Non invasiva In Vivo Piccoli Animali MRI e MRS: Basic procedure sperimentali

Biology

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Summary

Questo lavoro descrive le procedure di base della risonanza magnetica non invasiva animali piccoli e MRS

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Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures. J. Vis. Exp. (32), e1592, doi:10.3791/1592 (2009).

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Abstract

Piccoli animali risonanza magnetica (MR) la ricerca è emerso come un elemento importante della moderna ricerca biomedica a causa della sua natura non invasiva e la ricchezza di informazioni biologiche che fornisce. MR non richiede alcuna radiazioni ionizzanti e non invasivo in grado di fornire una risoluzione maggiore e migliore rapporto segnale-rumore in confronto ad altri tomografiche o modalità spettroscopica. In questo protocollo, ci concentreremo su piccoli animali RM e spettroscopia RM (MRI / MRS) per l'acquisizione non invasiva relax ponderata

Protocol

Parte 1: Sicurezza Magnete

Sia MRI e MRS usare un forte campo magnetico, che richiede estrema cautela. Ad esempio, il 4,7 T strumento che abbiamo usato per il presente lavoro ha un campo magnetico circa 90.000 volte il campo magnetico terrestre. Il campo magnetico è sempre, anche quando lo scanner RM non è in uso. Oggetti metallici che entra in contatto con un campo magnetico ad alta sarà fortemente e rapidamente attratto dalla calamita. E 'estremamente pericoloso se un soggetto sperimentale o operatore si trova nel percorso del proiettile di un oggetto metallico volare nel magnete. Pertanto, il personale che condurre esperimenti MR deve fare attenzione a rimuovere oggetti metallici dai loro vestiti prima di entrare nella vicinanza dello strumento e anche mantenere l'ambiente circostante libero da tali oggetti. Informazioni più dettagliate sulla sicurezza magnete appare nella letteratura 1 e la seguente pagina web: http://www.imrser.org/ . La presenza di materiale metallico non può che causare il problema di sicurezza di cui sopra, ma interferiscono con i risultati sperimentali inducendo immagini / artefatti spettroscopiche. Il presente materiale metallico vicino o dentro l'oggetto di imaging possono alterare il campo magnetico in prossimità e quindi generano artefatti sulle immagini acquisite o ampliare la larghezza di riga degli spettri.

Di conseguenza, lasciare portafogli, chiavi, penne, ecc al di fuori del magnete se trattare gli animali per le procedure di MR.

Parte 2: In Vivo MRI del mouse in un magnete orizzontale Alesaggio

Preparazione degli animali per la risonanza magnetica

  1. Tutte le procedure animale deve essere approvato dalla cura degli animali e il comitato istituzionale uso (IACUC) prima di eseguire qualsiasi tipo di trattamento degli animali.
  2. Noi usiamo vaporizzato isoflurano per anestetizzare gli animali per esperimenti di risonanza magnetica. Anestesia degli animali può essere raggiunto da altri anestetici come Avertin (2,2,2-tribromoethanol o TBE) e un cocktail di ketamina e xilazina. Informazioni sul dosaggio di ogni anestetico si trova nella tabella 1.
  3. Linea di una camera di induzione con plastica tampone assorbente sostenuta (blu o pad mandrino). Posizionare un mouse (o più topi per il multi-mouse imaging) nella camera di induzione.
  4. Regolare il flussimetro del vaporizzatore per isofluorano 0,8 1,5 L / min. Quindi regolare il vaporizzatore isoflurano al 4% per circa 2 3 minuti.
  5. Dopo aver raggiunto il piano chirurgico di anestesia (cioè nessuna risposta pizzico tep), posizionare il mouse su un supporto animale con il naso inserito in un cono (o maschera). Un dispositivo di immobilizzazione testa può essere utilizzata per l'imaging testa e un supporto del corpo può essere utilizzato per l'imaging del corpo.
  6. Detentori degli animali sono usati per impedire il movimento potenziale: ci sono diversi tipi di supporti commerciali. Inoltre, un supporto progettato su misura possono essere fabbricati per soddisfare esigenze speciali di un apparato sperimentale. Per un supporto personalizzato, assicurarsi di utilizzare solo materiale non magnetico.
  7. Durante il periodo delle immagini, regolare il misuratore di portata a 0,4 0,8 ml / min e ridurre il vaporizzatore per isofluorano 1,2 1,5%. Il gas è scaduta proveniente dal cono del mouse viene raccolto da una pompa e rimosso in un in-house vuoto.
  8. Gli occhi dell'animale sarà tenuto umido con un unguento sterile lubrificazione dell'occhio. L'animale sarà mantenuto a 35-37 ° C durante l'esperimento all'interno di un sistema di circolazione dell'acqua calda. Altri tipi di fonte di calore può essere utilizzato come pad di riscaldamento e aria calda soffiata nel (RF) bobina a radiofrequenza.
  9. Un sistema di monitoraggio degli animali è in atto per monitorare la temperatura corporea, la respirazione / ciclo cardiaco, la respirazione e la sincronizzazione / gating cardiaco con acquisizioni di immagini.
  10. Un campione standard in agarosio si trova accanto all'animale per monitorare il cambiamento brusco del segnale. Questo esempio agar standard è particolarmente utile per il multi-slice e multi-imaging in tempo punto. Quando un segnale inaspettato cambiamento viene rilevato in una fetta dalle immagini acquisite, la fetta con la variazione del segnale inaspettato può essere eliminato. Inoltre, la sua intensità del segnale può essere regolato in base al cambiamento del segnale del campione standard durante la post-analisi delle immagini.
  11. Dopo la messa in sicurezza degli animali e dei componenti il ​​monitoraggio sul supporto degli animali, la posizione del detentore degli animali al centro di una bobina RF.
  12. Spostare la bobina RF alla sala magnete e inserire la bobina RF nel sistema di circolazione dell'acqua calda posto all'interno del magnete. La Figura 2 mostra alcune componenti di uno scanner MRI osservato dalla parte anteriore del magnete.

