Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende ensayos de citotoxicidad en líneas celulares ZEM2S y ZFL de pez cebra usando placas de 96 pocillos. Este método permite evaluar la toxicidad aguda de químicos sin usar animales.

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En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticario.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener la lista de materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para la composición de soluciones y medios utilizados en este protocolo.
1. Preparación de células ZFL y ZEM2S
<ol><li>Comenzar con un matraz T75 de células ZFL o ZEM2S con 80% de confluencia, cultivadas en el medio completo respectivo a 28 °C sinCO2.</li>
	<li>Retirar el medio de cultivo del matraz y lavar las células añadiendo 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M). Añadir 3 ml de tripsina 1x (0,05% v/v; 0,5 mM tripsina-EDTA) a los matraces de cultivo. Incubar a 28 °C durante 3 min.</li>
	<li>Golpee suavemente el matraz para liberar las células y luego detenga la digestión de tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo completo al matraz.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrifuga a 100 × g durante 5 min.</li>
	<li>Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, agregue 1 ml de medio completo para células ZFL o ZEM2S y vuelva a suspender el pellet con una micropipeta.</li>
</ol>2. Conteo celular por exclusión del colorante azul de tripano
<ol><li>Agregue 10 μL de la suspensión celular y 10 μL de colorante azul de tripano a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad. Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta.</li>
	<li>Luego, transfiera 10 μL de esta mezcla (suspensión celular + azul de tripano) a una cámara de Neubauer y cuente las celdas en los cuatro cuadrados grandes (cuadrantes Q) colocados en las esquinas de la cámara, considerando que las células viables son aquellas que no absorben azul de tripano. Determina el número de celdas viables usando la ecuación (1): <img alt="Fórmula de recuento de células: Número de célula = (ΣQ/4) × 10^4; ecuación matemática para la cuantificación." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (1)</li>
	<li>Calcule el número de celda final en la suspensión celular multiplicando el número de celdas determinado usando la ecuación (1) por dos (el factor de dilución debido al uso de azul de tripano). NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema automatizado de recuento celular (por ejemplo, un citómero con función de recuento celular y viabilidad).</li>
</ol>3. Recubrimiento celular en placas de 96 pocillos
<ol><li>Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener el número de células necesarias para realizar los ensayos de citotoxicidad. El número de células viables para cada línea celular se indica a continuación:<ol><li>Placa 60.000 células ZEM2S viables por pocillo; por lo tanto, para toda la placa, use seis millones de células en 20 ml de medio completo (200 μL / pocillo, placa de 96 pocillos).</li>
		<li>Placa 40.000 células ZFL viables por pozo; por lo tanto, para toda la placa, use cuatro millones de células en 20 ml de medio completo (200 μL / pocillo, placa de 96 pocillos).</li>
	</ol></li>
	<li>Después de eso, transfiera el volumen respectivo de la suspensión celular a un depósito de reactivo (estéril) y llénelo con el medio de cultivo completo para ZFL o ZEM2S a 20 ml. Con una pipeta multicanal, mezcle la solución suavemente hacia arriba y hacia abajo. NOTA: Tenga cuidado de no formar espuma o burbujas.</li>
	<li>Añadir 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa transparente de poliestireno de 96 pocillos utilizando la micropipeta multicanal. Incubar las placas a 28 °C durante 24 h. NOTA: La placa debe tener al menos tres pocillos sin celdas para el control en blanco, y solo se deben agregar medios completos a estos pocillos. El efecto borde (causado por una mayor evaporación en los pocillos de borde) ocurre comúnmente en ensayos de placas de 96 pocillos y puede afectar la viabilidad de las células en los pocillos de borde de la placa28. Este efecto puede ser mayor o menor dependiendo de la marca y el diseño de la placa de 96 pocillos28. Aunque no notamos ninguna alteración del crecimiento celular / viabilidad para ZFL y ZEM2S en los pozos de borde, sugerimos sellar la placa con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar este efecto, o cultivar las células solo en los 60 pozos interiores y llenar los pozos de borde con PBS.</li>
</ol>4. Exposición de las células a la sustancia de ensayo
<ol><li>Deseche cuidadosamente los medios gastados de los pocillos utilizando una micropipeta multicanal.</li>
	<li>Exponga las células para probar sustancias químicas en diferentes concentraciones. Preparar las soluciones de las concentraciones químicas de ensayo en los medios de cultivo para ZFL o ZEM2S sin suero fetal bovino (FBS) (medios de exposición). Luego, agregue 100 μL por pocillo de estas soluciones en triplicado técnico (es decir, tres pocillos/concentración química de prueba).</li>
	<li>Para los controles, coloque los grupos de control en la misma placa que la sustancia problema en triplicados técnicos (tres pocillos/grupo de control). Por lo tanto, para el control en blanco (B), agregue 100 μL de los medios de exposición en los pocillos libres de células, para el control negativo (NC), agregue 100 μL del medio de exposición a los pocillos con células, y para el control positivo (PC), exponga las células a una solución de Triton X-100 al 1% preparada en el medio de exposición. En algunos casos, se debe incluir un control de disolvente (SC) en la placa, considerando una concentración claramente no citotóxica como concentración final de disolvente. NOTA: Se recomienda utilizar DMSO al 0,5% como disolvente; El DMSO se puede utilizar hasta un 1% como disolvente en estas líneas celulares sin exceder el umbral de citotoxicidad del 10% relacionado con el control negativo.</li>
	<li>Incubar las placas a 28 °C durante 24 h. Selle las placas con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo. NOTA: Ciertos productos químicos pueden tener absorbancia de fondo intrínseca o fluorescencia que puede interferir con la absorbancia o fluorescencia de los colorantes indicadores (por ejemplo, los compuestos con color pueden influir en la absorbancia, la albúmina sérica29 y los compuestos que interfieren con las enzimas reductoras30,31). En este caso, la placa debe incluir un control adicional mediante la adición de soluciones químicas de prueba en los pocillos sin células. Esto es para verificar la posible interferencia de la auto-absorbancia química / autofluorescencia con los tintes. Si se detecta interferencia, se debe evaluar si se puede excluir para obtener una predicción correcta de la citotoxicidad.</li>
</ol>5. Ensayos de citotoxicidad
NOTA: Prepare todas las soluciones de acuerdo con la Tabla 1. Todos los pasos descritos a continuación (Figura 1) se llevan a cabo en condiciones estériles. No se recomienda el uso de una pipeta para desechar los medios de exposición, ya que las células pueden desprenderse fácilmente de los pocillos después del tratamiento químico.
<ol><li>Ensayos AB y CFDA-AM<ol><li>Después de 24 h de exposición química de prueba, deseche cuidadosamente los medios de exposición vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.</li>
		<li>Lave el plato con 200 μL de PBS. Retire con cuidado el PBS vertiéndolo en una bandeja de recolección para evitar la pérdida de células.</li>
		<li>Añadir 100 μL por pocillo de solución AB/CFDA-AM. Incubar la placa durante 30 minutos en la oscuridad a 28 °C.</li>
		<li>Mida la fluorescencia en un lector de placas de fluorescencia a 530 nm (excitación) y 595 nm (emisión) para AB, y a 493 nm (excitación) y 541 nm (emisión) para CFDA-AM.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo NR NOTA: Los pasos para el ensayo NR se llevan a cabo inmediatamente después de los ensayos AB y CFDA-AM (Figura 1).<ol><li>Centrifugar la solución de trabajo NR (40 μg/ml) a 600 × g durante 10 min. NOTA: La precipitación de NR en el tubo no debe transferirse a las placas. Por lo tanto, después de la centrifugación de la solución de trabajo NR, recoger el sobrenadante con una pipeta sin aspirar los precipitados NR. Transfiera el sobrenadante a un depósito de reactivo.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución AB/CFDA-AM vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.</li>
		<li>Añadir 100 μL por pocillo de la solución de trabajo NR utilizando una micropipeta multicanal. Incubar la placa a 28 °C durante 3 h. NOTA: Después de la incubación de 3 h, observe si se produjo precipitación de NR en las placas con un microscopio. Los precipitados de NR pueden interferir con la cuantificación de la viabilidad celular, por lo tanto, no deben estar presentes.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución NR vertiendo el contenido en una bandeja de recolección. Lave los pocillos agregando 150 μL de PBS por pocillo.</li>
		<li>Añadir 150 μL por pocillo de la solución de extracción NR e incubar la placa en un agitador de placas durante 10 minutos para agitar suavemente. Mida la absorbancia a 540 nm en un lector de placas. NOTA: Se debe realizar una segunda lectura a 690 nm para excluir cualquier absorbancia de huellas dactilares de fondo en la placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo MTT NOTA: El ensayo MTT debe realizarse por separado de los ensayos descritos anteriormente (en una placa nueva) (Figura 2).<ol><li>Retire con cuidado los medios de exposición vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.</li>
		<li>Añadir 100 μL de solución de trabajo MTT por pocillo utilizando una micropipeta multicanal. Incubar la placa a 28 °C durante 4 h.</li>
		<li>Deseche la solución MTT vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.</li>
		<li>Añadir 100 μL por pocillo de DMSO para extraer los cristales de formazan, incubando la placa en un agitador de placas durante 10 min. Mida la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de placas. NOTA: Se debe realizar una segunda lectura a 690 nm para excluir cualquier absorbancia de huellas dactilares de fondo en la placa. Es importante señalar que los productos químicos de ensayo pueden interferir con el MTT, que debe ser evaluado para garantizar la calidad de los datos generados32. Para ello, se deben exponer pocillos libres de células que contengan las concentraciones de prueba y MTT (0,5 mg / ml), seguidos de incubación para observar cualquier cambio de color en los pocillos que pueda aumentar la absorbancia y conducir a resultados de viabilidad falsos. Los productos químicos que interactúan con MTT deben evitarse en esta prueba.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Cálculo de la viabilidad celular/citotoxicidad
NOTA: La absorbancia bruta o fluorescencia adquirida se utiliza para calcular la viabilidad celular como un porcentaje relacionado con el control negativo (para sustancias de ensayo preparadas directamente en medios de exposición) o el control de disolventes (para sustancias químicas de ensayo preparadas con disolventes, como el DMSO). Antes de determinar el porcentaje de viabilidad celular, los datos sin procesar deben ser normalizados por el control en blanco.
<ol><li>Calcular la absorbancia o fluorescencia media para cada concentración química de ensayo y grupo de control (tres pocillos/tratamiento).</li>
	<li>Para determinar el porcentaje de viabilidad celular en relación con el control (negativo o solvente), use la ecuación (2): <img alt="Fórmula de cálculo de viabilidad celular en análisis bioquímico, mostrando porcentaje basado en absorbancia." src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (2) NOTA: Las unidades de absorbancia (abs) o fluorescencia (fluo) representan la media de absorbancia o fluorescencia medida en los tres pocillos por concentración; El blanco representa pozos sin celdas.</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Los ensayos de citotoxicidad son ampliamente utilizados para la evaluación de toxicidad in vitro, y este artículo del protocolo presenta cuatro ensayos de citotoxicidad comúnmente utilizados modificados para ser realizados en líneas celulares de pez cebra (es decir, densidad celular para placa de 96 pocillos, tiempo de incubación en el ensayo MTT, agotamiento de FBS durante la condición de exposición química y concentración máxima aceptable para el SC). Como estos ensayos cuantifican la citotoxicidad por diferen...

