Name: Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin, Tribolium castaneum telomerazını rekombinant Tc TERT proteini ve toplam RNA kullanarak in vitro yeniden yapılandırma ve aktivitesini trap assay ile belirleme yöntemini. Bu yaklaşım, telomeraz fonksiyonu ve yapısal çalışmalar için önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pennsylvania Sağlık Bölümü, Ellison Tıp, V ve The Emerald Vakıflar tarafından desteklenen araştırma sundu.

1. Rekombinant Tc TERT Açıklanması <ol><li> TEV cleavable N-terminali ile sentetik Tc TERT plazmid içeren (de3) Rosetta dönüştürülmüş pLysS hücreleri altı taze plakalardan 2YT medya 6 L (6 x 2 L 1 L 2YT suyu içeren her Erlenmeyer şişeler şaşkın) İnokülasyon hexahistidine etiket. </li><li> 37 ° hücrelerin büyümesine ° C ise 0.5-0.6, OD 600 220 rpm sallayarak. </li><li> 1 mM IPTG ekleyerek protein ifadesi neden. </li><li> 30 sıcaklığını azaltın ° C, 150 rpm sallayarak yavaş ve hücreleri 4-5 saat protein ifade izin </li><li> Santrifüj yoluyla hasat hücreler 4 ° C ve 30 dakika 3500 rpm. </li><li> 20 ml 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 0.5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 0.1 mM phenylmethyl Sülfonil florür (PMSF) ve benzamidine içeren tampon her 1 L hücre pelletini tekrar </li><li> Flaş dondurma hücrelerin yavaş yavaş her damla sıvı N 2 darbe donuyor böylece sıvı nitrojen ile dolu bir 50 ml plastik konik tüp içine damlayan yeniden süspanse hücre karışımı . , -80 Donmuş hücreleri Mağaza ° C protein saflaştırılması için hazır olana kadar. </li></ol> 2. Tc TERT saflaştırılması <ol><li> Çözülme hücreleri oda sıcaklığında sıvı bir kıvama kadar ulaştı ve ardından sonication buz metal bardak taşımaktır. </li><li> 30 saniyede yaklaşık 51 W güç, duraklar, 30 saniyelik aralıklarla 2 dakika süreyle buz hücrelerinin sonikasyon. </li><li> Çözünür ve çözünmez protein fraksiyonları ayrı ve dikkatle Nikel afinite kromatografisi süpernatant kaldırmak için 20 dakika süreyle 18.000 rpm parçalanmış hücreleri aşağı spin. </li><li> Ni-NTA (nikel-nitrilotriacetic asit) 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 0.5 M KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 0.1 mM PMSF ve benzamidine içeren tamponu ile sütun dengelenmesi. </li><li> Yük ve reçine üzerinde süpernatant üzerinden akışını toplamak. </li><li> Sütun bütün kalıntı ve non-spesifik bağlı proteinler kaldırmak için 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 500 mM KCl, 15 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 0.1 mM PMSF içeren tamponu ile yıkayın. </li><li> Zehir Tc, 15 imidazol degrade kullanarak Ni-NTA reçine TERT - 300 mM ve SDS PAGE analizi için 3 ml kesirler toplamak . </li><li> Hangi kesirler Tc TERT protein içerir belirlemek ve bu kesirler bir Amicon 30 kDa (Millipore) filtresi konsantre SAYFA analiz kullanın. </li><li> Tc TERT kesirler bir ses daha ileri saflaştırma işlemi için en az 10 ml konsantre ol. </li><li> Tc TERT katyon değişim sütun (HS Poros, Applied Biosystems) 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 500 mM KCI, 1 mM DTT içeren tampon ile ön dengelenmiş üzerinde daha arındırılır. </li><li> HS Poros sütun üzerinde protein karışımı yerleştirin ve tüm protein ve nükleik asit kirleticiler çıkarmak için yıkama. </li><li> 500 mM KCl kalan tüm kirleri çıkarmak için 700 mM KCl içeren tamponu ile sütun yıkayın. </li><li> 1 M KCI tamponu ile HS Poros sütun kapalı Tc TERT protein Zehir. Bu noktada daha fazla protein% 99 saflıkta olmalıdır. </li><li> Protein geçen bir Superdex-200 boyutlandırma sütun (boyut dışlama kromatografisi - GE Healthcare) üzerinde