Esperimento MRI

  1. Sintonizzare la bobina RF alla frequenza di risonanza 1 H e abbinare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il pannello messa nello scanner MR. Questo per ottenere condizioni ottimali di ricezione del segnale. Scanner MRI più umano non richiedono un processo separato in sintonia / match, trannenelle procedure di MRS.
  2. Condurre un processo di spessoramento utilizzando una singola sequenza di impulsi. Un segnale MR si basa sulla omogeneità ambientale campo magnetico. Il processo di spessoramento consente il campo magnetico nella regione di interesse per essere il più omogenei possibile. Ogni scanner MR ha il suo modo di eseguire il processo di spessoramento, compreso automatico processi veloci spessoramento come mappa veloce e spessoramento gradiente.
  3. Ottimizzare l'impulso RF massimizzando un profilo dimensionale immagine. RF poteri di impulso può essere schierato, mantenendo costante la lunghezza degli impulsi e una lunga abbastanza TR (ritardo di riciclo) che è di circa 3 - 5 volte il T 1 di tessuto.
  4. Acquisire esploratore immagini lungo tre orientamenti ortogonali per creare assiale, coronale e sagittale immagini. Una rapida sequenza di acquisizione delle immagini (gradient echo o alla veloce rotazione di imaging echo) può essere utilizzato per acquisire le immagini scout. Le immagini acquisite verranno utilizzati per la pianificazione per l'imaging attuale con determinazione di piani d'immagine.
  5. Cambia per far girare la sequenza eco. Selezionare i parametri sequenza corretta: TR (ritardo di riciclo), dovrebbero essere tre a cinque volte il tessuto T 1 di acquisire immagini in pieno relax, come la densità protonica o T 2 pesate. TE (tempo di eco) è la durata di tempo tra il primo impulso RF e il centro del segnale eco. Un valore TE possono essere selezionate a seconda del contrasto dell'immagine come riassunto nella tabella 2. La Figura 2 mostra in immagini acquisite in vivo con effetti di rilassamento differenti di T 1, T 2 e T 2 * per un mouse nudo con un tumore xenotrapianto sulla sua schiena.
  6. T 2 misure può essere fatto sia usando multiecho immagini o immagini eco singola con più valori TE.
  7. A seguito della MRI / MRS esperimento in vivo, gli animali devono essere monitorati durante il processo di recupero. Dopo la RM, gli animali saranno portati fuori dal bobina RF e monitorati per assicurare il pieno recupero quando tornò alla gabbia. La perdita di calore è rapida nei topi anestetizzati. Tenere gli animali caldo coprendoli con garze o asciugamani e / o fornire una fonte di calore fino a quando gli animali sono recuperati da anestesia.

