Name: Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprende a generar células T CAR murinas eficientemente mediante transducción retroviral optimizada. Este protocolo estandarizado mejora la eficiencia en modelos sinfogénicos para estudiar terapias contra tumores sólidos.

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Agradecemos a L. Brockmann por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH 1R01EB030352 y UL1 TR001873.

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad de Columbia, protocolos AC-AABQ5551 y AC-AAAZ4470) utilizando ratones hembras BALB/c o CF57BL/6 de 6-8 semanas de edad con un peso de entre 20-25 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Este protocolo se estructura en torno a los "días posteriores a la activación" de las células T murinas, y la producción viral comienza en el día -2. El retrovirus puede almacenarse a -80 °C después de la producción inicial, y para el uso futuro de este protocolo, se puede comenzar con el paso 2, aislamiento y activación de células T en el día 0.
1. Producción de vectores retrovirales
NOTA: Los productos virales se han convertido en replicación defectuosa mediante la separación de los genes de empaquetamiento en dos plásmidos separados (ver Tabla de Materiales), lo que reduce en gran medida la probabilidad de eventos de recombinación y la producción inadvertida de virus competentes para la replicación.
<ol><li>Prepare las celdas Phoenix Eco un día antes de la transfección (procedimiento del día -2).<ol><li>Colocar aproximadamente 1 x 107 células en una placa tratada con TC de 15 cm o en un matraz de cultivo T150, utilizando 30 ml de medio de cultivo (medio de cultivo Phoenix Eco, como se detalla en la Tabla 1).</li>
		<li>Incubar durante la noche a 37 °C. Después de 18-24 h, las células deben estar aproximadamente en un 70% confluentes y distribuidas uniformemente para garantizar un alto rendimiento viral sin crecimiento excesivo. NOTA: Para obtener resultados óptimos, use células con un paso bajo y páselas el día antes de la siembra para la producción viral. No permita que las células Phoenix Eco crezcan demasiado durante el cultivo de rutina.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare la mezcla de transfección que contiene los reactivos de lipofección y potenciadores, pCL-Eco (Gag/Pol) y plásmido de expresión de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) en medios de suero reducido (ver Tabla de Materiales) (procedimiento del Día -1). NOTA: La cotransfección debe realizarse en una proporción de 1:1 de pMSCV y pCL-Eco.<ol><li>Preparar el tubo A: Diluir 105 μl del reactivo de transfección en 3,75 ml de medio sérico reducido por placa de 15 cm y mezclar bien mediante vórtice o pipeteo hacia arriba y hacia abajo.</li>
		<li>Preparar el tubo B: Diluir el plásmido de expresión de pMSCV (21 μg) y pCL-Eco (21 μg) con 90 μL de reactivo potenciador en 3,75 mL de medio sérico reducido por placa de 15 cm. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. NOTA: Si genera varios productos virales, configure una mezcla maestra que contenga pCL-Eco y el reactivo potenciador.</li>
		<li>Agregue el tubo A al tubo B y mezcle bien pipeteando. Incubar durante 10-20 min a temperatura ambiente, lo que da como resultado un volumen total de aproximadamente 7,5 mL.</li>
		<li>Retire con cuidado 10 ml de medios de cultivo celular de la(s) placa(s) Eco Phoenix y agregue todo el volumen de la mezcla de transfección a los medios restantes inclinando la placa y pipeteando gota a gota. Devolver las células a una incubadora a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambie el medio en las células Phoenix Eco transfectadas 16-20 h después de la transfección (procedimiento del día 0).<ol><li>Precalentar el suero y el medio de células T murinas libres de β-mercaptoetanol (2-ME, véase la Tabla de materiales) (cosecha viral de mTCM, como se indica en la Tabla 1) a 37 °C utilizando un baño de agua o perlas.</li>