Las sustancias químicas deben ser probadas en cuanto a su seguridad para la salud humana y el medio ambiente. Los biomarcadores moleculares y celulares se han considerado cada vez más en las evaluaciones de seguridad para predecir los efectos en los organismos vivos por parte de las agencias reguladoras y/o legislaciones (por ejemplo, REACH, OCDE, US EPA)1,2, ya que pueden preceder al resultado adverso in vivo (por ejemplo, alteración endocrina, respuesta inmunológica, toxicidad aguda, fototoxicidad)3,4,5,6,7 . En este contexto, la citotoxicidad ha sido tomada como medida para predecir la toxicidad aguda de los peces 5,8; Sin embargo, puede tener muchas otras aplicaciones en estudios de ecotoxicidad, como la definición de concentraciones subcitotóxicas de sustancias químicas para estudiar su conjunto más diverso de efectos en los peces (por ejemplo, efectos de alteración endocrina).
En los sistemas de cultivo celular (sistemas in vitro ), la citotoxicidad de las sustancias químicas puede determinarse mediante métodos que difieren en los tipos de criterios de valoración. Por ejemplo, un método de citotoxicidad puede basarse en un punto final relacionado con la morfología específica observada durante el proceso de muerte celular, mientras que otro puede determinar la citotoxicidad mediante la medición de la muerte celular, la viabilidad y funcionalidad, la morfología, el metabolismo energético y la unión y proliferación celular. Las sustancias químicas pueden afectar la viabilidad celular a través de diferentes mecanismos, por lo que la evaluación de la citotoxicidad que cubre diferentes criterios de valoración de la viabilidad celular es necesaria para predecir los efectos químicos9.
MTT y Alamar Blue (AB) son ensayos que determinan los efectos sobre la viabilidad celular en función de la actividad metabólica celular. El ensayo MTT evalúa la actividad de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa10. La reducción del bromuro amarillento de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a azul de formazán ocurre solo en células viables, y su densidad óptica es directamente proporcional al número de células viables10. El ensayo AB es un indicador sensible de oxidación-reducción, mediado por enzimas mitocondriales que emiten fluorescencia y cambian de color al reducir la resazurina a resorufina por las células vivas11; sin embargo, las enzimas citosólicas y microsomales también contribuyen a la reducción de AB y MTT12. Estas enzimas pueden incluir varias reductasas, como alcohol y aldehído oxidorreductasas, NAD(P)H: quinona oxidorreductasa, flavina reductasa, NADH deshidrogenasa y citocromos11.
El ensayo Neutral Red (NR) es un ensayo de viabilidad celular basado en la incorporación de este colorante en los lisosomas de células viables13. La absorción de NR depende de la capacidad de las células para mantener gradientes de pH. El gradiente de protones dentro de los lisosomas mantiene un pH más bajo que el citoplasma. A pH fisiológico normal, el NR presenta una carga neta de aproximadamente cero, lo que le permite penetrar en las membranas celulares. Por lo tanto, el tinte se carga y se retiene dentro de los lisosomas. En consecuencia, cuanto mayor es la cantidad de NR retenida, mayor es el número de células viables14. Las sustancias químicas que dañan la superficie celular o las membranas lisosomales perjudican la absorción de este colorante.
El ensayo CFDA-AM es un ensayo de viabilidad celular fluorométrica basado en la retención de éster acetoxymetilo de diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA-AM)15. La 5-CFDA-AM, sustrato de esterasa, se convierte en carboxifluoresceína, sustancia fluorescente que es polar y no permeable por las membranas de las células vivas15; Por lo tanto, se retiene en el lado interno de una membrana celular intacta, lo que indica células viables.
Recientemente, se combinaron tres ensayos de citotoxicidad (ensayos CFDA-AM, NR y AB) en una guía ISO (Organización Internacional de Normalización) validada (ISO 21115: 2019)16 y un método de prueba de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos) (OCDE TG 249) para evaluar la toxicidad aguda de los peces utilizando la línea celular RTgill-W1 (línea celular permanente de trucha arco iris [Oncorhynchus mykiss] branquia) en placas de 24 pocillos17 . Aunque existe un método basado en células para predecir la toxicidad aguda de los peces, se han invertido esfuerzos en desarrollar métodos similares con otras especies de peces y aumentar el rendimiento del método. Algunos ejemplos incluyen el desarrollo de líneas celulares ZFL transfectadas con genes reporteros para vías de toxicidad específicas18,19, pruebas de fototoxicidad en la línea celular RTgill-W1 20, y el uso de líneas celulares ZFL y ZF4 (fibroblástico de pez cebra derivado de embriones de 1 día de edad) para evaluar la toxicidad mediante varios ensayos de citotoxicidad21.
Danio rerio (pez cebra) es una de las principales especies de peces utilizadas en estudios de toxicidad acuática; Por lo tanto, los métodos basados en células con líneas celulares de pez cebra para pruebas de toxicidad de peces pueden ser extremadamente útiles. La línea celular ZFL es una línea celular de hepatocitos epiteliales de pez cebra que presenta las principales características de las células del parénquima hepático y puede metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Mientras tanto, la línea celular ZEM2S es una línea celular fibroblástica embrionaria de pez cebra derivada de la etapa de blástula que puede usarse para investigar los efectos del desarrollo en peces26,27. Por lo tanto, este protocolo describe cuatro ensayos de citotoxicidad (ensayos MTT, AB, NR y CFDA-AM), con modificaciones que se realizarán con líneas celulares ZFL y ZEM2S en placas de 96 pocillos.