Image Processing

  1. Rassegna delle immagini acquisite sulla console MR e il trasferimento dei dati selezionati in una post-elaborazione del computer.
  2. Usiamo tipicamente ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) per analizzare le immagini. L'analisi delle immagini comprende una scalatura delle immagini / filtro, calcoli di T 1, T 2 e la diffusione, misurazioni del volume del tumore e la segmentazione dei tumori.

Parte 3. In Vivo MRS per muscolare degli arti posteriori del mouse scheletrici in un magnete verticale del foro

Costruzione di bracciale per indurre ischemia reversibile

  1. Inizia con un pezzo di tubo in PVC, che è circa 5-7 millimetri di larghezza con un id di 12-15 mm. Praticare un piccolo foro attraverso la parete di questo pezzo e filo.
  2. Tagliare un pezzo di pallone ed è quindi aperto a entrambe le estremità (palloncini elio lavoro di qualità migliore). Inserire questo pezzo attraverso il pezzo in PVC e avvolgere intorno e indietro il nastro finisce insieme sulla parete esterna del pezzo in PVC.
  3. Usa termoretraibile per sigillare il pallone termina attorno al tubo. Si dovrebbe avere un bracciale con un muro solido esterno e una parete interna gonfiabili.
  4. Tagliare una superficie di termoretraibile e pallone attorno al foro filettato, avendo cura di lasciare un sacco di materiale tra il foro e il bordo del pezzo in PVC. Pezzo di filo di 1,5 cm di metalli non ferrosi (ottone ad esempio) nel foro in PVC. Ciò consente di gonfiare il bracciale. Sigillare l'area con 5 minuti epossidica.
  5. Risolvere il bracciale al posto accanto alla bobina RF nella sonda MRS e connettersi a un sfigmomanometro esterno.

Respirazione Monitor personalizzati

  1. Noi utilizziamo un monitor personalizzati respirazione fatto che è fatto per essere compatibile con lo spazio ristretto e l'accesso al foro del magnete. Diversi modelli commerciali sono inoltre disponibili.
  2. Legare un palloncino alla fine del tratto tubi resistenti immessa nella sonda.
  3. Collegare l'altra estremità del tubo di un trasduttore di pressione.
  4. Assicurarsi che la linea di pallone e sono privi di bolle d'aria. Le bolle si attenua il segnale dalla compressione del pallone a causa del movimento del corpo del mouse grazie alla respirazione.

Posizionamento del mouse in MRS Probe

  1. Anestetizzare il mouse con il 5% Avertin (0,010 ml / g di peso corporeo).
  2. Dopo aver raggiunto il piano chirurgico di anestesia, posizionare il mouse nella sonda MRS posizionando il mouse su le spalle al supporto per il mouse. Collocare il palloncino pieno di liquido sul lato ventrale del mouse e fissarlo in posizione con cinghie di supporto per il mouse.
  3. Posizione del mouse e il supporto del corpo nella sonda MRS.
  4. Tirare uno degli arti posteriori attraverso il bracciale ischemico e la bobina MRS. La gamba deve essere centrato nella bobina come much possibile. Questa disposizione permette al corpo del mouse per essere posizionato orizzontalmente in un magnete verticale foro (Figura 3).
  5. Fissare una gamba in posizione da taping piedi supporto rigido.
  6. Luogo termocoppia per via sottocutanea nella arti posteriori di fuori della regione campionati dalla bobina.
  7. Inumidire gli occhi con l'unguento lubrificante occhio per evitare che gli occhi si asciughi. Coprire gli occhi del mouse e volto a evitare lo sfregamento o irritazione dalla parete della sonda.
  8. Sonde di monitoraggio di altri possono essere aggiunti a seconda delle esigenze specifiche dell'esperimento.

Impostazione Esperimento MRS

  1. Collegare il flusso d'aria per elemento riscaldante sulla sonda MRS.
  2. Impostare la variabile di unità di controllo della temperatura sul software VNMR per mantenere la temperatura della gamba a 35-37 ° C.
  3. Sintonizzare la frequenza e l'impedenza della bobina match usando il pannello di regolazione nel software MRS sia per 1 H e 31 risonanze P.
  4. Regolare spessoramento circuiti per ottimizzare l'omogeneità del campo magnetico B1 nella regione di interesse utilizzando 1 spettroscopia H.
  5. Passa a 31 frequenze P per determinare la durata degli impulsi del segnale RF per produrre il massimo da un decadimento di induzione libero (FID) (90 tempo °).
  6. Raccogliere segnale alto a spettri di rumore in pieno relax (FRS) per determinare i rapporti di fosfato inorganico (P i) e fosfocreatina (PCr) di ATP in condizioni di pieno relax. Questi spettri sono raccolti con il tempo di 90 ° con il tempo tra le acquisizioni FID (TR) di circa 5 volte il T 1 di PCr (20 sec. Alle 7 T). Questi saranno utilizzati per la quantificazione della PCR e di P i livelli di MR spettri.

Esperimento ischemica

  1. Una perturbazione semplice ischemico consente la determinazione di riposo e la massima produzione di ATP mitocondriale misurando i cambiamenti nella fosfocreatina durante e immediatamente dopo l'ischemia.
  2. Set-up serie di raccogliere spettri multipli usando un 45 ° larghezza di impulso (ovvero 0,5 x il 90 ° tempo) e un TR di 0,5 x T 1 (~ 1,5 sec.). Noi di solito raccogliere 4 FID per ogni spettri (numero di media (na) = 4 in VNMR software) per una risoluzione temporale di circa 6 secondi. Questa risoluzione del tempo è sufficiente per determinare con precisione il riposo e la massima produzione di ATP mitocondriale.
  3. Raccogliere spettri di riposo per circa 5 minuti.
  4. Indurre ischemia gonfiando il bracciale a 270-300 mmHg per 10-12 minuti.
  5. Rilasciare il bracciale e raccogliere spettri di recupero per 5 minuti.
  6. Rimuovere la sonda dal magnete e il mouse dalla sonda. Lasciare che il mouse per recuperare da anestesia in condizioni adeguate. Gli esperimenti possono essere ripetuti nei giorni successivi. Dopo la finale muscoli del mouse spettroscopia esperimento gambe sono immediatamente rimossi e gelo-bloccato in N 2 liquido per l'analisi delle concentrazioni di ATP mediante HPLC.

Analisi dei dati

  1. I dati vengono analizzati in linea con uno dei vari programmi di analisi spettrale per spettri NMR. Il nostro laboratorio utilizza in genere idonei a norma 2 e jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) per quantificare aree dei picchi.
  2. Iniziale i tassi di guasto PCr durante l'ischemia sono una misura della produzione di ATP mitocondriale in condizioni normossia come descritto in diversi documenti 3-5. PCr tassi di recupero possono essere utilizzati per determinare la capacità massima per la produzione di ATP mitocondriale sulla base di un approccio descritto in precedenza 4,6.

Figura 1
Figura 1. Risonanza magnetica in vivo configurazione vista dal lato anteriore del magnete. La configurazione comprende una bobina di RF, il riscaldamento del sistema animale (o sistema di circolazione dell'acqua calda) e inserire gradienti. Tutti questi componenti sono inseriti in un magnete orizzontale. L'acqua calda è riscaldata in un serbatoio d'acqua al di fuori della sala magnete e introdotto nel sistema di riscaldamento degli animali attraverso un tubo Tygon (nastro verde). Dopo aver circolato nel cilindro, l'acqua viene estratta dal sistema di riscaldamento al serbatoio d'acqua da riscaldare. Un tubo isoflurano ed il tubo a vuoto sono usate per anestetizzare topi durante gli esperimenti di risonanza magnetica.

Figura 2
Figura 2 Nelle immagini in vivo per un topo nudo con tumore xenotrapianto (D282 tumore) sulla schiena (freccia) con diversi effetti di rilassamento:. A. T 1 pesato immagine (TR / TE = 500/14.2ms). B. T 2 pesate immagine (TR / TE = 2s/40ms). Entrambe le 2 immagini T 1 e T ponderate sono stati acquisiti dalla sequenza di spin echo. C. T mappa 2 trattati con 4 serie di immagini acquisite da DIFvalori diversi TE da 20 a 80 ms. D. T 2 * immagini pesate (TR / TE = 180/7.39ms, angolo di capovolgere = 20 gradi), acquisito dal sequenza gradiente eco. Campo visivo di 35 x 35 mm 2 è per tutte le immagini MR.