		<li>Retire con cuidado el medio de cultivo Phoenix Eco inclinando la placa y colocando la punta de la pipeta en la esquina inferior, utilizando una aspiradora si es posible. Evite secar demasiado las celdas.</li>
		<li>Agregue suavemente el medio de cosecha mTCM-viral calentado al costado de la placa inclinada pipeteando 30 ml en la configuración más lenta. Devolver las células a una incubadora a 37 °C. NOTA: Este paso puede hacer que las células Phoenix Eco se desprendan de la placa y reduzcan los títulos virales. Los medios precalentados y el pipeteo suave minimizarán las interrupciones.</li>
	</ol></li>
	<li>Cosechar el sobrenadante viral 48 h después de la transfección (procedimiento del día 1).<ol><li>Recolectar el sobrenadante viral y filtrarlo a través de filtros de PVDF de 0,45 μm (ver Tabla de materiales) para eliminar las células y los desechos. Alícuota y congele el virus a -80 °C o continúe directamente con el día 1 del paso 3 si usa virus nuevo.</li>
		<li>Determinar el título viral (unidades de transducción/mL) por citometría de flujo, como se describió anteriormente9. Este paso es opcional.<ol><li>Determinar el título viral mediante transducción a pequeña escala de 1 x 105 células T murinas activadas en placas de 96 pocillos tratadas sin cultivo de tejidos (CT), prerrecubiertas con retronectina (ver Tabla de materiales) y cargadas con diluciones en serie triples de sobrenadante retroviral en un volumen final de 100 μL de medio de recolección viral mTCM. NOTA: Consulte los pasos 2 y 3 a continuación para obtener instrucciones detalladas sobre el aislamiento, la activación y la transducción de células T.</li>
			<li>Determinar la expresión de la superficie de CAR 4-5 días después de la transducción mediante citometría de flujo.</li>
			<li>Calcule el título viral de acuerdo con la fórmula10: (N x F x D)/V, donde N es el número de células transducidas, F es la frecuencia de células CAR-positivas, D es el factor de dilución y V es el volumen de transducción en mL para obtener unidades de transducción (TU)/mL. NOTA: El título viral puede disminuir al congelar/descongelar; Por lo tanto, el título viral se determina idealmente en virus congelados y posteriormente descongelados.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Aislamiento de células T murinas
<ol><li>Aislar y activar las células T murinas (procedimiento de día 0). NOTA: Estos pasos se pueden realizar a temperatura ambiente (RT) o 4 °C y deben llevarse a cabo en un ambiente estéril.<ol><li>Recolectar el (los) bazo(s) de la cepa de ratón de interés (p. ej., Balb/c, C57BL/6) como se describió anteriormente11 y obtener una suspensión unicelular a través de la disociación mecánica.</li>
		<li>Con la parte posterior de una jeringa estéril, triture el bazo a través de un colador de células de 70-100 μm en un tubo cónico de 50 ml.</li>
		<li>Después de dejar la jeringa a un lado, lave el colador con 5 ml de tampón de aislamiento de células T (solución salina tamponada con fosfato, PBS, suplementada con suero fetal bovino al 2%, FBS).</li>
		<li>Repita el paso de maceración y lave el colador una vez más con 5 ml de tampón de aislamiento de células T. Lleve el volumen final a 50 ml con un tampón de aislamiento de células T.</li>
		<li>Cuente las células vivas con un hemocitómetro manual o un contador automático de células diluyendo en una proporción de 1:20 y luego mezclando a 1:1 con azul de tripán.</li>
		<li>Granular las células por centrifugación durante 10 min a 450 x g, a 4 °C (o RT), y volver a suspender los espleenocitos a 1 x 108/mL si se utiliza el kit de aislamiento de linfocitos T recomendado (ver Tabla de materiales). NOTA: Los espleenocitos se pueden volver a tensar a través de un colador de 40-70 μm en esta etapa para eliminar los grumos.</li>
	</ol></li>
	<li>Aísle las células T CD3+ por selección negativa siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Después de la separación magnética, transfiera el aislado a un tubo cónico de 15 ml y realice un recuento final de células vivas.</li>
	<li>Granular los linfocitos T aislados por centrifugación durante 10 min a 450 x g, a 4 °C (o RT), y volver a suspenderlos a 1 x 106/mL en medio de activación mTCM (Tabla 1).</li>
	<li>Activar los linfocitos T mediante la adición de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos monoclonales anti-CD3/anti-CD28 murinos (ver Tabla de materiales) en una proporción de 25 μL/1 x 106 linfocitos T y 100 U/mL de IL-2.</li>
	<li>Coloque las células en una incubadora a 37 °C y déjelas toda la noche. NOTA: Debido al pequeño tamaño de las células T, se puede lograr un recuento más preciso de células T vivas diluyendo en una proporción de 1:10-1:20 y mezclando a 1:1 con azul de tripano para el recuento manual con un hemocitómetro. La pureza puede determinarse mediante citometría de flujo tiñendo células con un anticuerpo αCD3 conjugado con fluorescencia. Cada bazo producirá entre 7-10 x 106 células T, dependiendo de la edad y la cepa del ratón.</li>
</ol>3. Transducción de células T murinas
<ol><li>Preparar las placas para la transducción (procedimiento del día 0).<ol><li>Recubrir previamente placas estériles de 24 pocillos no tratadas con 0,5 ml de reactivo potenciador de la transducción de fibronectina humana (véase la tabla de materiales) a una concentración final de 20-40 μg/ml diluyéndolas en PBS estériles y almacenarlas a 4 °C durante la noche. NOTA: Este paso también se puede realizar el día 1 recubriendo placas de 24 pocillos no tratadas con el reactivo de transducción e incubándolas a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice la transducción de células T (procedimiento del día 1).<ol><li>Prepare la placa prerrevestida para la transducción. Retire el reactivo de transducción de cada pocillo de la placa de 24 pocillos prerrevestida y bloquee con un volumen equivalente de PBS filtrado estéril + albúmina sérica bovina (BSA) al 2% (0,5 ml) durante 30 min a RT.</li>
		<li>Lavar una vez con 0,5-1 ml de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir 0,5-1 ml de retrovirus puro del paso 1 o diluido en función del título viral a cada pocillo prerrecubierto y centrifugar durante 90 min a 2.000 x g y 32 °C.</li>
	<li>Añadir 1 ml de células T activadas a cada pocillo cargado de virus y centrifugar durante 10 min a 450 x g y 32 °C. Regrese las células a una incubadora a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>24 h después de la transducción, retire 1-1,5 mL de medio de cultivo celular y reemplácelo con 1-1,5 mL de mTCM-completo y 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes (ver Tabla de Materiales). Devolver las células a una incubadora a 37 °C (procedimiento del día 2). NOTA: Durante el cultivo ex vivo , se deben agregar 10 ng/mL de citocinas al cultivo cada 48 h, y las células T no deben diluirse más allá de 1 x 106/mL.</li>
	<li>48 h después de la transducción, transfiera las células de la placa de transducción a una placa nueva de 24 o 6 pocillos y devuelva las células a una incubadora a 37 °C (procedimiento del día 3). NOTA: La viabilidad de las células T puede mejorar mediante la transferencia de células entre 24 h y 2 días después de la transducción, dependiendo de la viabilidad inicial de las células T y del título viral.</li>
	<li>Retire las células T y confirme la expresión de CAR (procedimiento de los días 5-6).<ol><li>Vuelva a suspender completamente las células para disociar las células T activadas de las perlas recubiertas de αCD3/CD28 (consulte la Tabla de materiales) y coloque la suspensión celular en un imán durante 30 s. Transfiera la suspensión celular al recipiente de cultivo ex vivo deseado y devuélvala a una incubadora a 37 °C. NOTA: Las células T se pueden cultivar en matraces de cultivo o placas de cultivo de pocillos profundos. Se recomienda sembrar un mínimo de 5 x 10células T de 6 en 30 mL de medio mTCM-completo por pocillo en un pocillo profundo de una placa de formato de 6 pocillos (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Determinar la expresión de CAR mediante citometría de flujo8. NOTA: La expresión de GFP-CAR se determinó mediante incubación con 100 ng/mL de GFP purificado. La incorporación de una etiqueta de epítopo N-terminal facilitará la detección de construcciones alternativas de CAR.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar cultivo ex vivo de células CAR-T (procedimiento del día 7-10).<ol><li>Durante el cultivo ex vivo , mantener las células retirando el 50% del medio de cultivo y sustituyéndolo por mTCM completo + 2x 10 ng/ml de IL-7 e IL-15 cada 48 h. NOTA: Las células CAR-T murinas están listas para su uso en aplicaciones posteriores 7 días después de la activación y no deben criopreservarse debido a la mala viabilidad después de la descongelación.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocolo optimizado para la generación de células CAR-T de ratón en modelos singénicos

<ol><li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li>
<li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li>
<li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li>
<li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).</li>
<li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li>
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<li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).</li>
<li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li>
<li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299(2021).</li>
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<li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li>
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<li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Este protocolo describe los pasos y reactivos necesarios para la transducción retroviral de células T murinas para generar células CAR-T para estudios in vivo . La optimización de las condiciones de transducción retroviral logra una expresión robusta de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de ultracentrifugación o reactivos adicionales. Sin embargo, existen múltiples modificaciones que se pueden aplicar a esta metodología.
Si bien este protocolo describe el ejemplo de generación de un CAR específico de GFP, estos métodos se pueden adaptar para generar células CAR-T de ratón dirigidas a cualquier antígeno extracelular de interés. El vector retroviral pMSCV_PGK utilizado en este estudio permite la liberación eficiente de la secuencia de nanocuerpos específicos de GFP mediante digestión enzimática con NotI y BamHI y puede reemplazarse con un dominio de reconocimiento de antígenos definido por el usuario, como un scFv, un nanocuerpo o un dominio de unión a ligandos (Archivo suplementario 1). Para facilitar la evaluación de la expresión alternativa de CAR, se recomienda diseñar CAR con una etiqueta de epítopo N-terminal, como las etiquetas Myc (EQKLISEEDL) o Flag (DYKDDDDK), que pueden detectarse utilizando anticuerpos conjugados fluorescentes12. Además, el presente estudio demuestra la producción de un solo transgén; sin embargo, la incorporación de péptidos autoescindidos (secuencias 2A) o sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) permitiría la coproducción de múltiples transgenes, incluyendo tecnologías adicionales para mejorar la función de las células T in vivo 8,13,14.
A pesar de que este protocolo fue desarrollado para eliminar la necesidad de equipos especializados al omitir la ultracentrifugación (24.000 x g, 2 h, 4 °C), vale la pena señalar que la concentración del sobrenadante viral puede lograr títulos virales más altos y reducir el volumen de virus requerido para lograr una alta expresión de CAR8. Además, este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales al lograr títulos virales reproduciblemente altos (~ 2 x 107 TU/mL) y una expresión constante de CAR sin la necesidad de determinar el título viral antes de su uso. Sin embargo, además de facilitar la estandarización, la determinación del título viral antes de la transducción de linfocitos T también puede aumentar la viabilidad de los linfocitos T al reducir la toxicidad potencial causada por concentraciones virales innecesariamente altas10,15.
Se recomienda la suplementación con IL-7 e IL-15 para promover la expansión de las células T y preservar las poblaciones de memoria de las células T; sin embargo, la IL-2 humana recombinante puede utilizarse como alternativa para disminuir el número de reactivos necesarios para el cultivo ex vivo 16,17,18,19. No obstante, los métodos para la generación de células CAR-T descritos aquí siguen estando limitados por la expansión relativamente pobre de las células T murinas. Sin embargo, las medidas para mejorar la viabilidad de las células T discutidas anteriormente podrían mejorarse aún más mediante la inclusión de suplementos adicionales y 2-ME en el medio de cultivo mTCM a lo largo del proceso de transducción20. Si bien estas modificaciones pueden mejorar la expansión de las células T de 15 veces a 20 veces20, pueden dar lugar a una menor eficiencia de transducción y a una menor expresión de CAR.
En última instancia, la producción de células CAR-T murinas permite el desarrollo de modelos singénicos para evaluar la función de las células CAR-T dentro de un sistema inmunitario intacto, lo que facilita una evaluación específica del contexto de su potencia, durabilidad y seguridad. Mientras que los modelos en ratones inmunodeficientes permiten importantes estudios preclínicos de un producto de células T humanas dirigido a un antígeno tumoral humano. La combinación de estos sistemas modelo complementarios será indispensable para comprender la complejidad de la biología de las células CAR-T, optimizar nuevos diseños de CAR y, en última instancia, traducir los hallazgos preclínicos en terapias clínicas efectivas.

Las terapias adoptivas de células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia contra el cáncer al aprovechar el poder del sistema inmunitario adaptativo para atacar y eliminar específicamente las células cancerosas con antígeno positivo1. Si bien el éxito de las terapias de células CAR-T dirigidas a las neoplasias malignas de células B ha sido validado clínicamente, los estudios preclínicos realizados en modelos animales siguen siendo vitales para el desarrollo de nuevos CAR dirigidos a tumores sólidos. Sin embargo, hasta el momento se ha demostrado una eficacia clínica limitada en las indicaciones de tumores sólidos, y cada vez es más evidente que los modelos preclínicos individuales no predicen con precisión la farmacodinámica y la eficacia clínica de un medicamento vivo 2,3. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a ampliar el estudio preclínico de los productos de células CAR-T para incluir evaluaciones paralelas en modelos de xenoinjertos y singénicos de cánceres humanos y murinos, respectivamente.
A diferencia de los modelos de xenoinjertos, en los que los tumores humanos y las células T se injertan en ratones inmunodeficientes, los modelos singénicos permiten examinar las respuestas de las células CAR-T en el contexto de un sistema inmunitario funcional. Específicamente, los ratones inmunocompetentes portadores de tumores singénicos proporcionan un sistema para estudiar la interacción entre las células T transferidas adoptivamente y los entornos específicos del contexto, incluidos los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células T reguladoras (Treg) que se sabe que suprimen la función de las células T en el microambiente tumoral (TME)4,5,6. Además, los modelos singénicos ofrecen una plataforma adicional para evaluar la toxicidad en el objetivo, fuera del tumor y la interacción de las células CAR-T con los factores del huésped que pueden conducir a toxicidades adicionales, incluido el síndrome de liberación de citocinas7.
A pesar de estas ventajas, el número de estudios de células CAR-T singénicas sigue siendo limitado. En particular, los modelos singénicos requieren ingeniería autóloga de células CAR-T de la misma cepa de ratón y, por lo tanto, presentan un desafío adicional debido a la falta de metodología para la transducción eficiente de células T murinas y la expansión ex vivo 2,8. Este protocolo describe los métodos para lograr una expresión estable de CAR a través de la producción de vectores retrovirales y la transducción optimizada de células T. En la Figura 1 se muestra un esquema de todo el proceso. El uso de este enfoque demuestra la transducción retroviral eficiente de células CAR-T murinas y el logro de una alta expresión de CAR sin la necesidad de concentración viral a través de la ultracentrifugación. Se discuten estrategias para cambiar la especificidad antigénica de la construcción CAR, además de la coexpresión de transgenes adicionales.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m filtros</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-408-135</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 mL&nbsp;</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m colador</td><td>Corning</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>15 cm TC placas de cultivo celular tratadas</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>130183</tr><tr><td>tubos cónicos de 15 mL&nbsp;</td><td>Halcón</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M colador&nbsp;</td><td>Corning</td><td>07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL&nbsp;</td><td>Halcón</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro</td><td>Corning</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Citómetro de flujo&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C, 6-8 semanas de edad&nbsp;</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>GOLDBIO</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medio</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco, sin calcio ni magnesio;</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Imán&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12-321-D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse T Kit de aislamiento</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>Tampón FACS&nbsp;</td><td>BD</td><td>BDB554657</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex6</td><td>Wilson Wolf</td><td>80240M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón HEPES&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 recombinante humano&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-748</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 recombinante humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-363</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD3 BV421</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11-453-D</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD4 BV605</td><td>BD</td><td>563151</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD44 APC&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>103011</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD62L PE-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 60-0621-U025</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-CD8 APC-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 25-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2 con cámara Prime 95B&nbsp;</td><td>Placas de 24 pocillos sin tratar de Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31-985-062</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15-070-063</td><td></td></tr><tr><td>Células Phoenix Eco</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>pMDG.2</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV_PGK_GFP28z</td><td>N/A</td><td>Producido por R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>SfGFP PURIFICADO</td><td>N/A</td><td>producido por R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin ('reactivo de transducción')</td><td>Takara Bio</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10</td><td>mL Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 25 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 5 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11-360-070</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos tratadas con TC&nbsp;</td><td>Corning</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

generación eficiente de células t con receptor de antígeno quimérico (car) murino

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Las terapias celulares diseñadas que utilizan células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han logrado una eficacia notable en individuos con neoplasias malignas hematológicas y actualmente están en desarrollo para el tratamiento de diversos tumores sólidos. Hasta ahora, la evaluación preliminar de nuevos productos de células CAR-T se ha llevado a cabo predominantemente en modelos tumorales de xenoinjertos utilizando ratones inmunodeficientes. Este enfoque se elige para facilitar el injerto exitoso de células CAR-T humanas en el entorno experimental. Sin embargo, los modelos de ratón singénicos, en los que los tumores y las células CAR-T se derivan de la misma cepa de ratón, permiten evaluar nuevas tecnologías de CAR en el contexto de un sistema inmunitario funcional y un microambiente tumoral integral (TME). El protocolo descrito aquí tiene como objetivo agilizar el proceso de generación de células CAR-T de ratón mediante la presentación de métodos estandarizados para la transducción retroviral y el cultivo ex vivo de células T. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones de CAR más allá de las utilizadas en este estudio para permitir la evaluación rutinaria de nuevas tecnologías de CAR en sistemas inmunocompetentes.

El protocolo descrito aquí tiene como objetivo estandarizar el proceso de transducción de células T murinas para la generación de células CAR-T de ratón. La Figura 1 proporciona una descripción detallada de los pasos involucrados. El proceso comienza con la producción de vectores retrovirales a través de la co-transfección de componentes virales en células Phoenix Eco. La Figura 2 proporciona una imagen de la densidad óptima de las células Phoenix Eco el día de la transfección. A continuación, las células T aisladas se activan 24 h después de la transfección, o "Día 0" de este protocolo, en preparación para la transducción del día 1. Después de la transducción, las células CAR-T se cultivan en presencia de IL-7 e IL-15 humanas recombinantes para lograr una expansión de pliegues suficiente mientras se preservan las poblaciones de memoria de células madre.
El uso del kit de aislamiento de linfocitos T murinos recomendado (ver Tabla de materiales) con este protocolo produce purezas de linfocitos T del &lt;98% antes de la transducción, según lo determinado por citometría de flujo (Figura 3A). Además, se pueden lograr tasas de expresión de CAR reproducibles del 65%-75% utilizando este protocolo y el vector retroviral pMSCV modificado para expresar la construcción de CAR a partir de un promotor de PGK (Figura 3B,C). La determinación del título retroviral revela títulos de hasta ~2 x 107 TU/mL y una expresión de CAR del 74% con 1/3 del sobrenadante viral recolectado después de la co-transfección de pMSCV con pCL-Eco (Figura suplementaria 1).
Finalmente, el cultivo ex vivo con 10 ng/mL de IL-7 e IL-15 conduce a una expansión de aproximadamente 15 veces, lo que da como resultado ~150 x 106 células T para el día 10 después de la activación de un solo bazo (Figura 3D). El cultivo con IL-7 e IL-15 conduce a frecuencias comparables de linfocitos T CD8+ y CD4+ (Figura 3E) y poblaciones de memoria de células madre preservadas determinadas por la expresión de CD62L+CD44- después de 10 días de cultivo ex vivo (Figura 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del protocolo. Panel superior: Una descripción general esquemática de la línea de tiempo del protocolo. Panel inferior: Instrucciones paso a paso para la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T de ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig02.jpg"> Figura 2: Densidad celular óptima para la transfección. Imagen de microscopía de campo claro de células Phoenix Eco a la densidad óptima antes de la transfección con pMSCV y pCL-Eco. Capturado con un objetivo de 10x. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig03.jpg"> Figura 3: Producción de células CAR-T murinas y cultivo ex vivo. (A) Gráfico de citometría de flujo que muestra la frecuencia de células CD3+ BALB/c después del aislamiento de células T murinas. (B) Representación esquemática del vector retroviral pMSCV utilizado para la expresión de GFP-CAR en células T murinas. (C) Histogramas de citometría de flujo que demuestran la expresión de la superficie de CAR en células T de ratón después de la incubación con sfGFP purificado. UT, sin transducir. (D) Expansión de pliegues de las células CAR-T en el día 10 después de la activación y cultivo con IL-17 e IL-15 humanas recombinantes. Aproximadamente 8 x 106 células T murinas se activaron antes de la transducción y alcanzaron aproximadamente 1,28 x 108 en el día 10 después de la activación. (E) Gráfico de citometría de flujo que muestra la frecuencia de células CAR-T CD8+ y CD4+ en el día 10 después de la activación. (F) Gráfico de citometría de flujo que demuestra la frecuencia de las poblaciones de memoria de células T CD8+ determinadas por la expresión de superficie de CD62L y CD44. La memoria de células madre (TSCM) se caracteriza por CD62L+CD44-, la memoria central (MTC) por CD62L+CD44+ y la memoria efectora (TEM) por CD62L-CD44+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Formulación de medios de cultivo celular. Los detalles de la formulación de los medios de cultivo celular utilizados en el protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Figura complementaria 1: Expresión superficial de CAR y títulos retrovirales. (A) Histogramas de citometría de flujo que muestran la expresión de la superficie de CAR en las células T BALB/c después de la incubación con sfGFP purificado. El retrovirus se generó mediante la transfección de células Phoenix Eco con pMSCV_PGK_mGFP28z en combinación con pCL-Eco y pMD2.G (I), pCL-Eco (II) o solo (III). Las células T se transducieron con retrovirus diluido según lo indicado. (B) Títulos retrovirales determinados por la expresión de la superficie de CAR de las células T transducidas. Las unidades de transducción (TU)/mL se calcularon mediante la fórmula: (N∙F∙D)/V, donde N es el número de células transducidas (1 x 105), F es la frecuencia de células CAR+ , D es el factor de dilución y V es el volumen de transducción en mL (0,2 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: secuencia vectorial de expresión pMSCV. La secuencia del CAR GFP28z y las secuencias flanqueantes (cursiva) en el vector de expresión pMSCV, con los sitios de las enzimas NotI y BamHI resaltados en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

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