يصف هذا البروتوكول إجراء تحليل النقل المحوري بأكمله. على وجه الخصوص ، يتم عرض حساب سرعة النقل ، وليس بما في ذلك الإيقاف المؤقت ، وطريقة التصور باستخدام برنامج الوصول المفتوح "KYMOMAKER".
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يصف هذا البروتوكول إجراء تحليل النقل المحوري بأكمله. على وجه الخصوص ، يتم عرض حساب سرعة النقل ، وليس بما في ذلك الإيقاف المؤقت ، وطريقة التصور باستخدام برنامج الوصول المفتوح "KYMOMAKER".
الخلايا العصبية عبارة عن خلايا شديدة الاستقطاب تحتوي بشكل نمطي على العديد من التشعبات ومحور عصبي. يتطلب طول المحور العصبي نقلا ثنائي الاتجاه فعالا بواسطة البروتينات الحركية. أشارت تقارير مختلفة إلى أن العيوب في النقل المحوري مرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية. أيضا ، كانت آلية تنسيق البروتينات الحركية المتعددة موضوعا جذابا. نظرا لأن المحور العصبي يحتوي على أنابيب دقيقة أحادية الاتجاه ، فمن الأسهل تحديد البروتينات الحركية المشاركة في الحركة. لذلك ، فإن فهم الآليات الكامنة وراء نقل البضائع المحورية أمر بالغ الأهمية للكشف عن الآلية الجزيئية للأمراض التنكسية العصبية وتنظيم البروتينات الحركية. هنا ، نقدم العملية الكاملة لتحليل النقل المحوري ، بما في ذلك زراعة الخلايا العصبية القشرية الأولية للفأر ، وتعداء البلازميدات التي تشفر بروتينات الشحن ، وتحليلات الاتجاه والسرعة دون تأثير التوقف. علاوة على ذلك ، تم تقديم برنامج الوصول المفتوح "KYMOMAKER" ، والذي يتيح إنشاء جهاز التصوير الحربي لتسليط الضوء على آثار النقل وفقا لاتجاهها والسماح بتصور أسهل للنقل المحوري.
أفراد عائلة كينيسين والداينين السيتوبلازمي هي بروتينات حركية تتحرك على طول الأنابيب الدقيقة في الخلايا لنقل حمولتها1. تتحرك معظم الحركينات نحو الطرف الزائد ، بينما يتحرك الداينين نحو الطرف الناقص للأنابيب الدقيقة. تم التحقيق على نطاق واسع في وظائف وآليات نقل البضائع في المحور العصبي نظرا لطولها ، تتطلب المحاور نقلا مستقرا لمسافات طويلة للحفاظ على صحة الخلايا العصبية. تم الإبلاغ عن عيوب في نقل الميتوكوندريا والبلعمات الذاتية والحويصلات التي تحتوي على سلائف بروتين β الأميلويد (APP) كأسباب للأمراض التنكسيةالعصبية 2،3. كشفت العديد من التحقيقات في المختب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة الدراسات الحيوانية بجامعة هوكايدو ، وفقا لإرشادات ARRIVE (أبحاث: الإبلاغ عن تجارب In Vivo). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J (حامل ، 15.5 يوما) في هذه الدراسة.
