Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We presenteren twee onafhankelijke, microscoop-gebaseerde tools om de veroorzaakte nucleaire en cytoskelet vervormingen in enkele, levende hechtende cellen te meten in reactie op globale of lokale stam toepassing. Deze technieken worden gebruikt om de nucleaire stijfheid (dat wil zeggen, vervormbaarheid) te bepalen en om intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet sonde.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lombardi, M. L., Zwerger, M., Lammerding, J. Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation. J. Vis. Exp. (55), e3087, doi:10.3791/3087 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In de meeste eukaryotische cellen, de kern is de grootste organel en is meestal 2 tot 10 keer stijver dan de omringende cytoskelet, bijgevolg, de fysische eigenschappen van de kern belangrijke mate bijdragen aan de algehele biomechanische gedrag van cellen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Bijvoorbeeld bij het ​​migreren van neutrofielen en binnendringende kankercellen, de nucleaire stijfheid kan een groot obstakel vormen bij extravasatie of passage door smalle ruimtes binnen weefsels. 1 Aan de andere kant, de kern van cellen in mechanisch actief weefsel zoals spier vereist voldoende structurele steun aan bestand tegen herhaalde mechanische belasting. Belangrijk is dat de kern nauw geïntegreerd in de cellulaire architectuur, het is fysiek verbonden met de omliggende cytoskelet, dat is een kritische voorwaarde voor de intracellulaire beweging en positionering van de kern, bijvoorbeeld in gepolariseerde cellen, synaptische kernen op neuromusculaire verbindingen, of in migrerende cellen. 2 is niet verrassend, mutaties in de nucleaire enveloppe eiwitten zoals lamins en nesprins, die een kritische rol spelen bij het ​​bepalen van de nucleaire stijfheid en nucleo-cytoskeletale koppeling, zijn onlangs resulteerde in een aantal menselijke ziekten, waaronder Emery- Dreifuss spierdystrofie, limb-girdle spierdystrofie, en gedilateerde cardiomyopathie. 3 Om de biofysische functie van diverse nucleaire envelop eiwitten en het effect van specifieke mutaties te onderzoeken, hebben we experimentele methoden om de fysische eigenschappen van de kern studie in enkele, levende cellen onderworpen aan globale of lokale mechanische storing. Het meten van geïnduceerde nucleaire vervormingen in reactie op precies toegepast ondergrond stam toepassing levert belangrijke informatie over de vervormbaarheid van de kern en maakt kwantitatieve vergelijking tussen verschillende mutaties of cellijnen die deficiënt zijn voor specifieke nucleaire envelope eiwitten. Gelokaliseerde cytoskelet stam applicatie met een microneedle wordt gebruikt om deze test te vullen en kan aanvullende informatie opleveren over intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet. Studeren nucleaire mechanica in intacte levende cellen behoudt zich het normale intracellulaire architectuur en vermijdt mogelijke artefacten die kunnen ontstaan ​​bij het werken met geïsoleerde kernen. Bovendien ondergrond stam toepassing presenteert een goed model voor de fysiologische stress ervaren door cellen in de spieren of andere weefsels (bijvoorbeeld vasculaire gladde spiercellen blootgesteld aan schip-stam). Ten slotte, terwijl deze tools zijn primair ontwikkeld om nucleaire mechanische studie, kunnen ze ook worden toegepast op de functie van cytoskeleteiwitten en mechanotransductie signalering te onderzoeken.

Protocol

1. Ondergrond spanning toepassing

De meting van genormaliseerde nucleaire stam omvat de voorbereiding van de stam gerechten met transparante, elastische siliconen membranen als celkweek oppervlak, plating cellen op de gerechten, en het verwerven van beelden van de cellen voor, tijdens en na (uniaxiale of biaxiaal) stam toepassing.

De voorbereiding van siliconen membraan gerechten en hechting van cellen

  1. Elke stam gerecht bestaat uit een op maat gemaakt bodemloze kunststof schotel met een diameter van 3 "en een plastic O-ring om een ​​siliconen membraan, die dient als de celcultuur ondergrond vast te houden. Voor de bereiding van de stam gerechten, klem een ​​4" x 4 "stuk van siliconen membraan tussen de O-ring en de schotel. voorzichtig wegknippen van de overtollige membraan, spoelen met gedemineraliseerd water, en autoclaaf de stam gerechten.
  2. Markeer een referentiepunt in het midden onder het membraan (aan de buitenkant) voor het coaten van de siliconen membranen met extracellulaire matrix moleculen (bijv. fibronectine). Deze mijlpaal zal helpen bij het identificeren dezelfde cellen in de stam experimenten. (Optioneel: Voor eenassige rek applicatie zijn twee parallel lopende strepen van plakband aangebracht rond het referentiepunt om vervorming van het membraan in een dimensie te beperken.)
  3. Om een ​​optimale celhechting, jas de siliconen membranen te voorzien van 3 ng / ml fibronectine verdund in 10 ml PBS of een ander geschikt extracellulaire matrix eiwitten. Dek de schotel stam met een omgekeerde 10 cm polystyreen schotel, en incubeer de gerechten 's nachts bij 4 ° C.
  4. Op de volgende dag, een keer spoelen van de membranen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om overtollig eiwit te verwijderen. Vul de schotel met 10 ml groeimedium (Dulbecco's Modified Eagles Medium (hoog glucose) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) en zet apart.
  5. Muis embryonale fibroblasten zijn getrypsiniseerd met 0,05% trypsine en uitgezet in groeimedium op ongeveer 30% confluentie op de gecoate siliconen membraan schotel en incubeer gedurende 24 - 48 uur onder normale omstandigheden cultuur.

Ondergrond spanning experimenten

  1. Set-up van de microscoop voor experimenten. De experimenten worden uitgevoerd op een omgekeerde microscoop met een digitale camera geschikt voor fluorescentie microscopie, fase-contrast of DIC, met behulp van een 60x objectieve en juiste beeldacquisitie software (bijv. IPLab of Metamorph). Een rechtopstaande microscoop is niet geschikt voor deze toepassing. De stam apparaat bestaat uit een basisplaat die past op de microscoop podium en heeft een centrale cilindrische plaat die dient om de stam van toepassing zijn op het centrale deel van de siliconen membraan, een beweegbare plaat die de stam gerecht houdt en dat kan op en neer glijden op vier begeleiding pinnen, evenals een 5-pond gewicht plaat om een ​​belasting toe te passen.
  2. Om de kernen te visualiseren, de cellen incuberen in de stam schotel met 1 ug / ml van Hoechst 33342 gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Aspireren uit de midden-en te vervangen door 15 ml fenol-rood vrij groeimedium (fenol-rood vrij Dulbecco's Modified Eagles Medium (hoog glucose) met 25 mM Hepes, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine). Schroef de stam schotel in de schaal houder plaat. Zorgvuldig vet aanbrengen (Braycote 804 Vacuum Grease) om de omtrek van de onderkant van de siliconen membraan om ervoor te zorgen glijden van het membraan langs de centrale glasplaat. Zorg ervoor dat houden het centrale deel van het membraan duidelijk.
  3. Plaats de basisplaat op de microscoop podium. Mount schotel houder plaat voorzichtig op de bodemplaat. Verzekeren dat in de eerste ruststand, losjes de siliconen membraan van de stam schotel rust op de centrale glasplaat.
  4. De eerste, focus op de bodem van de siliconen membraan en vinden het centrale zwarte referentie stip. De stip zal dienen als uitgangspunt voor alle foto acquisities en helpt bij het lokaliseren van de dezelfde cellen tijdens en na het rekken. We maken gebruik van een op maat geschreven geautomatiseerde imaging programma om de posities van de cellen op te slaan en om deze cellen te verplaatsen tijdens het experiment, maar dit kan ook handmatig worden bereikt.
  5. Vanaf de stip, stelt u de focus naar de cellen en de bovenkant van de siliconen membraan te visualiseren. Zoek goed gespreide cellen met centraal gelegen kernen en het verwerven van een fase-contrast en een fluorescentie beeld van de nucleaire Hoechst vlek. De fase contrast afbeelding moet zich richten op de cel omtrek en de siliconen membraan, terwijl de fluorescentie beelden moet zich richten op het centrale vlak van de kern.
  6. Na het verkrijgen van foto's van 5 tot 15 cellen, gaat terug naar het centrale punt. Langzaam toepassing van het gewicht op de stam gerecht, wat resulteert in een uniforme toepassing stam in het midden van de schotel. De maximale toegepaste substraat stam wordt beperkt door het nylon afstandhouders geplaatst op de verticale uitlijning pennen (begeleiding pinnen).
  7. Focus op de onderkant van de siliconen membraan en weer vinden de referentie punt. Vanaf hetdot, verplaats de dezelfde cellen en opnieuw te verwerven een fase contrast en een fluorescentie beeld van de cellen en kernen onder volle druk en probeerde die nauw aansluit bij de kern vlakken van de eerste beelden. Dit proces moet niet meer dan 10 minuten actief verbouwing en aanpassing van de cel naar de gespannen ondergrond te voorkomen.
  8. Nadat alle corresponderende beelden zijn verkregen, terug te gaan de microscoop podium naar het beginpunt. Verwijder voorzichtig het gewicht van de schotel houder plaat en laat de siliconen membraan om te ontspannen. Indien nodig, duw de stam schotel totdat deze in de beginpositie. Dan verwerven fase contrast en fluorescentie beelden van de post-stam cellen zoals hierboven beschreven voor de stam beelden.

