Name: Van MEF op I Matrigel: passage hESC s in de aanwezigheid van MEFs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer de kweek van humane embryonale stamcellen op muizembryofibroblasten en in feeder-vrije omstandigheden met matrigel. Deze methode behoudt pluripotentie en is essentieel voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.

Splitsen van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) uitgeplaat op muis embryonale fibroblasten (MEF) Meestal een confluente hESC plaat kan worden gesplitst 1u06-01u10, afhankelijk van de specifieke hESC lijn. De splitsing plaat zal weer samenvloeiing 5-7 dagen na het splitsen. <ol><li> Twee dagen voor de splitsing, gelatineren platen met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing. Voor een 6-wells plaat, voeg 2 ml in elk putje en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator &#39;s nachts. </li><li> Plaat MEF op ontsloten 6-well platen de dag voordat u van plan op de splitsing van de hESC &#39;s. (NB: MEFs kunnen worden uitgeplaat zoveel als drie dagen eerder, indien nodig na ~ 3 dagen, MEFs worden vlakker en meer verspreid-out en kan niet in stand hESC &#39;s en frisser MEFs kunnen..) Neem een ​​flesje van de g-bestraald of mitomycine C die werden behandeld CF1 MEFs, met 5-6 x 10 6 cellen, uit vloeibare stikstof en ontdooien gedurende 2 minuten in een 37 ° C waterbad. Een keer wassen cellen met warm MEF Cultuur Media in een 50 ml Falcon buis en resuspendeer in het uiteindelijke volume van de warme MEF Cultuur Media. Op 5-6 x 10 6 cellen, is dit voldoende om bord twee of drie 6-well platen. </li><li> Terwijl de MEF wordt gewassen, neem de gegelatineerd borden, verwijder alle oplossing uit de putten en voeg 2,5 ml van MEF Cultuur Media per well. </li><li> Voeg 0,5 ml van MEF suspensie per goed te bereiken 3 ml als een laatste volume in elk putje. Zorg ervoor dat MEF zijn gelijkmatig verspreid en terug te plaatsen borden in de incubator &#39;s nachts om zich te vestigen. </li><li> Op de dag van hESC te splitsen, voor te bereiden vers of gebruik &lt;2 weken oude steriele collagenase IV oplossing bij 1mg/ml. Verwijder al het papier uit de hESC bronnen u wilt splitsen, een keer wassen met 2 ml per putje van de warme 1 × PBS, pH 7,4, en voeg 1 ml collagenase IV oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. Neem de 6-well hESC plaat uit de incubator en voeg 1 ml van ES media (zonder bFGF) aan elk putje. Met behulp van de oplossing in elk putje, met een 1 ml pipet opzuigen van de media en blaas de stamcellen af ​​van de plaat. Voor elke goed deze duurt ongeveer 5 tot 10 herhalingen. Dan overdracht van de geschorste hESC &#39;s in een 50 ml falcon buis. Doe dit voor al de putten, die splitsen en combineren in een 50 ml falcon buis. Pellet de hESC &#39;s bij kamertemperatuur op 200 g gedurende 5 minuten en was een keer met ES media ontbreekt bFGF. </li><li> Terwijl de hESC &#39;s worden gewassen, neem de MEF borden, verwijdert u alle media uit de wells en was een keer met steriel, warm 1 × PBS, pH 7,4 voeg vervolgens 2,5 ml van ES media (nu aangevuld met 10 ng / ml bFGF) per goed. </li><li> Resuspendeer de gepelleteerde hESC &#39;s in een geschikt volume van ES media, aangevuld met 10ng/ml bFGF. (LET OP:.. Als de hESC &#39;s zijn geresuspendeerd, ze moeten van ongeveer uniform kolonie grootte en vorm De resuspensie volume is afhankelijk van de splitsing ratio) voorzichtig pipet de hESC vering op en neer een paar keer om de kolonies kleinere en meer uniforme, maar niet zo veel, dat enkele cellen of zeer kleine kolonies worden gegenereerd. Voeg 0,5 ml van hESC suspensie per goed aan de MEF platen tot 3 ml bereiken als een uiteindelijk volume in elk putje. Een visuele controle om ervoor te zorgen dat de hESC &#39;s gelijkmatig worden verdeeld voor het plaatsen van de borden terug in de incubator&#39; s nachts om zich te vestigen. Na plating, zal het meestal een paar dagen voor de kolonies te nemen op hun karakteristieke vorm en de grens uiterlijk. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. In de laatste stap vóór plating, wanneer de hESC &#39;s zijn geresuspendeerd, moeten zij worden van ongeveer uniform kolonie grootte en vorm. Voorzichtig pipet de hESC vering op en neer een paar keer om de kolonies kleiner en meer uniform, maar niet zo veel, dat enkele cellen of zeer kleine kolonies zijn generated.Immunofluorescence vlekken en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoal...

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagens</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagens</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline / Streptomycine </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagens</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 antilichaam</td><td>Reagens</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;erythrine-geconjugeerd muis IgG3</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-konijn IgG</td><td>Reagens</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

van mef op i matrigel: passage hesc &#39;s in de aanwezigheid van mefs

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen.

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

Deze video demonstreert hoe menselijke embryonale stamcellen (hESCs) gekweekt kunnen worden op voedercellen van embryonale fibroblasten van muizen (MEF).

Vanwege hun aanzienlijke potentieel in de regeneratieve geneeskunde wordt er steeds meer aandacht besteed aan de biologie en manipulatie van menselijke embryonale stamcellen. In deze video laten we u zien hoe u menselijke embryonale stamcellen kunt kweken en onderhouden in een pluripotente staat met behulp van feeder-cellen van embryonale fibroblasten van muizen, en in feeder-vrije condities op Matrigel. Hallo, ik ben Jinjiang van een laboratoriummicrotitel in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde aan de University of California Los Angeles.Vandaag laten we u een procedure zien voor het kweken van menselijke embryonale stamcellen op muis embryonale fibroblasten, bloedvoedercellen en in voeder-vrije omstandigheden op Matrigel. Deze procedure omvat het voorbereiden van muis embryonale fibroblastcellen, het genereren van geconditioneerd medium voor groei op Matrigel, en het voorbereiden van Matrigel-platen en massa's voor het voeden en laten groeien van menselijke embryonale stamcellen over een bepaalde periode. Laten we beginnen.Om de kweekprocedure te starten, worden menselijke embryo-achtige stamcellen geplaat op muizenembryonale fibroblasten of mes. We beginnen met con

from-mefs-to-matrigel-i-passaging-hescs-in-the-presence-of-mefs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.

Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC &#39;s van MEFs op Matrigel

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 3 van 3.

Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC &#39;s Matrigel op Matrigel

Geregisseerd differentiatie van hESC 's in de specifieke cellen heeft gegenereerd veel belangstelling voor regeneratieve geneeskunde. Wij bieden een beknopte, stap-voor-stap protocol voor het bepalen van...

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Leer de kweek van humane embryonale stamcellen op muizembryofibroblasten en in feeder-vrije omstandigheden met matrigel. Deze methode behoudt pluripotentie en is essentieel voor regeneratieve geneeskunde.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC 's in de aanwezigheid van MEFs

Meer video's verkennen