1. تحضير الخلايا العصبية القشرية الأولية المزروعة للفأر
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت زراعة الخلايا العصبية الأولية المزروعة من قشرة الفأر E15.5 في طبق زجاجي القاع كما هو موضح. على سبيل المثال ، تم التعبير عن APP-EGFP أو Alcα-EGFP أو Alcβ-EGFP في الخلايا العصبية القشرية الأولية. من المعروف أن APP و Alcα يتم نقلهما في المحور العصبي بواسطة kinesin-12،17. يرتبط APP ب kinesin-1 عبر بروتين المحول JIP1 (البروتين المتفاعل مع JNK 1) ، بينما يرتبط Alcα مباشرة عبر زخارفه الحمضية W المزدوجة. Alcβ هو عضو في عائلة Alcadein ولديه شكل W حمض.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يتم وصف طريقة تحليل للنقل المحوري ، والتي تتضمن حساب السرعة المجزأة وتوليد التصوير الحركي. تتمثل الخطوة الحاسمة خلال خطوة التعدي في الحفاظ على صحة الخلايا العصبية المستنبتة. اتبعت طريقة التعدي التي وصفها جيانغ وتشن29 بتعديلات طفيفة. أدى الخلط اللطيف لمحلول الحمض النووي / CaCl2 و 2x HBS إلى زيادة كفاءة التعداء عن طريق تقليل حجم الأمطار. لمنع الترسيب من إتلاف الخلايا ، تم شطف الخلايا بوسط محمض. كان الشطف السريع (مرتين أو ثلاث مرات) دون حضانة كافيا لإزالة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل KAKENHI (22K15270 ، منحة في المساعدة للعلماء الشباب) ومؤسسة أكياما لعلوم الحياة ل YS. نود أن نعرب عن امتناننا للدكتور ماساتاكا كينجو والدكتور أكيرا كيتامورا ، مختبر ديناميكيات الخلايا الجزيئية ، كلية علوم الحياة المتقدمة ، جامعة هوكايدو على تقديم المدخلات والخبرات الهامة التي ساعدت البحث بشكل كبير. تم إجراء الملاحظة باستخدام الفحص المجهري TIRF باستخدام الأداة المثبتة في مختبر ديناميكيات الخلايا الجزيئية ، كلية علوم الحياة المتقدمة ، جامعة هوكايدو. الأداة مسجلة في نظام المرافق المفتوحة الذي يديره مركز المرافق العالمي ، مؤسسة البحوث الإبداعية ، جامعة هوكايدو (AP-100138). نشكر الدكتور Seiichi Uchida ، مختبر الواجه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-فلورو-2-ديوكسيوريدين | سيجما-ألدريتش | F0503 | |
| Apo TIRF 100x / 1.49 زيت | نيكون | ||
| B-27 (50x) ، خال من المصل | Thermo fischer Scientific | 17504044 | |
| ألبومين مصل الأبقار | واكو | 013-25773 | |
| طقم تعداء كالفوس للثدييات | تاكارا | 631312 | |
| مصفاة الخلية 40 وميكرو ؛ م نايلون | فالكون | 352340 | |
| CoolSNAP HQ | القياسات الضوئية | ||
| I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Glucose | Wako | 041-00595 | |
| DMEM / Ham ' s F-12 | واكو | 042-30555 | |
| دومون رقم 7 ملقط | دومون & nbsp ؛ | رقم 7 | |
| شفرة جراحية للريشة | ريشة | رقم 11 | |
| مقبض شفرة جراحية للريشة | ريشة | رقم 3 | |
| جنتاميسين | واكو | 079-02973 | |
| جنتاميسين كبريتات | واكو | 075-04913 | |
| مكمل جلوتاماكس | ثيرمو فيشر 35050061 | ||
| هيبس | دوجيندو | 342-01375 | |
| مصل الحصان ، معطل بالحرارة | 26050088 | علمي | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| KYMOMAKER | http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html | ||
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L5520 | |
| MetaMorph الإصدار 6.2r1 | Metamorph | ||
| Na 2< / sub>HPO4< / sub> | Wako | 197-02865 | |
| NaCl | Wako | 197-01667 | |
| NaHCO3< / sub> | واكو | 191-01305 | |
| 21103049 | |||
| نيكون كسوف TE 2000-E | نيكون | ||
| Nunc Lab-Tek 8 آبار غطاء زجاجي | حراري فيشر 155411 | ||
| بابين | ورثينجتون | LS003126 | |
| بنسلين ستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 15140122 | |
| بولي إل ليسين هيدروبروميد | سيجما ألدريتش | P2636-500MG | |
| قاعدة تريزما | ميرك | T1194-10PAK | يحل بالماء لصنع 0.1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.5) |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً