Name: המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 45 s
Description: למד את שיטת ווסטרן בלוט באמצעות מערכת NuPAGE לניתוח ביטוי חלבונים בתאים מושתלים. הטכניקה כוללת הפרדת חלבונים באלקטרופורזה, העברה לממברנה וזיהוי באמצעות נוגדנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות ואת ג&#39;ורג&#39; א יואיט קרן אחווה (AP).

ג&#39;ל אלקטרופורזה הערה טכנית: לפני שמתחילים את ההליך, יש דגימות חלבון שלך מוכן. במהלך שלב זה הראשון, החלבונים במדגם מופרדים על פי משקל מולקולרי שלהם באמצעות denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). ® NuPAGE הצפת LDS לדוגמה עמוסה סולפט Dodecyl ליתיום (LDS) שומרת פוליפפטידים במצב מפוגל פעם המדגם חלבון כבר מחוממת על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סוכן הפחתת חזקה משמש יחד כדי להסיר מבנה משניים ושלישוניים (DTT, לשבור אג&quot;ח דיסולפיד). בנוסף, חלבונים מדגם להיות מכוסה LDS טעונים שלילית ולכן עוברים דרך הרשת acrylamide של הג&#39;ל לכיוון האלקטרודה במטען חיובי. זה מאפשר הפרדה שלהם על פי משקל מולקולרי (נמדד קילו Daltons, KDA). מפורט צעד אחר צעד פרוטוקולים להכנת הדגימה את ההליך PAGE ניתן למצוא באתר האינטרנט של Invitrogen 2, או הטכני NuPAGE מדריך 3. טכנית טיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת NuPAGE Invitrogen ביס, טריס חיץ discontinous, הניידות electrophoretic של חלבונים ואת טווח ההפרדה הבאות של הג&#39;ל תלויה בשני גורמים: א) ריכוז acrylamid של ג&#39;ל (עם ריכוז acrylamide יותר וכתוצאה מכך ברזולוציה נמוכה יותר של משקל מולקולרי חלבונים) ו ii) של יון נגרר למאגר, מגבים ריצה או MES. כדי לבחור את השילוב המתאים למגוון ההפרדה שאתה רוצה להשיג, עיין בתרשים הגירה ג&#39;ל 1. העובי של ג&#39;ל ומספר בארות תהיה תלויה בנפח וכמות דגימות שבכוונתך לטעון, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת טעינת דגימות שלך לתוך בארות של ג&#39;ל, לפחות נתיב אחד שמורה סמן משקל מולקולרי (או הסולם). סטנדרטים אלו חלבונים זמינים מסחרית של מספר חברות, ובדרך כלל מכילים תערובת של חלבונים מוכתם לאחר משקולות מולקולרי מוגדר, כדי ליצור להקות גלוי המאפשרים לך לעקוב אחר התקדמות ההגירה. בחר טווח המשקלים המולקולריים תואם ברזולוציה ג&#39;ל שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג דפוס הגירה נחמד ואפילו מומלץ טוען את כל הבארות של ג&#39;ל עם נפח דומה של מדגם או 1X חיץ LDS המדגם. </li></ol> להעביר הערה טכנית: לפני תחילת שלב העברה, להכין את החיץ ההעברה (1X עם מתנול 10%) מראש מגניב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר. על מנת להפוך את החלבונים נגיש לאיתור נוגדנים, הם מועברים על ידי electroblotting מן הג&#39;ל על גבי קרום nitrocellulose. מחייב חלבון מבוססת על אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם יחסי הגומלין בין תשלום הממברנה וחלבונים. (קרום polyvinylidene (PVDF) פלואוריד יכול לשמש גם כאלטרנטיבה. במקרה זה, את הממברנה PVDF צריך להיות מראש רטוב מתנול 30 שניות לפחות לפני השימוש.) פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד של הליך העברת ניתן למצוא התייחסות 4 אם אתה משתמש Bio-Rad מיני חוצה כתם Cell העברת Electrophoretic, או הפניות 2-3 אם המעבדה שלך מצויד II XCell Invitrogen של ™ כתם Module. כתוצאה מתהליך זה, חלבונים נחשפים על פני השטח בשכבה דקה מוכן לצורך זיהוי. האפקטיביות אחידות הכוללת של העברת חלבון מן הג&#39;ל על הממברנה ניתן לבדוק על ידי מכתים קרום לצבוע Ponceau S הפיך. מכתים הליך Ponceau S (אופציונלי): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברת חלבונים, במקום קרום במגש הדגירה (חלבונים פונה כלפי מעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק מכתים S Ponceau כדי לכסות את הממברנה לדגור לפחות 30 שניות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הממברנה עם מים מזוקקים עד רקע ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain הממברנה עם ריצה מים מזוקקים במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום פתרון חסימה (ראה להלן). </li></ol> טכנית טיפים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים תיוג קרום שלך בעיפרון לפני העברת חלבון כדי לציין את הצד שבו חלבונים נחשפו הכיוון של דגימות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מכתים S Ponceau ואת הסמנים משקל מולקולרי ניתן להשתמש כדי לחתוך את הקרום לאחר העברת לחקור את החלקים וכתוצאה מכך עם נוגדנים שונים </li></ol> Immunodetection: הערה טכנית: הליך זה immunodetection מסופק כקו מנחה בלבד. אופטימיזציה עשויות להידרש כל נמלהibody; מידע ספציפי ניתן למצוא את רוב גליונות נתונים של נוגדנים זמינים מסחרית (לדוגמה, עובד דילול, זמן הדגירה, וכו &#39;). במהלך תהליך זה האחרון, היעד החלבון יזוהו באמצעות נוגדנים ספציפיים יופיעו כלהקה על הסרט. העמדה של הלהקה תלוי במשקל המולקולרי של חלבון המטרה, ואילו עוצמת הלהקה תלוי בכמות של ההווה חלבון המטרה. בדרך כלל, זה הושג לאחר שלוש substeps: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה: כדי למנוע הלא ספציפית של הנוגדן אינטראקציות עם קרום (הרווח העודף על הממברנה מכוסה בתמיסה מדוללת של חלבון גנרית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גשוש: החלבון של עניין הוא זוהה על ידי ספציפית <a title="ראשי נוגדן" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">נוגדן ראשוני</a> . לאחר נוגדן מאוגד העיקרי הוא נשטף, הממברנה חשופה נוגדן אחר קשור לכתב <a title="אנזים" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">האנזים</a> , <a title="חזרת peroxidase" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">peroxidase חזרת</a> (HRP). נוגדן זה משני מופנית כנגד חלק מינים ספציפיים של הנוגדן הראשוני (למשל, נוגדן נגד ארנב משני יהיה לאגד את כל הנוגדנים, ארנב שמקורו העיקרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוי: סוכן chemiluminescent משמש מצע אשר luminesce כאשר הם נחשפים HRP על נוגדן המשני. תגובה זו מייצרת הארה במקומה ביחס לכמות החלבון נחקר. האור מזוהה ולאחר מכן על ידי סרט הצילום. </li></ol> הליך הגנרית צעד אחר צעד מוצג להלן. נהלים מפורטים נוספים ניתן למצוא במדריך ריאגנטים ECL פלוס המערבי סופג הוראה איתור 5 או ברוב גיליון הנתונים הנלווה נוגדנים זמינים מסחרית. זמן דגירה, דילול נוגדן, וחסימת ופתרונות לשטוף צריך להיות מותאם באופן אמפירי את כל הנוגדנים. Immunodetection ההליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הכריכה הלא ספציפית על ידי דוגרים עם נפח מספיק של פתרון קזאין PBS 1% חסימת כדי לכסות את הממברנה כולה. מניחים על כיסא נדנדה דקות לפחות 30 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם הנוגדן הראשוני שלך (ספציפית לחלבון של עניין). הנוגדן העיקרי צריך להיות מדולל חסימת פתרון. עבור רוב הנוגדנים, מחייב להשלים מושגת לאחר דגירה 1-2 שעות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לחילופין, בשלב הדגירה יכול להתבצע בין לילה ב 4 ° C כדי להגדיל את יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון (לזרוק או לשמור על 4 ° C ל -20 ° C לשימוש חוזר) ובמהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBS, 0.05% Tween 20 (PBST) בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן HRP מצמידים משנית מדולל חסימת פתרון. בחר נוגדן אשר מזהה את החלק IgG של המין שבו נוגדן ראשוני הועלתה. הדגירה מתבצעת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון במהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBST בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך איתור chemiluminescent בהתאם להוראות היצרן. אנו משתמשים ריאגנטים ECL פלוס המערבי איתור סופג מן GE Healthcare (ראה התייחסות 5 הוראות ספציפיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום שלך בניילון נצמד או שקית ומניחים בתוך קלטת autoradiography. הקפידו לרוקן כל נוזל עודף ולהסיר את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את סרט הצילום קרום בחדר חשוך. התחלה עם זמן חשיפה 1 דקה ולהתאים לפי עוצמת האות הרצויה. </li></ol> טכנית טיפים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת מחייב הלא ספציפית מושגת על ידי הצבת קרום בתמיסה מדוללת של חלבון. אנו משתמשים בדרך כלל קזאין 1%, אך <a title="שור בסרום אלבומין" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">שור אלבומין בסרום</a> (~ BSA 2%) או שאינם שומן חלב יבש (~ 5%) יכול לשמש כחלופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריס שנאגרו מלוחים (TBS) ניתן להשתמש בכל ההליך במקום PBS. אנו ממליצים להשתמש כפות אם בכוונתך בדיקה הממברנה עם נוגדן phosphospecific. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש זוהר-in-the-כהה מדבקה (לדוגמא, Glogos של Stratagene ® II סמנים Autorad) טפח בחלק התחתון של הקלטת autoradiography יעזור לך ליישר הסרט שלך קרום שלך במהלך שלב הניתוח. </li></ol> אנליזה עכשיו שיש לך חשוף הסרט שלך, אתה תבין כי מבחינה מעשית, לא כל מערבונים לגלות חלבון כלהקה אחד נחמד. Additionaלהקות אני יכולה להופיע גם עקב מחייב הלא ספציפית של נוגדנים הן יסודי ותיכון. אות זה הרקע יכול להיות מופחת על ידי אופטימיזציה של תהליך immunodetection. בנוסף, פקד המתאים (למשל, תאים untransfected, siRNA שטופלו בתאים, וכו &#39;) יהיה שימושי כדי לקבוע את הספציפיות של נוגדנים שלך את המיקום המדויק של חלבון המטרה על הממברנה. לאחר סימון על הסרט את המיקום של תקן להקות מוכתמים בחלבון מן הקרום, העלילה יומן של כל משקל מולקולרי של תקני חלבון (ציר y) נגד ניידות יחסית המתאימים (ציר x). ניידות יחסית (RF) הוא מונח המשמש עבור יחס המרחק החלבון עבר מנקודת המוצא שלו (החלק העליון של הג&#39;ל) ביחס למרחק לצבוע מעקב או סמן נמוך משקל מולקולרי עברה (הקדמי ג&#39;ל) . קביעת קו רגרסיה של עקומת סטנדרט להשיג ערכים עבור השיפוע-y ליירט. משקל מולקולרי ידוע (גודל) של חלבון היעד שלך נאמד באמצעות Rf שלו שונה המשוואה הבאה: יומן משקל מולקולרי = (שיפוע) (ניידות או Rf של חלבון המטרה) + Y-ליירט (ראה התייחסות 6 לקבלת הוראות מפורטות). רמת הביטוי קירובים נלקחים על ידי השוואת עוצמת הלהקה של חלבון היעד של חלבון מבנית (למשל, טובולין או אקטין) או גן משק המוצר כגון GAPDH. זה מה שנקרא &quot;שליטה טוען&quot; לא צריך לשנות בין דגימות מתגלה באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי. התמונה עשויה להיות מנותח על ידי צפיפות נוסף כדי להעריך את כמות יחסית של חלבון מכתים ולכמת את התוצאות במונחים של צפיפות אופטית.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Migration+chart%3A+%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gel Migration chart: .</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf">http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , 
		
 <a target="_blank" href="https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E">https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NuPAGE+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">NuPAGE technical guide.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+Manual%2C+Mini+Trans-Blot+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf">http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf">http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis%2C+GE+Healthcare+Website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure">http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure</a> Forthcoming.</li>
<li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li>
<li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li>
<li>Penna,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , Forthcoming.</li>
</ol>

הנוהל המובא כאן משתמשת ביס, טריס ג&#39;ל עם MES ריצה חיץ כדוגמה denaturing הדף באמצעות NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה. בנוסף, מערכת זו מראש יצוק הג&#39;ל מאפשר הפרדה חלבון תחת denaturing או לא denaturing תנאים כמו גם להכיל מגוון רחב של משקלים מולקולריים (1-200 kDa עבור הג&#39;לים Bis-טריס 36-400 kDa עבור טריס- Acetate ג&#39;ל). בהתאם הניסוי שלך, אתה יכול לבחור לעקוב רק חלק הטכניקה המערבי סופג המתואר כאן שימוש ישיר מכתים ג&#39;ל ההליכים (למשל, כסף או מכתים Coomassie) או שיטת immunodetection ...

המערבי סופג שימוש nupage invitrogen novex ביס טריס minigels

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

המערבי סופג (או immunoblotting) הוא הליך סטנדרטי המאפשר לחוקרים מעבדה כדי לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את כמות יחסית של ההווה חלבון בדגימות שונות, לנתח את התוצאות של שיתוף immunoprecipitation ניסויים. בשיטה זו, חלבון מטרה מזוהה עם נוגדן ראשוני ספציפי במדגם נתון homogenate רקמה או לחלץ. הפרדת חלבונים על פי משקל מולקולרי מושגת באמצעות denaturing SDS-PAGE. לאחר העברת קרום, חלבון המטרה היא חקרה עם נוגדן ראשוני ספציפי זוהה על ידי chemiluminescence. מאז התיאור הראשון שלה, את הטכניקה המערבי סופג עבר מספר שיפורים, כולל מראש יצוק ג&#39;ל ידידותי למשתמש הציוד. במעבדה שלנו, בחרנו להשתמש אלקטרופורזה זמינים מסחרית מערכת NuPAGE מן Invitrogen. זהו ה-pH נייטרלי חדשניים, רציפה SDS-PAGE, טרום יצוק מיני ג&#39;ל המערכת. מערכת זו מציגה מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית Laemmli כולל: א) חיי מדף ארוכים יותר של טרום יצוק ג&#39;לים החל 8 חודשים עד שנה 1; ii) הפרדה מגוון רחב של משקלים מולקולריים 1-400 kDa בהתאם לסוג ג&#39;ל המשמש וכן iii) רבגוניות גדולה יותר (בטווח של אחוז acrylamide, סוג של ג&#39;ל, והרכב יוניים של למאגר ריצה). ההליך המתואר במאמר זה וידאו מנצל את מערכת Bis-טריס חיץ רציפה עם 4-12% Bis-טריס צבע ג&#39;ל MES ריצה חיץ, כמו איור של כיצד לבצע כתם המערבי באמצעות מערכת אלקטרופורזה Invitrogen NuPAGE. במעבדה שלנו, השגנו תוצאות טובות לשעתקו עבור יישומים ביוכימיים שונים בשיטה זו המערבי סופג.

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג&#39;ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (או אימונו-בלוטינג) הוא הליך מעבדה סטנדרטי המאפשר לחוקרים לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את ה...

שלום, שמי OB Pena. אני עובד במעבדת Michael Car במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של University of California. והיום אראה לכם כיצד לבצע Western blot באמצעות מערכת ה-PAGE החדשה של Individual Gene.זוהי טכניקה בסיסית לניתוח ביטוי של חלבון לצורך בדיקת תוצאות של ניסויי שקיעה. טכניקות Western blot כוללות שלושה שלבים בסיסיים: העמסה והרצה של הג'ל, העברה של החלבון מהג'ל לממברנת ניטרוסלולוז, וסריקה אימונונית (immuno probing) של הממברנה. היום אשתמש בטכניקה זו כדי לנתח את הביטוי של חלבון בתאים שעברו טרנסלציה.לפיכך, אני מכין את הדגימה כך שדגימות החלבון יספגו תמיד בבופר דגימה עבור X. בופר דגימה זה מכיל צבע המסייע בטעינת הדגימות וגליצרול המסייע לדגימה לשקוע לתחתית הבאר. הוא מכיל גם בופר ו-LDS. זהו חומר דטרגנט בעל מטען שלילי המעניק לחלבונים מטען שלילי, כך שהחלבונים ינדדו בשדה החשמלי בהתאם למשקל המולקולרי שלהם ולאחר מכן לפי המטען.יש להוסיף גם חומרי חיזור כגון DTT כדי לשבור את הגשרים הדיסולפידיים. לכן, הדגימות חוממו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 70 °C כדי לדנטר באופן מלא את החלבון, ולאחר מכן הועברו לסבב צנטריפוגה קצר. כעת אכין את הג'ל.אנו משתמשים בג'ל שהוכן מראש, לכן עלינו לחתוך את האריזה, להוציא את הג'ל ולהסיר את שכבת ההגנה. כעת אני מוכן להניח את הג'ל במערכת. יש לוודא שהג'ל מונח בכיוון הנכון, כך שהכיתוב פונ

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

פרוטוקול שלנו מדגים כיצד למזוג ג 'ל חלבון מרובים בכל פעם על ידי מיחזור Invitrogen Nupage קלטות Novex minigel וחומרים זולים שנרכשו בחנות שיפוץ הבית. שיטה זו חסכונית יעילה כולל דרך לאחסן את הג'לים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. על ידי מחדש באמצעות קלטות ג'ל פלסטיק של ג'ל זמינים מסחרית, מעבדות הפועלות ג'ל חלבון תכופים יכול לחסוך בעלויות משמעותיות לעזור לסביבה.

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

סרטון זה מתאר PAGE מולטימרי להפרדת קומפלקסים חלבוניים טבעיים מהומוגנאטים ברקמות. הטכניקה היא הכלאה של טכניקות כחולות-ילידיות-PAGE ו-SDS-PAGE. ניתן לאפיין ולחקור את המתחמים המופרדים על תפקידם בתפקוד התא.

Multimer-PAGE להפרדת קומפלקסים חלבוניים מקומיים: טכניקת הפרדה היברידית המורכבת מ- Blue Native-PAGE ו- SDS-PAGE להפרדת חלבונים מולטימריים שלמים מליזט רקמות

זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

התקדמות הכתם המערבי באמצעות פלואורסצנטיות אפשרה זיהוי של שינויים עדינים בביטוי החלבון המאפשר ניתוחים כמותיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חזקה לזיהוי מגוון חלבונים על פני מגוון מינים וסוגי רקמות. ניתנת גם אסטרטגיה להתגברות על בעיות טכניות נפוצות.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את הרכב החלבון גדול מקורי: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מהאונס שמן (נולד ב- napus) תפליט שיפה בגישה של תלת-ממד לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) שילוב של כחול מקורי (בסון) עם שני עמודים denaturing ואחריו זיהוי המוני spectrometric.

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

למד את שיטת ווסטרן בלוט באמצעות מערכת NuPAGE לניתוח ביטוי חלבונים בתאים מושתלים. הטכניקה כוללת הפרדת חלבונים באלקטרופורזה, העברה לממברנה וזיהוי באמצעות נוגדנים.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

גלה סרטונים נוספים