Name: Western Blot: Numune Hazırlama Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Öğrenin, Western blot tekniğiyle doku örneklerinde spesifik proteinleri tespit etme yöntemini. Yüksek kaliteli reaktifler ve uygun protokoller kullanarak güvenilir sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Numune Hazırlama Western blot ilk adım, numune hazırlama. Jel hücre ve dokuların çalıştırmak için numune hazırlamak için ilgi proteinleri serbest parçalanmış olması gerekir. <ul><li> Çok yönlü ve çözünür protein ekstraksiyonu için kullanımı kolay bir kullanıma uygun, hazır reaktif CytoBuster veya PhosphoSafe. Bu çıkarma tamponlar, memeli ve böcek hücrelerinin çözünen proteinlerin etkin bir şekilde çıkarılması için optimize edilmiş deterjan içerir. CytoBuster Protein Ekstraksiyonu Reaktif nazik, non-iyonik bileşimi gibi sonication veya donma / çözülme gibi ikincil tedavi için gerek kalmadan işlevsel aktif endojen veya ifade proteinlerin izolasyonu sağlar. PhoshoSafe dört fosfataz inhibitörleri içeren eklenen yararı vardır. <ol><li> Pelet düşük hızda santrifüj (örneğin 2500 xg&#39;de 5 dakika) hücreleri, iyi drenaj hücre pelletini. </li><li> CytoBuster Protein Ekstraksiyonu Reaktif 10 6 hücre başına 150 mcL (CytoBuster Protein Ekstraksiyonu Reaktif optimal miktarı hücre boyutuna göre değişebilir) kullanarak hücrelerin tekrar </li><li> 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Uygun bir tüp transferi ve 4 ° C 16.000 xg&#39;de 5 dakika spin </li><li> Transfer yeni bir tüp (hücre özü) supernatant temizlenir ve analizi ile devam edin. </li></ol></li><li> Uzman protein izolasyonu için, bizim yüksek kaliteli ProteoExtract Kitleri kullanmanızı öneririz. EMD mitokondriyal yalıtımı, hücre içi proteom çıkarma, transmembran protein izolasyonu, ve diğerleri için bir düzineden fazla kitleri vardır. Daha fazla ayrıntı için Western Blot açılış sayfasını ziyaret edin. </li><li> EMD proteaz, fosfataz inhibitörü kokteyl setleri geniş bir yelpazede satıyor. Lizis olarak ortaya çıkar, proteoliz, Defosforilasyon ve denatürasyon başlar. Bu olaylar örnekleri, buz üzerinde veya 4 tutulur muazzam yavaşlamış olabilir ° C her zaman ve uygun inhibitörleri, lizis tamponu taze eklenir. Daha fazla ayrıntı için Western Blot açılış sayfasını ziyaret edin. </li></ul> 2. SDS-PAGE Western blotting ikinci adım protein ayırma. Proteinler moleküler ağırlığına göre ayrılır. <ul><li> Kendi SAYFA jel yapabilir, ancak biz ticari prekast jel kullanarak olacak. <ol><li> Numunenin hazırladıktan sonra, protein konsantrasyonu belirlemek için hazırsınız. EMD konsantrasyonu ölçmek için bu iki kitleri, bir Sigara Karışan Protein Testi Kit ve diğer BCA Protein Testi Kiti. </li><li> Protein konsantrasyonu değerlendirilir sonra jel yükleme için bizim örnek hazırlamak için hazır. Antikorlar genellikle ilgi protein küçük bir kısmı (epitopu olarak anılacaktır) tanımak ve bu etki, protein 3D konformasyon içinde ikamet olabilir. Antikor, protein açılmak için gerekli olan bu kısmına erişim sağlamak için. </li><li> Doğasını, denatüre anyonik deterjan sodyum dodesil sülfat (SDS) ile bir yükleme tampon kullanmak ve karışımı 95-100 ° C&#39;de 5 dakika boyunca kaynatın. Kullanımı kolay ve rahat bir yükleme tamponu 4X Örnek Arabelleği. </li></ol></li><li> Trail Mix Protein Marker ile iyi ilk şeritli yükleyin. Bu marker, elektroforez izlemek için izin üç referans bantları vardır. Jel lekeli, 10-225 kDa arasında değişen 10 bantlar görülebilir. </li><li> Tampon çalışan elektroforez doldurun. SAYFA jeller için bu Tris-glisin genellikle 1X. Ayrıntılı tampon tarifleri için, Western blot sayfasını ziyaret edin. EMD OmniPur kimyasal hattı ile yüksek kaliteli tamponlar reaktifler sunar. 