B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

안녕하세요, 저는 쾰른 대학 병원의 종양 면역 및 이식 면역 연구실에서 근무하고 있는 박사 과정생 Tanya Wig입니다. 저의 연구는 주로 해양 CD 40 활성화 B 세포와 이들이 생체 내(in vivo)에서 면역 반응을 유도하는 능력에 초점을 맞추고 있습니다. 원래 인간 CD 40 B 세포는 수지상 세포를 대체하는 항원 제시 세포로서 생성되었습니다.

해당 세포들은 면역치료 목적으로 사용될 계획입니다. 임상 환경에서 CD 40 B 세포는 CD 40 신호 전달 및 IL 4 자극 하에 생성됩니다. 이 시스템에 따라, 세포들은 수주에 걸쳐 증식될 수 있습니다. 본 연구실에서 PBMC로부터 인간 CD 40 B 세포를 생성하는 과정을 최적화한 후, 이 원리를 마우스에 성공적으로 적용하였으며, 오늘 그 내용을 보여드리고자 합니다.

비장에서 시작하여, 14일간의 세포 배양을 통해 마우스 CD40 활성화 B 세포를 생성합니다. 주요 단계는 피더 세포(feeder cells)의 준비이며, 이를 위해 부착성이고 78 Gy로 조사된 마우스 CD40 리간드가 형질전환된 피더 세포주를 사용하여 6-웰 플레이트에 도말합니다. 둘째, C57BL/6 마우스에서 갓 정제한 B 세포를 사용하여 마우스 CD40 B 세포 배양을 시작하며, 이 세포들은 마우스 인터루킨-4, $\beta$-mercaptoethanol 및 cyclosporine A로 처리됩니다. 그 후 이 세포들을 6-웰 플레이트의 조사된 피더 세포 위로 옮깁니다.

이 절차는 세포 배양 14일까지 3~4일마다 반복합니다. 고순도의 해양 CD 40 활성화 B 세포를 얻기 위해, 갓 정제한 SP cytes thromb LXi 마우스를 사용하여 해양 CD 40 활성화 B 세포 생성을 시작합니다. 먼저, 세포를 50 milliliter의 해양 CD 40 B 세척 배지에 재현탁하여 SP cytes를 세척합니다.

그 다음, 세포 수를 측정하기 위해 1300 RPM(260 5G에 해당)에서 7분 동안 세포를 원심 분리합니다. 세포를 10 mL의 marine CD 40 B 세척 용액에 완전히 재현탁한 후, 볼텍싱하여 세포를 혼합합니다. 그 후 세포 수를 측정합니다.

6-웰 플레이트를 사용하여 1300 RPM(260 5G에 해당)에서 7분 동안 필요한 양의 세포를 원심 분리합니다. 웰당 5 × 10⁶개의 세포가 필요하므로, 플레이트당 총 30 × 10⁶개의 세포가 필요합니다. marine CD 40 B 배양 배지에서 1.25 × 10⁶ cells/mL의 농도로 필요한 양을 분주합니다.

그런 다음 세포 현탁액에 자극을 위해 1 U/mL 농도의 marine IL-4를, T 세포의 성장을 억제하기 위해 0.63 µg/mL 농도의 cyclosporine A를, 그리고 100 µM BME-CAPTA ethanol을 각각 신선하게 첨가합니다. 이제 세포 현탁액은 HEV 세포를 이용한 자극 준비가 되었습니다. HEV 세포주는 배양액에서 수개월 동안 생존할 수 있으므로, 세포의 생존, 분화 및 증식을 자극하기 위해 marine CD40 ligand가 형질전환된 HEV 세포를 사용합니다.

해양 CD 40 리간드 발현의 소실 여부를 정기적으로 확인하여 배제해야 합니다. CD 40 리간드가 형질전환된 healer는 0.2 mg/mL 농도의 icing B가 첨가된 선택 배지 내에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양되는 부착성 세포주입니다. 선택 과정에서 이 부착성 상피 세포주가 완전히 합쳐지지(confluent) 않도록 해야 하며, 부착 세포를 분할하기 위해 일주일에 두 번씩 계대 배양해야 합니다.

10 mL의 PBS로 배지 세척액을 한 번 흡입하여 제거합니다. 75 cm² 플라스크를 부드럽게 회전시키며 4 mL의 trypsin EDTA를 첨가합니다. 플라스크를 인큐베이터 내 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다.

플라스크를 다시 꺼냅니다. 플라스틱에서 세포를 분리하기 위해 가볍게 두드립니다. 그런 다음 10 mL의 biotype 배지를 조심스럽게 넣고 가볍게 흔든 후, 세포를 50 mL 튜브로 옮깁니다.

피더 세포를 1300 RPM(260 5G에 해당)에서 7분 동안 원심 분리합니다. 펠렛화된 세포를 10 mL의 야생형 배지에 조심스럽게 재현탁하여 계대 배양을 위한 세포 수를 측정합니다. 2.5 × 10⁶개의 세포를 10 mL의 선택 배지에 분주하여 75 cm² 플라스크로 옮기고, CD 40 자극을 위해 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 피더 세포를 배양합니다. 나머지 피더 세포는 78 Gy로 치사량 조사를 하여 증식을 중단시킵니다.

피더 세포를 야생형 배지에 희석하여 세포 밀도가 0.2 × 10⁶ cells/mL가 되도록 하고, 6-웰 플레이트의 각 웰에 2 mL씩 분주합니다. CD40 리간드를 이용한 사이토카인 자극 시 자극 세포로 사용하기 전, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포가 다시 부착되도록 합니다. 하루 전에 분주한 피더 세포가 잘 부착되었는지 현미경으로 확인합니다.

피더 세포가 부착되어 있다면 각 웰에서 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 자극을 위해 직전에 1.25 × 10⁶ cells/mL로 조정된 SPOC 사이드 현탁액 4 mL를 각 웰에 천천히 옮기고 37 °C, 5% CO2 조건에서 플레이트를 배양합니다. 4일째에 marine CD 40 B 세포를 다시 계대 배양하며, 활성화된 marine CD 40 B 세포의 첫 번째 계대 배양은 4일째에 수행하고 이후 계대 배양은 3~4일마다 실시합니다. 10 mL 피펫으로 재현탁하여 6-웰 플레이트에서 응집된 세포를 부드럽게 수확합니다. marine CD 40 B 세포를 50 mL 튜브에 모으고 1300 RPM(260 ×g에 해당)에서 7분 동안 원심 분리합니다. 배지를 marine CD 40 B 세척 배지로 완전히 교체합니다.

해양 CD40 B 세포의 세포 수를 결정하기 위해, 해양 CD40 B 세포를 해양 CD40 B 배양액에서 0.75 × 10⁶ cells/mL의 세포 밀도로 현탁합니다. 그런 다음, 세포 현탁액에 1 U/mL 농도의 신선한 해양 IL-4, 0.63 µg/mL 농도의 cyclosporine A 및 100 µM BMP ethanol을 다시 첨가합니다. 물론, 조사된 피더 세포(feeder cells)는 사용 직전에 현미경으로 부착 상태를 다시 확인해야 합니다.

피더 세포가 부착되어 있다면, 각 웰에서 SUP natin을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음, 자극을 위해 직전에 준비한 marine CD 40 B 현탁액을 각 웰로 옮깁니다. 배양 14일째에 고순도의 marine CD 40 활성화 B 세포를 얻기 위해, 3~4일마다 일주일에 두 번 동일하게 계대 배양을 반복합니다.

이 시점에서 Marine CD 40 B 세포는 CD 80, CD 86과 같은 공동 자극 분자 및 MHC 클래스 I 및 II 분자를 발현하며, 이는 생성 과정 중 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 확인할 수 있습니다. 이렇게 생성된 세포는 B 세포의 활성화, 분화 및 기능에 관한 연구에 사용할 수 있으며, 예를 들어 면역 치료 목적으로의 활용 가능성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.