利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

LC3免疫荧光技术可用于测定胰腺细胞中的自噬水平，能够研究不同干预因素对胰腺细胞自噬的潜在影响。该技术用于检测内源性LC3蛋白，避免了过表达LC3所导致的问题，例如形成与自噬无关的蛋白聚集体。

进行实验操作的是来自玛丽亚·伊内斯·瓦卡罗实验室的博士毕业生费利佩·伦纳（Felipe Renna）和博士生马伦娜·埃雷拉·洛佩斯（Malena Herrera Lopez）。开始细胞准备时，将12毫米圆形盖玻片浸入无水乙醇中。取出盖玻片后，将其垂直放入24孔板中。

将多孔板暴露于紫外辐射下15分钟。然后将盖玻片水平放置，并用DMEM洗涤。现在加入低代次的胰腺细胞，该细胞重悬于含有10% FBS、青霉素和链霉素的DMEM中，孵育细胞两天。

细胞接种后两天，在DMEM中配制浓度为每微升1微克的吉西他滨溶液。随后，将每个孔中的培养基吸取一半至单独的离心管中，加入适量的吉西他滨溶液。再将对应孔的半量培养基重新加回处理孔中，继续培养细胞24小时。

为了固定和通透细胞，将冷甲醇加入含有细胞的24孔板中。同时准备一个含有冷PBS的6孔板。使用注射器针头和镊子取出每一张盖玻片，并在PBS中清洗两次。

然后在甲醇中孵育6分钟。用PBS洗涤两次后，将盖玻片在封闭液中孵育1小时。在封闭液中加入抗LC3抗体，稀释比例为1:1000，并置于冰上保存。

在多孔板盖上覆盖一层实验室密封膜，然后在密封膜上每张盖玻片处加入 25 µL 抗 LC3 溶液。使用注射器针头和镊子，将每张盖玻片放置于一抗液滴上方，确保细胞面与溶液接触。将多孔板放入湿化孵育盒中。

用锡箔纸覆盖，并在冰箱中孵育过夜。第二天，从湿盒中取出多孔板。将盖玻片重新放回多孔板上，用 PBS 洗涤三次。

将荧光标记的抗兔抗体用封闭液按1:800的比例稀释，并在避光条件下冰上保存。密封多孔板盖后，通过密封膜向每张盖玻片上各加入25 µL抗兔抗体溶液。随后按照之前所示方法，用二抗处理盖玻片。

然后将培养板置于湿盒中，室温避光孵育2小时。抗体孵育结束后，用PBS洗涤多孔板上的盖玻片3次。每张盖玻片加入配制好的DAPI溶液，孵育10分钟。

用 PBS 洗涤后，将多孔板置于避光环境中。进行细胞拼接时，准备两个盛有水的烧杯和一张纸。在载玻片上的每张盖玻片上各加入 10 µL PVA-DABCO 溶液。

用水清洗盖玻片，然后在纸巾上晾干。最后将其覆盖在 PVA-DABCO 液滴上，并在避光条件下过夜干燥。

第二天，使用倒置共聚焦显微镜观察标记的细胞并采集图像。采集图像后，将包含各通道图像的文件逐个拖放到 Fiji 界面中。在弹出的对话框中，单击“确定”以打开图像。

然后关闭已打开的控制台窗口。在“图像”选项卡中，选择“颜色”，然后选择“拆分通道”。关闭除LC3图像以外的其他通道对应的图像。

然后在“图像”选项卡中，选择“调整”，接着选择“色彩平衡”。向左移动最大滑块，直到图像达到饱和，以显示细胞轮廓。使用手绘选择工具绘制细胞轮廓，然后单击“重置”以调整颜色。

在“编辑”选项卡中，选择“剪切”以剪切选定的项目，然后在不保存的情况下关闭图像。接着在“编辑”选项卡中选择“粘贴”。在“分析”菜单中，选择工具“3D对象计数器”。

将阈值设为2000，大小过滤范围设为50至500。确保勾选“对象”和“摘要”框，然后点击“确定”。在日志窗口中，检测到的点状结构数量将显示为“检测到的对象”。免疫荧光显示LC3蛋白在细胞内的分布情况，而DAPI则显示胰腺细胞中细胞核的定位。

吉西他滨处理后，LC3 斑点显著增加，表明自噬活性增强。当细胞过度汇合时，外分泌胰腺细胞容易堆积并相互重叠生长。多聚甲醛细胞固定法在保存 LC3 蛋白方面效果不佳，因其无法准确反映 LC3 蛋白的真实分布情况。

若在接种后未等待两天即进行固定或处理，PANC1细胞会呈现圆形。这种形态会降低细胞质与细胞核之间的比例，从而难以判断LC3在细胞内的分布情况。甲醇固定不充分可能干扰LC3的免疫标记，导致图像不清晰和定量结果不理想。

此操作过程中最重要的是，细胞必须用冷甲醇固定六分钟，而不是用多聚甲醛。按照此步骤操作后，可分析LC3与其他蛋白之间的共定位，从而研究与LC3功能相关的不同分子通路。