1 saat süreyle 220V jel çalıştırın. </li><li> Proteinler ayrılmış sonra, proteinler eşit ve düzgün göç etmiş sağlamak için Coomassie mavi ile jel leke. RAPIDstain kullanıma hazır olduğu ultra hassas bir leke. Yok destaining gereklidir. </li></ul> 3. Protein Aktarımı Bir elektrik yükü ile proteinler gibi bir elektrik alanında bir jel ile seyahat ikna edilebilir, bu nedenle proteinler, PVDF veya nitroselüloz ya bir zar üzerine jel bir elektrik alanı içinde transfer olabilir. <ul><li> Bugün biz ıslak bir transfer yapacağız. Islak transferi, jel ve membran sünger ve kağıt (sünger / kağıt / jel / membran / kağıt / sünger) ve herhangi bir hava kabarcığı, jel ve membran arasında oluşan sağlamak sonra sıkıca birbirine kenetlenir arasında sıkışmış. Sandviç, bir elektrik alanı uygulandığında transfer tampon batmış. Negatif yüklü proteinler pozitif yüklü elektrot doğru seyahat, ancak membran onları durdurur, onları bağlar, ve devam etmesini engeller. </li><li> Membran iki tip mevcuttur: nitroselüloz ve PVDF. De her iki çalışma. Bugün PVDF kullanarak olacak. PVDF membranlar methano iliklerine gerektirir.birkaç dakika için l, 5 dakika buz transfer tampon ile takip. Jel, buz gibi transfer tamponunda bir kaç dakika da dengeye ihtiyacı var. Bunu yapmamak, transfer sırasında jel brakabilir. </li><li> Islak transferi için tampon% 20 metanol ile 1X Tris-glisin. Detaylı tampon hazırlıkları web sitemizde mevcuttur. </li><li> Transferi tamamlandıktan sonra, bunu sağlamak için bile herhangi bir hava ceplerine transfer proteinlerinin görselleştirmek için iyi bir fikirdir. Bu RedAlert Western Blot Leke ile kolayca yapılabilir. Bu leke kullanıma hazırdır ve destaining su ile kolayca yapılabilir. </li></ul> 4. Antikorlar ve Aksesuar Reaktifler <ul><li> Antijene sondalama ve antikor yapıyor membran engellemek için ilk adım. Membran engelleme non-spesifik bir arka plan bağlanmasını engelleyen. </li><li> Yağsız süt veya BSA Ya engelleyici bir çözüm olarak kullanılabilir. Ancak, fosfor-spesifik antikorların kullanırken, yüksek arka plan neden olarak süt kullanmak için tavsiye değildir. </li><li> EMD olmayan bir memeli engelleyici ajan ve hazırlanan BLOT QuickBlocker SeaBlock dahil olmak üzere çok sayıda yüksek kaliteli engelleme reaktifler, hazır kullanımı ajan engelleme. Ayrıca yüksek kaliteli BSA (Fraksiyon V) var. <ol><li> Membran yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1 saat inkübe. </li><li> TBST veya PBST inkübasyondan sonra üç kez yıkayın. TBST veya PBST yapmak için kolay ve rahat bir şekilde tabletleri kullanmak için (PBS TWEEN Tablet / TBS TWEEN Tablet) </li></ol></li><li> Membran bloke edildikten sonra, primer antikor ile inkübe hazırız. Merck, 30 yılı aşkın süredir endüstride en iyi antikor garantisi ile, olağanüstü antikorların kapsamlı bir portföy sunmaktadır. Tüm EMD antikorlar, biz tam% 100 risk garantisi teklif unutmayın. Antikor satın alma ve İstediğiniz herhangi bir tür özgüllüğü veya uygulama için kullanabilirsiniz. Antikor sizi tatmin edecek işe yaramazsa, başka bir ürün üzerinde kullanılmak üzere tam bir kredi sağlayacaktır. Daha fazla bilgi için, Western blot web sayfasını ziyaret edin. <ol><li> Bugün SignalBoost, çözüm 1 kullanarak birincil antikor kuluçka olacaktır. SignalBoost sinyali önemli ölçüde geliştirilmiş olmasını sağlayan harika bir ürün. Sadece birincil antikor Çözüm 1 inkübasyon ve 1 saat boyunca veya normalde yaptığınız gibi kuluçkaya yatmaktadır. Daha fazla bloke edici ajanlar eklemeye gerek yoktur. Alternatif olarak, BSA veya engelleyici bir ajan olarak yağsız süt kullanabilirsiniz. </li><li> TBST ile yıkayın. Biz hazır çözülür TBST tablet TBST olun. </li><li> SignalBoost, çözüm 2 kullanarak ikincil antikor inkübe edin. 1 saat boyunca tampon engelleme ikincil antikor inkübe edin. TBST ile birkaç kez membran yıkayın. </li></ol></li></ul> 5. Bulma HRP conjugating ikincil antikorlar, ECL geleneksel olarak kullanılır. Sunduğumuz mükemmel bir ECL reaktif RapidStep. RapidStep, avantajları luminal veya artırıcı hiçbir karıştırma gerekli olduğunu. Sadece membran birkaç kez sprey ve x-ışını filmi kullanarak geliştirmek. RapidStep substrat eklenmesinden sonra düşük piktogram yanı sıra 2 saate yayan ışık hassasiyeti sunuyor.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar Anna Eslami ve Jesse Lujan Bu maddede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Merck Kimyasallar A.Ş. tarafından istihdam edilmektedir.