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM (diacetato de 5-carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo)</td><td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular, placa de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>Superficie: Estándar, base plana</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Polvo, alto contenido de glucosa, piruvato</td></tr><tr><td>FBS - Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-12 de jamón, polvo</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medio</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Neutro rojo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>Polvo, Biorreactivo, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>Agitador orbital&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm de diámetro de rotación</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10X) con calcio y magnesio</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurina sal sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>Polvo, Biorreactivo, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Polvo,&nbsp; biorreactivo para biología molecular</td></tr><tr><td>Azul de tiazolilo Bromuro de tetrazolio&nbsp; 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripán (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol</td><td>Línea celular Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Esta línea celular fue amablemente donada por el Profesor Dr. Michael J. Carvan (Universidad de Wisconsin, Milwaukee, EE. UU.)</td></tr> <tr><td>Línea celular ZFL</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

Las líneas celulares de peces se han utilizado cada vez más en estudios de ecotoxicidad, y los ensayos de citotoxicidad se han propuesto como métodos para predecir la toxicidad aguda de los peces. Por lo tanto, este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad modificados para evaluar la viabilidad celular en líneas celulares de embrión de pez cebra (Danio rerio) (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos. Los criterios de valoración de citotoxicidad evaluados son la integridad mitocondrial (ensayos Alamar Blue [AB] y MTT), la integridad de la membrana a través de la actividad de la esterasa (ensayo CFDA-AM) y la integridad de la membrana lisosomal (ensayo Neutral Red [NR]). Después de la exposición de las sustancias de ensayo en una placa de 96 pocillos, se realizan los ensayos de citotoxicidad; aquí, AB y CFDA-AM se llevan a cabo simultáneamente, seguidos de NR en la misma placa, mientras que el ensayo MTT se realiza en una placa separada. Las lecturas para estos ensayos se toman por fluorescencia para AB y CFDA-AM, y absorbancia para MTT y NR. Los ensayos de citotoxicidad realizados con estas líneas celulares de peces se pueden utilizar para estudiar la toxicidad aguda de sustancias químicas en peces.

La figura 3 muestra las placas de los ensayos AB, CFDA-AM, NR y MTT. Para el ensayo AB (Figura 3A), los pocillos en blanco y los pocillos sin células viables o con un número reducido de ellas muestran color azul y baja fluorescencia, mientras que los pocillos con un alto número de células viables son rosados y presentan altos valores de fluorescencia debido a la transformación de resazurina (AB) en resorufina (sustancia rosada) por las células viables. Para el e...

Este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad de uso común (ensayos Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red y MTT) adaptados para la evaluación de la citotoxicidad en líneas celulares de embrión de pez cebra (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos.

Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

Fish cell lines have become increasingly used in ecotoxicity studies, and cytotoxicity assays have been proposed as methods to predict fish acute ...

El protocolo de ensayo de citotoxicidad utilizando líneas celulares de pez cebra puede responder preguntas sobre la toxicidad aguda de los productos químicos en los peces o ayudar a definir las concentraciones de prueba apropiadas para otros ensayos alternativos de peces. La principal ventaja de este ensayo en placa de 96 pocillos es la combinación de diferentes criterios de valoración de viabilidad para determinar la citotoxicidad de las células de pez cebra, que es una especie de pez importante en los estudios de ecotoxicidad. El protocolo es muy simple.Si sigue todos los pasos descritos correctamente, uno no debería encontrar ningún problema. Este protocolo ayuda a lograr estudios de ecotoxicidad de origen animal que evalúen los efectos en líneas celulares de peces derivadas de diferentes órganos o etapas de la vida, como los hepatocitos en células embrionarias. Para comenzar a colocar las células ZEM2S o ZFL, calcule el volumen de las respectivas suspensiones celulares necesarias para obtener el número deseado de células para los ensayos.Llene un depósito de reactivo estéril con el medio de cultivo completo para la línea celular correspondiente y transfiera el volumen calculado de la suspensión celular al reservorio para un volumen total de 20 mililitros. Con una pipeta multicanal, mezcle suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo sin formar espuma ni burbujas. Luego, usando la micropipeta multicanal, agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa transparente de poliestireno de 96 pocillos para obtener un recuento de células viable de 60, 000 células por pocillo para las células ZEM2S y 40, 000 células por pocillo para las células ZFL.Incubar la placa a 28 grados centígrados durante 24 horas. Para exponer cualquier tipo de células a diferentes concentraciones de las sustancias químicas de ensayo, preparar la concentración deseada de soluciones de la sustancia de ensayo en los medios de cultivo para la línea celular de interés sin suero fetal bovino o FBS. Después de la incubación de 24 horas, deseche cuidadosamente los medios gastados de los pocillos utilizando una micropipeta multicanal.Luego agregue 100 microlitros de una solución química de prueba particular por pocillo en triplicados técnicos, lo que significa tres pocillos para cada concentración química de prueba. Coloque los grupos de control en la misma placa que los productos químicos de ensayo en triplicados técnicos. Para el control en blanco, agregue 100 microlitros del medio de exposición en tres pocillos libres de células.Para el control negativo, agregue 100 microlitros del medio de exposición a tres pocillos que contengan células. Para el control positivo, exponga tres pocillos que contienen células a una solución Triton X-100 al 1% preparada en el medio de exposición. Selle las placas con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo e incube las placas a 28 grados centígrados durante 24 horas.Después de 24 horas de la exposición química de prueba, deseche cuidadosamente los medios de exposición de los pocillos vertiendo el contenido en una bandeja de recolección y lave cada pocillo con 200 microlitros de PBS. Luego, para eliminar el PBS sin perder células, viértalo con cuidado en una bandeja de recolección. Para realizar los ensayos Alamar Blue o AB y CFDA-AM, agregue 100 microlitros de la solución respectiva por pocillo e incube la placa durante 30 minutos en la oscuridad a 28 grados centígrados.A continuación, mida la fluorescencia en un lector de placas de fluorescencia en las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas mencionadas en el texto. Para realizar el ensayo rojo neutro o NR, tome la solución de trabajo NR que tiene una concentración de 40 microgramos por mililitro y centrifugar a 600 G durante 10 minutos. A continuación, retire cuidadosamente las soluciones AB y CFDA-AM previamente agregadas de los pozos vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.Con una micropipeta multicanal, agregue 100 microlitros de la solución de trabajo NR por pocillo e incube la placa a 28 grados centígrados durante tres horas. Una vez finalizada la incubación, vierta cuidadosamente la solución NR de la placa en una bandeja de recolección y lave los pocillos agregando 150 microlitros de PBS por pozo. Después del lavado, agregue 150 microlitros de la solución de extracción NR por pocillo e incube la placa agitándola suavemente en un agitador de placas durante 10 minutos antes de medir la absorbancia a 540 nanómetros con un lector de placas.Para llevar a cabo el ensayo MTT, después de la exposición química de prueba de 24 horas, retire cuidadosamente los medios de exposición vertiendo el contenido en una bandeja de recolección y, utilizando una micropipeta multicanal, agregue 100 microlitros de solución de trabajo MTT por pocillo en la oscuridad. Incubar la placa a 28 grados centígrados durante cuatro horas en la oscuridad. Luego deseche la solución MTT vertiendo el contenido en una bandeja de recolección y agregue 100 microlitros de DMSO en cada pocillo para extraer los cristales de formazan.Incubar la placa en un agitador de placas durante 10 minutos antes de medir la absorción a 517 nanómetros utilizando un lector de placas. Para el ensayo AP, los pocillos correspondientes a concentraciones en blanco, de control positivo y altamente citotóxicas de sustancias químicas de prueba mostraron color azul y baja fluorescencia, lo que indica la ausencia o una reducción de células viables. En contraste, los pocillos correspondientes a bajas concentraciones citotóxicas de prueba química y control negativo que contienen un alto número de células viables convirtieron la resazurina en resorufina rosada con mayor fluorescencia.Para el ensayo NR, las concentraciones altamente citotóxicas de los productos químicos de prueba y el control positivo son transparentes o de color rosa pálido con baja absorbancia, mientras que los pocillos que contienen células viables que retienen el colorante NR muestran un color rosa oscuro y una alta absorbancia. Del mismo modo, para el ensayo MTT, los pocillos sin células viables son transparentes, mientras que los que contienen células viables transforman MTT en formazán de color violeta. Sobre la base de los porcentajes de viabilidad celular calculados, se estimó la mitad de la concentración máxima del inhibidor o el valor de IC50 para los diferentes productos químicos de prueba en líneas celulares ZFL y ZEM2S.No se observaron diferencias significativas en la viabilidad celular para cultivos con y sin FBS, lo que indica la idoneidad de los medios de cultivo privados de FBS para el período de exposición química de 24 horas. Los ensayos MTT y NR no mostraron un efecto significativo de las concentraciones variables de DMSO de 0.1% a 1% en la viabilidad celular, lo que indica que estas líneas celulares apoyan el uso de DMSO como solvente hasta un 1%Preste especial atención al manipular células chapadas para evitar el autodesprendimiento durante todo el procedimiento y prepare cuidadosamente la solución de trabajo roja neutra para evitar cualquier precipitación de colorante. Este procedimiento se puede aplicar a estudios que abordan varios aspectos de los efectos químicos en peces utilizando modelos in vitro, y contribuir al progreso de los estudios de ecotoxicidad sin animales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Este video describe el ensayo de xenoinjerto de pez cebra para evaluar la formación de tumores in vivo y estudiar el efecto de los agentes terapéuticos.

Ensayo de xenoinjerto de pez cebra: un método para evaluar la eficacia anticancerígena de las terapias sobre la tumorigénesis en el pez cebra in vivo

Los embriones de pez cebra se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos químicos. Se desarrollan externamente y son sensibles a los productos químicos, lo que permite la detección de cambios fenotípicos sutiles. El experimento sólo requiere una pequeña cantidad de compuesto, que se añade directamente a la placa que contiene embriones, haciendo que el sistema de prueba sea eficiente y rentable.

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Este protocolo describe los procedimientos para inducir lesiones renales agudas (AKI) en peces cebra adultos utilizando cisplatino como agente nefrotoxico. Detallamos los pasos para evaluar la reproducibilidad de la técnica y dos técnicas para analizar la inflamación y la muerte celular en el tejido renal, la citometría de flujo y tunel, respectivamente.

Modelo de lesión renal aguda inducida por cisplatino en pez cebra adulto

Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.

Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

El pez cebra ha sido explotado recientemente como modelo para validar posibles modificadores de radiación. El presente protocolo describe los pasos detallados para utilizar embriones de pez cebra para experimentos de detección basados en radiación y algunos enfoques observacionales para evaluar el efecto de diferentes tratamientos y radiación.

Larvas de pez cebra como modelo para evaluar posibles radiosensibilizadores o protectores

Aquí, presentamos un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides de dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal).

Un método de cultivo 3D de esferoides de líneas celulares embrionarias y hepáticas de pez cebra

Utilizamos la tinción de proliferación celular para identificar células quiescentes en el modelo de leucemia linfoblástica aguda T de pez cebra. La tinción se retiene en las células que no se dividen y se reduce durante la proliferación celular, lo que permite la selección de células inactivas para su posterior interrogación. Este protocolo proporciona una herramienta funcional para estudiar la autorrenovación en el contexto de la quiescencia celular.

Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular 

Este protocolo describe un procedimiento de cribado de fármacos en larvas de pez cebra 3-7 días después de la fecundación, seguido de una evaluación morfológica.

Cribado de moléculas pequeñas y pruebas de toxicidad en larvas de pez cebra en fase inicial

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Aprende ensayos de citotoxicidad en líneas celulares ZEM2S y ZFL de pez cebra usando placas de 96 pocillos. Este método permite evaluar la toxicidad aguda de químicos sin usar animales.

Ensayos de citotoxicidad con líneas celulares de pez cebra

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