herhangi bir protein agrega çıkarın, 25 mM Tris, pH 7.5,% 10 gliserol, 500 mM KCI, 1 mM TCEP içeren tampon ile ön-dengelenmiş. </li></ol> 3. Tribolium castaneum böceği kültür <ol><li> T. castaneum böcekler başlangıçta Dr. S. Brown, Biyoloji Bölümü, Kansas Eyalet Üniversitesi tarafından bir hediye olarak verilmiştir. </li><li> Başlangıç ​​T. bir kapta un 28.5 g ve 1.5 g kuru ekmek mayası ile yüz yetişkin böcekler ekleyerek castaneum kültür. </li><li> Oda sıcaklığında ve 3-4 hafta boyunca karanlık, nemli ortamlarda saklayın böceği kültürlerde üreme ve büyüme için izin vermek. Böceği depolama alanında su içeren nemli bir ortam sağlamak için bir behere koyun. </li><li> RNA izolasyonu için gerekli böceği larvaları Hasat. Kalan larvalar aynı kültürü tutmak, yetişkin olgun izin verin. </li><li> Her ay en aktif böcekler (en fazla yüz daha), kendi gıda tedarik doldurmak için taze un ve maya içeren yeni bir balona transfer. </li></ol> 4. T. castaneum toplam RNA izolasyonu <ol><li> Hasat 20 yetişkin böcekler ve un / maya kültürü ayırarak kültür böceği larvaları (her kültür, 500-1000 larvaları arasında içermelidir). Un veya taşlama önce böcekler bağlı maya parçacıkları ortadan kaldırır. </li><li> Tezgah alanı, harç ve böcekler taşlama önce ribonucleases tüm izlerini kaldırmak için RNaseZap (Ambion A.Ş.) ile bu işlem için kullanılan havaneli (eldiven gibi tedavi düşünün) sterilize edin. </li><li> Sıvı N 2, bir havanda ve t kullanarak ince bir toz haline larvaları Grindtoz ekstraksiyon tamponu eklenir kadar toz donmuş kalmasını sağlamak için sıvı N 2 korurken, 50 ml santrifüj tüpüne ransfer. </li><li> Aşırı sıvı N 2 toz buharlaştırmak için izin verin. Sıvı N 2 buharlaştı sonra, 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EGTA, 0,1 mM benzamidine, 200 mM KCl, 10 içeren ekstraksiyon tamponu 200 ul böceği tozu (20 böceği larvaları başına) homojenize gliserol,% 10 mM, 30 dakika boyunca buz üzerinde RNasin, pH 7.5 ve inkübe imidazol ve 20U. </li><li> 4 20 dakika 15.000 rpm'de Homojenat Santrifüj ° C, supernatant ve flash toplamak sıvı N 2 örnek dondurmak. Gerekirse, numuneler -80 ° C gece boyunca saklanabilir. </li><li> RNeasy Mini Kiti (Qiagen) kullanılarak total RNA ayıklayın. </li></ol> 5. Tribolium castaneum telomeraz in vitro sulandırıldıktan <ol><li> T. 50 ul ile 20 mg rekombinant Onun etiketli Tc TERT karıştırın castaneum toplam RNA bağlayıcı tampon içeren 25 mM Tris-HCl, 200 mM KCl,% 10 gliserol, 5 mM β-mercaptoethanol ve 10 mM imidazol, pH 7.5. </li><li> Toplam RNA karışımı az iki saat için 22 ° C T. - Tc TERT inkübe RNA bozulmasını önlemek için RNasin inhibitörü varlığı castaneum lizat. </li><li> Ni-NTA sütun üzerinde lizat kirleri ve aşırı RNA kaldırmak için karmaşık arındırın. </li></ol> 6. Telomeraz tekrar amplifikasyon protokolü (TRAP) deneyleri <ol><li> Ni-NTA saflaştırılmış T. 4 mikrogram Mix 50 ul uzama tampon castaneum telomeraz içeren 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 7.5 mM MgCl 2, 63 mM KCl,% 0.05 'Tween 20, 1 mM EGTA,% 0.01 BSA, 0.5 mM dNTP, 1 mcM TCAS-TS DNA astar (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), ve 30 ° C 60 dakika, sulandırılmış T. TCAS-TS DNA astar uzama izin karışımı inkübe castaneum telomeraz. </li><li> Reaksiyon karışımı eşit miktarda fenol kloroform eklenerek uzatılmış tek iplikli DNA (ssDNA) ayıklayın. Emülsiyon homojen karışımı hafifçe kadar çalkalayınız. </li><li> Örnek Santrifüj beş dakika 12.000 rpm'de 4 ° C kirleticilerden uzak ssDNA ayrı. </li><li> 1,5 ml Eppendorf tüp örnek üst sulu tabaka transfer nihai konsantrasyonu 10 mM NaOAc (pH 5.0), 1 mM MgCl 2 ve% 66.4 EtOH ve sonra örnek -20 geceleme çökelmesine izin ° C. </li><li> 4 otuz dakika 15.000 rpm'de örnek Spin ° C pelet çöktürülmüş ssDNA. Bir pipet kullanarak çözüm Durusu ve sonra, kalan NaOAc ve MgCl 2 örnek yıkamak için örnek% 70 EtOH 200 ul ekleyin . Aynı hız ve sıcaklık örnek yeniden pelet az beş dakika için örnek santrifüjleyin. </li><li> Bir pipet kullanarak EtOH çözüm Durusu ve Eppendorf tüp, üç dakika boyunca oda sıcaklığında açık inkübe izin vererek etanol kalan izlerini ortadan kaldırmak. Örnek etanol mevcut olan PCR adım ile müdahale edecektir. </li><li> PCR reaksiyon tamponu içeren 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 100 mcM dNTP (dATP, 50 ul ssDNA pelet (telomeraz uzatılmış ürün ve TCAS-TS astar içeren) yeniden süspanse dGTP ve dTTP), 10 mcM [32 P] dCTP, 1 mcM TCAS-CX astar (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') ve 1.25 U Taq DNA polimeraz. </li><li> PCR% 12 poliakrilamid jel üzerinde görünür, böylece telomeraz uzama ürünleri (94 ° C, 30 saniye boyunca 50 ° C 30 saniye ve 72 ° C için 1 dakika 29 siklus) yükseltmek. </li><li> Tris-borat-EDTA (TBE) 44.5 mM Tris, 44.5 mM Borik Asit, 1 mM EDTA, otuz dakika, pH 8 çalıştırmadan önce PCR örnekleri içeren tampon çalışan% 12 jel Öncesi çalıştırın. Ön çalışan ve PCR reaksiyonları ile jel yükledikten sonra 1.5-2 saat boyunca, 4 ° Celsius veya buz üzerinde 185 Volt jel çalıştırın. </li><li> Jel Kuru ve aktivite görselleştirmek için fosfor görüntüleme plaka kullanın. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Boyut dışlama kromatografisi sonra saflaştırılmış Tc TERT bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Arıtma sonra konsantre protein,% 12 SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalışan ve saf fazla% 99 (Şekil 2A) olduğu gösterilmiştir. Boyutu hariç tutma (S200) kromatogram ve aynı zamanda saflık ve saflaştırılmış protein örnek agrega eksikliği göstermek için (Şekil 2B). Son verim değişebilir rağmen tamamlanmıştır tüm arıtma adımlardan sonra 5 mg protein verimi elde edilir. Sulandırılmış T. için bir temsilci TRAP yönteminin Mitchell ve arkadaşları tarafından rapor olarak castaneum telomeraz Şekil 3'te gösterilmiştir. 12. Ancak, telomeraz ürünleri basamaklı merdiveni şeritli 1 görülebilirşeritleri 2 ve 3 sırasıyla RNaz tedavi telomeraz ve TERT aktif sitesi mutant (D251A) örnekleri mevcut değildir. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Rekombinant Tc TERT sulandırıldıktan ilgili adımları akış şeması. İlk olarak, rekombinant Tc TERT E. fazla ifade edilir coli. Protein sonra nikel, katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi arındırılır. T. castaneum böcekler evde kültür ve larvaların total RNA izole etmek için kullanılır. Aktif telomeraz saflaştırılmış Tc TERT ve toplam RNA sulandırmak telomeraz RNP kompleksi sonra karıştırılır ve bir sonraki TRAP yönteminin RNP kompleks onaylamak için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Tc TERT protein Boyut dışlama kromatogram ve SDS PAGE analizi. Tc TERT protein boyut dışlama kromatografisi sonra (A)% 12 SDS-poliakrilamid jel. Yüksek bir izoelektrik noktası (pI 9.8), çünkü Tc TERT protein (70 kDa) SDS PAGE jel üzerinde daha hızlı geçirir. Tc TERT protein (B) Ölçü dışlama kromatogram (Superdex S200) . <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. In vitro TRAP deneyleri Tribolium castaneum telomeraz Mitchell ve ark adapte sulandırılmış 12. Lane 1: vahşi tip Tc TERT ve toplam RNA izole böceği larvaları. Lane 2: vahşi tip Tc TERT ve RNaz larvaları toplam RNA ve hücre özleri tedavi. Lane 3: aktif sitesi mutant Tc TERT (D251A) ve böcek larvaları toplam larva RNA.