Bu video sunumu, SDS-PAGE, membran antikorlar ile sondalama / engelleme ve algılama, numune hazırlama, Western blot önemli adımlar sermiştir. Sürecinin her adımı için uygun protokoller ve uygun reaktifler, yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için kullanılmalıdır.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Protein Ekstraksiyon Reaktifi</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Ekstraksiyon Reaktifi</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Girişim Yapmayan Protein Analizi&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCA Protein Analiz Kiti </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDS Örnek Tamponu </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Trail Mix&amp;#8482; Protein Markerları</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Protein&amp;#8211;ekstrakt&amp;#8482; Protein Ekstraksiyon Kitleri</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrakt&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;ekstrat&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Ürünler</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10X Western Blot Boyası</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reaktif, Somon Plazması</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker Reaktifi</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumin, Sığır Serumu, Fraksiyon V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Tabletler</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Tabletler</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; İmmünoreaksiyon Artırıcı Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL Reajanı</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blot: numune hazırlama algılama

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir. Bu polipeptid uzunluğu (denatüre koşulları) veya 3-D protein yapısı (yerli / olmayan denatüre koşulları) yerli veya denatüre proteinleri ayırmak için jel elektroforezi kullanır. Proteinler daha sonra hedef protein spesifik antikorlar kullanarak probed bir zar (genellikle nitroselüloz veya PVDF), (tespit) aktarılır.

Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting, belirli bir doku homojenat veya ekstrakt örneğindeki spesifik proteinleri saptamak için kullanılan analitik bir tekniktir. Jel ...

Bu prosedürün genel amacı, uygun ürünler kullanıldığında Western blot işleminin ne kadar kolay gerçekleştirilebileceğini göstermektir. Numune hazırlığının ardından proteinler boyutlarına göre ayrılır ve ardından katı bir faz üzerine aktarılır. Daha sonra proteinler antikorlarla sorgulanır ve tespit edilir; uygun protokollerin ve yüksek kaliteli, maliyet etkin reaktiflerin kullanımı, geliştirilmiş western blotting sonuçları sağlar.Merhaba, ben San Diego, Kaliforniya'daki EMD Chemicals'da Ar-Ge bilimcisiyim. EMD, Darmstadt, Almanya'daki Merck, KGAA'nın bir iştirakidir. Bugün size bir western blotting prosedürünü göstereceğiz.Hadi başlayalım. Western blotting işleminin ilk adımı örnek hazırlamadır. Hücreleri, 2.500 ×g'de beş dakika gibi düşük hızlı santrifüjasyonla çöktürerek örnek hazırlamaya başlayın.Santrifüj işleminin ardından hücre peletlerini süzün. Hücreleri, 10⁶ hücre başına 150 µL olacak şekilde cyto buster protein ekstraksiyon reaktifi içinde iyice resüspande edin. Örneği oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Ardından, santrifüj işlemini takiben numuneyi dört santigrat derecede, 16,000 ×g hızında beş dakika boyunca döndürün. Berraklaşmış SNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve analiz aşamasına geçin. Numunenin protein konsantrasyonu değerlendirildikten sonra, proteini denatüre etmek için numuneyi jele yükleme aşamasına hazırlayın.Sodyum dodiçil sülfat veya SDS gibi iyonik bir denatüre edici deterjan içeren bir örnek tamponu kullanın. Karışımı 95 ile 100 °C arasında beş dakika boyunca kaynatın. Ticari olarak temin edilebilen ön dökümlü bir jel kullanarak proteinler, moleküler ağırlıklarına göre hızlıca ayrıştırılabilir.Elektroforez ünitesini, Omni PU kimyasal serisi üzerinden sunulan reaktiflerle hazırlanabilecek olan yürütme tamponu ile doldurun. Kuyucuğun ilk şeridine izleme karışımı protein markeri yükleyin. Bu marker, elektroforez sırasında izlemeye olanak tanıyan üç referans banda sahiptir.Jel boyandıktan sonra, 10 ile 225 kilo Daltons arasında değişen 10 bant görülür. Denatüre edilmiş örneği kalan kuyucuklara yükleyin. Jeli 220 voltunda bir saat boyunca çalıştırın.Proteinler ayrıştıktan sonra, proteinlerin düzgün ve tekdüze şekilde göç ettiğinden emin olmak için jeli, kullanıma hazır ve DS içermeyen hızlı boyama ve ultrasensitif boyama yöntemiyle Coomassie Blue ile boyayın. Elektrik yüklü proteinlerin bir elektrik alanı içinde jel boyunca hareket etmesi sağlanabildiği gibi, proteinlerin jellerden nitrocelluloz veya PVDF gibi bir membrana elektrik alanı aracılığıyla aktarılabilmesi için boyama işlemi gereklidir. PVDF membran kullanırken, membranı birkaç dakika metanol içinde bekletin ve ardından beş dakika boyunca buz gibi soğuk transfer tamponunda dengeleyin. Ayrıca jeli de birkaç dakika buz gibi soğuk transfer tamponunda bekletin; dengeleme işlemi, transfer sırasında jelin büzülmesini önler.Islak transfer için, jel ve membrandan oluşan yapıyı sünger ve kağıt arasında sandviç şeklinde düzenleyin. Ardından, jel ile membran arasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olduktan sonra düzeneği sıkıca kenetleyin. Sandviç yapıyı transfer tamponuna daldırın ve elektrik alan uygulayın.Negatif yüklü proteinler pozitif yüklü elektroda doğru hareket edecektir. Membran daha sonra onları durdurur, bağlar ve ilerlemelerini engeller. Transfer tamamlandığında, hava boşluğu olmadan eşit bir transfer gerçekleştiğinden emin olmak için proteinleri görselleştirin.Bu işlem, red alert Western blot boyası ile kolayca gerçekleştirilebilir. Bu boya kullanıma hazırdır ve boyanın giderilmesi su ile kolayca yapılabilir. Bu, membran antikor ile kanıtlanmadan önce suyla yıkanarak boyası giderilmiş jeldir; ardından membran bloke edilir.Özgül olmayan bağlanmayı önlemek için membranı yüksek kaliteli bloklama reaktifleri ile bloklayın. Arka plan gürültüsünün artmasını önlemek için membranı bloklama çözeltisi içinde oda sıcaklığında, hafif ajitasyon altında bir saat boyunca inkübe edin ve ardından membranı üç kez TBST veya PBST ile yıkayın. Bu tamponlar, sırasıyla TBS tween tabletleri ve PBS tween tabletleri kullanılarak kolayca ve uygun bir şekilde hazırlanabilir.Membran bloke edilip yıkandıktan sonra, primer antikor ile inkübe edilebilir. Sinyalin önemli ölçüde artırılmasını sağlayan sinyal güçlendiricilerden biri olan solüsyon birini kullanarak primer antikoru uygulayın. Primer antikoru solüsyon bir içerisinde hazırlayın ve membranı bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası daha fazla bloklama ajanı eklemeye gerek yoktur. Membranı TBST ile yıkayın. Ardından, membranı signal boost'un ikinci çözeltisiyle seyreltilmiş sekonder antikor ile bir saat boyunca inkübe edin.Son olarak, HRP konjuge işlemi için membranı tekrar birkaç kez TBST ile yıkayın. Burada geleneksel olarak, geliştirilmiş kemilüminesans veya ECL ile sekonder antikor tespiti kullanılır. Lüminol veya geliştirici karıştırmayı gerektirmediği için ECL reaktifinin hızlı adımı kullanılır.Membrana birkaç kez püskürtme yapın, iki dakika inkübe edin ve x-ışını filmi kullanarak görüntüleyin. Rapid Step, düşük pikogram duyarlılığın yanı sıra substrat eklendikten sonra iki saate kadar daha hafif bir görev sunar. Trail mix protein markerları, standart Western blot protokolleri ile karşılaştırıldığında elektroforez sırasında protein takibine olanak tanır.Sinyal Güçlendirici, daha geniş bir dinamik aralık ve hassasiyet sağlar. Son olarak, geleneksel ECL reaktifleri yerine Rapid basamağı kullanılarak üstün hassasiyet elde edilebilir. Kapsamlı bir ürün yelpazesiyle Western körlemesini nasıl verimli ve maliyet etkin bir şekilde gerçekleştirebileceğinizi göstermiş olduk.Sonuçlarınızın kalitesinin, kullandığınız reaktiflerin kalitesine bağlı olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