Figura 3
Figura 3. Illustrazione del mouse posizionato nel supporto corpo orizzontale con gamba fissata in bobina RF.

Figura 4
Figura 4. In vivo 31 P spettri attraverso un ciclo di ischemia riperfusione. I dati sono stati raccolti su un magnete 7 T foro verticale e la linea ampliato con un filtro a 20 Hz esponenziale. TR = 1, na = 4, ogni spettri 20 sono tracciati.

Tabella 1. Dosaggio di anestetico per mouse MRI / MRS.

Animale
Specie
Anestetico
Agente
Dose
(Mg / kg per iniettabili)
Percorso
Mouse Gas isoflurano 4,0% per 2-3 min (induzione), poi 1,2-1,5% costantemente (manutenzione) Inalato attraverso cono
Mouse Avertin 5%, il peso corporeo 10ml/kg intraperitoneale (IP)
Mouse Ketamina / xylazina 100 mg / kg e 10 mg / kg IP


Tabella 2. Immagine con ponderazioni relax

Immagine di ponderazione TR (ritardo riciclo) TE (tempo di eco)
T1 Breve (meno di T1) Breve (meno di T2)
T2 Lunga (3 ~ 5 volte T1) Lunga (circa T2)
PD (densità protonica) Lunga (3 ~ 5 volte T1) Breve (meno di T2)

T1: reticolo di rilassamento di spin (o di rilassamento longitudinale) tempo
T2: rotazione di rilassamento di spin (o di rilassamento trasversale) tempo

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Discussion

La pre-acquisizione passi di sintonia / partita e spessoramento sono fondamentali per l'acquisizione ad alta risoluzione spaziale e un elevato rapporto segnale-rumore (SNR). E 'anche importante per monitorare le condizioni degli animali con un sistema di monitoraggio degli animali per mantenere uno stato stabile fisiologico degli animali durante acquisizioni segnale a rispettare la movimentazione animale umano e per prevenire qualsiasi misure di potenziale artefatta. Le procedure spiegato nel protocollo può essere modificato per acquisire informazioni aggiuntive, tra cui l'imaging di diffusione, perfusione e il flusso e la spettroscopia localizzata in vivo. Tutti i preparativi animale dovrebbe essere simile a meno che una procedura richiede una messa a punto supplementare. I protocolli di MRI e MRS descritti in questo studio sono stati utilizzati per diverse applicazioni tra cui longitudinale studi di risonanza magnetica per lo sviluppo di nanosonde per colpire i tumori 7 e studi MRS per la produzione di ATP mitocondriale 5,8. MRI e MRS sono tecniche utili per la visualizzazione non invasivo animale anatomica, cambiare il relax o per monitorare il metabolismo non distruttivo. Entrambe le tecniche possono essere utilizzate come procedure di monitoraggio longitudinale per esaminare suddette variazioni nel tempo. Per MRS abbiamo costruito una sonda personalizzata RF che permette all'animale di essere mantenuto in posizione orizzontale in un magnete verticale foro. Così, questi esperimenti possono essere eseguite su qualsiasi verticale ampio tunnel magnetico, come si trova nella maggior parte dei dipartimenti di chimica.

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Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto in parte dal NIH / NIBIB R21EB008166 di DL e NIA AG028455 e NIA AG022385 per DJM. Ringraziamo il dottor James Olson presso il Centro di Fred Hutchinson Cancer Research per aver fornito loro i topi D282 tumore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T Varian Inc., Agilent Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T Varian Inc., Agilent Used for MRS of mouse skeletal muscle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art. Radiol Med. 112, 491-491 (2007).
  2. Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes. Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).
  3. Amara, C. E. Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics. Methods. 46, 312-312 (2008).
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  8. Marcinek, D. J. Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle. J Physiol. 569, 467-467 (2005).

Comments

2 Comments

  1. can i take the image from mice with conventional head or knee coil?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2010 - 3:09 PM
  2. You could acquire images from a small animal with a human head or knee coil. But the signal-to-noise ratios of the acquired images will be substantially lower than those in the images shown in the video. You will need a smaller RF coil that is in the similar dimensions of the animal body to increase the filling factor which is linearly proportional to the signal-to-noise ratio. Hope this will help. Please let me know if you have a further question.
    Best,
    Donghoon Lee

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2010 - 4:10 PM

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