Analyse

  1. Beelden van cellen en fluorescent gelabelde kernen voor, tijdens en na de stam applicatie worden geanalyseerd om de genormaliseerde nucleaire stam te berekenen. In ons laboratorium, gebruiken we een op maat geschreven MATLAB script voor de analyse, maar een aantal alternatieve opties zijn beschikbaar. De analyse is uitgevoerd in drie stappen.
  2. Ten eerste, de toegepaste substraat stam te berekenen, zijn de posities van 3 tot 6 controle punten op het membraan handmatig afgestemd tussen de overeenkomstige pre-, full-en post-stam beelden. De MATLAB-programma berekent vervolgens het toegepaste membraan stam door het vergelijken van de posities van matching controle punten tussen de pre-stam en full-stam beelden en ook de resterende spanning tussen de pre-stam en de post-stam beelden. Tegelijkertijd, zijn de controle punten worden gebruikt om het beeld te paren, die zal helpen om beschadigde of losmaken cel (zie figuur 1) te detecteren registreren.
  3. In een tweede stap worden kernen handmatig geselecteerd met behulp van een apart MATLAB programma dat nucleaire stam voor elke individuele kern door het afstemmen van een nucleaire grootte of intranucleaire markers tussen overeenkomstige pre-, full-en post-stam fluorescerende beelden berekent. Om rekening te houden voor kleine variaties in de toegepaste membraan spanning tussen de verschillende experimenten, drukken we de resultaten als genormaliseerde Nuclear Strain, gedefinieerd als de verhouding van geïnduceerde nucleaire stam tot toegepaste membraan stam die wordt berekend voor elke kern. De MATLAB scripts zijn verkrijgbaar bij de Lammerding laboratorium op aanvraag.
  4. Tot slot is iedere kern gevalideerd, met uitzondering van metingen van cellen die los of beschadigd raken tijdens de stam applicatie (figuur 1).

2. Microneedle manipulatie assay

Bereiding van de gerechten, hechtende cellen, en micronaaldjes

  1. Incubeer 35 mm glazen bodem celkweek gerechten met een lage concentratie van fibronectine (0.5ug/ml) in gebufferde zoutoplossing Salt Hank's (HBSS) of een ander geschikt extracellulaire matrix eiwitten gedurende 2 uur bij 37 ° C. Was gerechten met HBSS twee keer en voeg 2 ml groeimedium om de schotel voordat u verder gaat met de volgende stap.
  2. Muis embryonale fibroblasten zijn getrypsiniseerd met 0,05% trypsine en uitgezet in 2 ml groeimedium gezaaid op 7,5 x 10 4 cellen / ml op de fibronectine gecoate glazen bodem gerechten. Plaats cellen terug in de incubator 's nachts. Plaats cellen terug in de incubator 's nachts. Men moet optimaliseren van het aantal cellen om single, aanhanger, niet-confluente cellen voor andere celtypen te verkrijgen.
  3. Trek de micronaalden, gemaakt van borosilicaat capillairen, tot een diameter van ongeveer 1 tot 3 micrometer met een commerciële pipet trekker (bijvoorbeeld Sutter Instrument Company) tip.