(Batı blot) İmmünoblotting antijen-antikor tanıma doğasında özgüllüğü istismar çalışır proteinlerin saptanması ve karakterizasyonu için hızlı ve duyarlı bir testtir. Bu video protein ayırma protokolleri, proteinler membranlar üzerine blot, immunoprobing, kromojenik veya kemilüminesan yüzeyler kullanarak görselleştirme sağlar.

Immüno Analizi

Bu video, bir doku örneğinde ilgilenilen proteinlerin mutlak miktar tayini için kantitatif bir nokta lekesi veya QDB tekniğini göstermektedir. Numunedeki proteinler, bir QDB plakasının kuyucukları içindeki nitroselüloz zar üzerinde hareketsiz hale getirilir. Bir peroksidaz enzimi ile etiketlenmiş hedef proteine özgü antikorlar kullanılarak, bir kemilüminesan substrat, numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için ölçülen ışık üretmek için oksitlenir.

Bir doku lizatındaki hedef proteinleri tahmin etmek için kantitatif nokta lekesi

Video, bir numunedeki hedef protein ekspresyonunu ölçmek için toplam protein normalizasyonuna dayalı bir western blotlama tekniğini göstermektedir. Numunenin toplam protein boyaması kullanılarak, hedef proteinin nispi ekspresyon seviyesini belirlemek için bir oransal analiz yapılır.

Protein Ekspresyon Seviyelerini Tahmin Etmek için Kantitatif Western Blotting

Bu video, immünopresipite lizatların kemilüminesans bazlı western blotlamasını açıklamaktadır. Teknik, protein işleme ve aktivasyonunu belirlemeye yardımcı olur. Tespit edilen kemilüminesan sinyali, aktivasyonu sırasında protein işleme seviyesi ile orantılıdır.

Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

Floresan kullanarak western blotlamanın ilerlemesi, kantitatif analizlere olanak tanıyan protein ekspresyonundaki ince değişikliklerin tespit edilmesine izin verdi. Burada, çeşitli türler ve doku tiplerinde bir dizi proteinin tespiti için sağlam bir metodoloji açıklıyoruz. Yaygın teknik sorunların üstesinden gelmek için bir strateji de sağlanmaktadır.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

Bu yöntem protein düzeyleri farklı dokular ve standartlaştırılmış bir nicel Batı blotting yaklaşım kullanarak farklı gelişim timepoints karşılaştırılması için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım açıklar.

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Arşiv formalin sabit ve (FFPE) gömülü parafin klinik numuneleri hastalıkların araştırılması için değerli bir malzemedir. Burada microdissected FFPE doku derinlemesine proteomik analizini sağlayan bir örnek hazırlama iş akışını göstermektedir.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Öğrenin, Western blot tekniğiyle doku örneklerinde spesifik proteinleri tespit etme yöntemini. Yüksek kaliteli reaktifler ve uygun protokoller kullanarak güvenilir sonuçlar elde edin.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Daha fazla video keşfet