<ol><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%3A+no+end+in+sight%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li>
<li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li>
<li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li>
<li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li>
<li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase%3A+implications+for+RNA+recognition+and+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li>
<li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li>
</ol>

Burada sunulan yöntemi büyük miktarlarda T. katalitik subunit üretim için izin verir çözünür, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif olarak castaneum telomeraz TERT. Tc TERT üzerinden ifade yöntemi yukarıda belirtilen sıcaklık ya da hücre yoğunluğu ince değişikliklere duyarlı ve protein ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde etkileyebilir . Özellikle, biz optik yoğunluğu 600 nm&#39;de 0.5 ulaşmadan önce protein ekspresyonu hücreleri indükleyen ya da sıcaklık düşürücü 30 ° C indüksiyon önce...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Rosetta (de3) plysS Hücreler </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Broth </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Altın Biyoteknoloji </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX sonikatör 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> Akta Arıtma FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Reçine </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Cihaz </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Ambalaj Poros 50 HS Güçlü Katyon Değişim </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> Ambalaj Poros 50 HQ Güçlü Katyon Değişim </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 Boyut Dışlama Sütun </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: 10mM Tris, pH: 8, 1mm EDTA ile izoamil 25:24:1 </td><td> Sigma </td><td> P3803-100 ml </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Rekombinant Rnasin Ribonükleaz İnhibitörü </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA oligonükleotidler </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

active t. in vitro sulandırma castaneum telomeraz

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) izolasyonu ve aktif T. sulandırıldıktan yöntemleri mevcut in vitro castaneum telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık. Telomeraz, bir uçtan-uca füzyon ve bozulmaya karşı korumak için hizmet doğrusal kromozomların 2 3 &#39;sonuna kadar, telomer denilen kısa DNA tekrarlar, ekleyen özel bir ters transkriptaz 1. DNA replikasyonu takiben, kısa segment 3 kromozom sonunda kaybolur ve telomeraz olmadan sonunda kendi Hayflick Sınırı 4 ulaşana kadar, hücre bölünmesi devam eder. Ayrıca, telomeraz yetişkinlerde en somatik hücre 5 içinde uyuyan, ancak kanser hücreleri, hücre ölümsüzlük 7 teşvik 6 aktif . Enzimin katalitik alt birim ve şablon TERT telomer 8,9 sentezlemek için kullandığı içeren ayrılmaz bir RNA bileşeni (TER), oluşan protein altbirim (TERT), minimal telomeraz enzimi iki temel bileşenden oluşmaktadır. 2008&#39;den önce, ayrı ayrı telomeraz etki alanları için sadece yapıları 10,11 çözüldü. T. katalitik altbirim aktif 12 kristal yapının belirlenmesi, bu alanda büyük bir atılım geldi castaneum telomeraz, Tc TERT 1. Burada, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif, çözünür Tc TERT ve telomeraz aktivitesi testleri için in vitro telomeraz RNP kompleks sulandırıldıktan büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sunuyoruz. Kullanılan deneysel yöntemler hakkında genel bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmiştir.

Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT izolasyonu (yöntemleri mevcut<em&gt; Tc</em&gt; TERT) ve aktif sulandırıldıktan<em&gt; T. castaneum</em&gt; Telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık<em&gt; In vitro</em&gt;.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Telomerazın katalitik alt birimi olan TERT'yi, yapısal çalışmalar için yeterli miktarlarda izole etme girişimleri, daha fazla... için sınırlı başarıyla sonuçlanmıştır.

Bu prosedürün genel amacı, Trium Castine telomerazını in vitro olarak yeniden oluşturmak ve aktivitesini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle rekombinant his etiketli, Trillium Castine turt veya TC turt proteininin e coli'de eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Eksprese edilen TC turt proteini daha sonra çeşitli kromatografi adımlarıyla saflaştırılır.Prosedürün bir sonraki adımı, trium Castine böceklerini kültüre etmek ve trium castane böceği larvalarından toplam RNA'yı izole etmektir. Ardından, rekombinant TC turt'un ekstrakte edilen toplam RNA ile karıştırılmasıyla telomeraz enzimi in vitro olarak yeniden oluşturulur. Sonuç olarak, rekombinant protein ve toplam RNA'dan in vitro olarak oluşturulan telomerazın, trap assay'de görselleştirildiği üzere bir telomeraz enzimi aktivitesi ürettiği gösterilebilir.Bu yöntem trium KE telomerazı hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer protein nükleik asit kompleksleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü kınkanatlı toplam RNA izolasyonu RNA degradasyonuna karşı son derece hassastır ve bu nedenle uygun yeniden oluşumun sağlanması için büyük özen gösterilmelidir. Bu protokol,

in-vitro-reconstitution-of-the-active-t-castaneum-telomerase

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Telomeraz yenidoğan beyninde ve ayrıca yetişkin beyninin farklı bölgelerinde ifade edilir. Fare beyninin çeşitli bölgelerindeki telomeraz aktivitesinin analizi ve erkek ve dişi fare beyinleri arasındaki telomeraz aktivitesindeki farklılıkların tespiti için toksik olmayan, zaman kazandıran bir TRAP testi sunuyoruz.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Telomer ve telomeraz yaşlanma ve tümör oluşumunda önemli roller oynar. Bu protokolün amacı, murin ile indüklenebilir iki telomeraz knock-in alelinin nasıl oluşturulacağını ve bunların doku dejenerasyonu/rejenerasyonu ve kanser çalışmalarında nasıl kullanılacağını göstermektir.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Bu çalışmada, aktif geliştiricilerin nasıl tanımlanabileceğine ve deneysel olarak doğrulanabileceğine dair deneysel bir iş akışı sağlıyoruz.

Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

İnsan revers transkriptaz (TERT) hem de çift iplikçikli RNA RNA'ya bağımlı RNA polimeraz faaliyetleri ile telomeric DNA sentezler. Burada, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz etkinliği endojen TERT algılamak için yeni kurulan bir tahlil açıklayın.

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Burada, fare embriyonik kök Southern blot ve/veya PCR kullanarak hücre Homolog rekombinasyon olayları tanımlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem ile nonmuscle myosin II genetik değiştirme fare modelleri geleneksel embriyonik kök hücre tabanlı Homolog rekombinasyon aracılı hedefleme teknolojisi kullanarak oluşturma tarafından örneklenir.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

Öğrenin, Tribolium castaneum telomerazını rekombinant Tc TERT proteini ve toplam RNA kullanarak in vitro yeniden yapılandırma ve aktivitesini trap assay ile belirleme yöntemini. Bu yaklaşım, telomeraz fonksiyonu ve yapısal çalışmalar için önemli bilgiler sağlar.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Daha fazla video keşfet