Microneedle manipulatie experiment

  1. De volgende dag, Incubeer de cellen met MitoTracker mitochondriale vlek (600 uM, Invitrogen) en Hoechst 33342 nucleaire vlek (1 ug / mL) toegevoegd om de groei medium voor 30 minuten in een 37 ° C incubator.
  2. Was de cellen een keer in HBSS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en voeg dan fenol-rood vrij groeimedium aan de cellen voor de beeldvorming.
  3. Een aan te schaffen beeld van de enkele cel zonder de microneedle ingevoegd in het cytoskelet in fasecontrast, een fluorescerende beeld van de Hoechst 33342 vlek en een fluorescerende beeld van de mitochondriale, vlek met een 60x doelstelling (0,70 NA, Plan-Achromat) op een omgekeerde microscoop met een digitale charge-coupled device camera.
  4. Met behulp van een micromanipulator (bijv. InjectMan NI 2, Eppendorf), zorgvuldig steek de microneedle in het cytoplasma van een cel een vaste afstand (meestal 5 micrometer) uit de buurt van de nucleaire periferie en neem een ​​fase contrastrijk beeld, een fluorescerende beeld van de Hoechst 33342 vlekken en een fluorescerende beeld van de mitochondriale vlek. Voor deze toepassing, het helpt om de micromanipulator controle door middel van een computer, bijvoorbeeld Windows Hyperterminal, om een ​​consistente micromanipulatie procedures te bereiken.
  5. Verplaats de microneedle, een bepaalde afstand (meestal 10 of 20 urn) in de richting van de cel periferie bij 1 um / sec, terwijl tegelijkertijd het verzamelen van fluorescentie-en fase-contrast beelden elke 10seconden. Omdat de microneedle is verhuizen naar een bepaalde afstand in de richting van de cel periferie. Met de gekozen parameters, zoals de microneedle is verhuizen naar een bepaalde afstand in de richting van de cel periferie, zal dit overeenkomen tot 2-3 frames tijdens de manipulatie proces.
  6. Tot slot krijgen extra beelden na de microneedle is verwijderd uit het cytoskelet.

Analyse

  1. Displacement maps worden berekend met behulp van een op maat geschreven MATLAB script is gebaseerd op het bijhouden van fluorescent gelabelde kenmerken van de kern en cytoplasma. (De MATLAB script is verkrijgbaar bij de Lammerding laboratorium op aanvraag). Het programma maakt gebruik van een genormaliseerd kruiscorrelatie algoritme tussen kleine afbeelding regio's (ongeveer 10 micrometer x 10 micrometer in omvang en op een afstand 5 micrometer van elkaar) in de volgende afbeelding frames. Voor elke regio centrum, de verplaatsing in de x-en y-richtingen zijn berekend als de verschuiving tussen de oorspronkelijke locatie en de nieuw geïdentificeerde positie en weergegeven als een verplaatsing vector en ook opgeslagen als numerieke waarden. Van de displacement maps, kan de gemiddelde verplaatsingen binnen vooraf bepaalde regio's worden berekend. Merk op dat het cytoskelet verplaatsingen zijn gebaseerd op de fluorescentie kanaal voor cytoskelet markers (bijv. MitoTracker mitochondriale vlek), terwijl nucleaire verplaatsingen worden berekend op basis van de fluorescentie-kanaal naar de Hoechst 33342 signaal. Voor onze toepassing hebben we regelmatig onderzoeken de volgende regio's: (i) het cytoskelet stam op de stam plaats van toediening, dat wil zeggen, de microneedle inbrengen site; (ii) de nucleaire stam in een gebied in de kern naar de stam plaats van toediening, (iii) de nucleaire weg stam in een nucleaire omgeving van de plaats van toediening, en (iv) het cytoskelet stam in een cytoplasmatisch gebied in de kern. Daarnaast kan men ook direct te meten nucleaire verlenging van fase contrast of Hoechst 33342 fluorescentie beeldsequenties. In dit geval, toegepast nucleaire stam wordt berekend door de nucleaire rek (ΔL = L - L 0) door de eerste lengte, L 0, waarbij L de uiteindelijke lengte van de kern is aan het einde van de stam toepassing en L 0 is de oorspronkelijke lengte van de kern. Voor cellen met een intact nucleo-cytoskelet koppeling, zal de kern verlengen naar de stam toedieningsplaats. In tegenstelling, in cellen waarin nucleo-cytoskelet koppeling is verstoord, dat wil zeggen krachten minder efficiënt verzonden tussen het cytoskelet en de kern, de kern zal naar verwachting aanzienlijk minder verlengen in de richting van de stam toedieningsplaats. Zo, de nucleaire vervormingen daalde in reactie op cytoskelet stam toepassing impliceren een (gedeeltelijke) ontkoppeling tussen de kern en cytoskelet.

3. Representatieve resultaten:

Ondergrond spanning toepassing

We verkregen beelden voor, tijdens en na de stam toepassing op muis embryonale fibroblasten van heterozygote en homozygote lamine A / C-deficiëntie (Lmna + / - en Lmna - / -), en de wild-type (Lmna + / +) muizen en vervolgens berekende de genormaliseerde nucleaire stam voor elke cel. Na analyse worden de kernen gevalideerd en cellen die beschadigd raken of in te trekken tijdens de stam toepassing zijn uitgesloten van de analyse. Figuur 1A toont kernen van de drie cellen die geldig zijn, terwijl Figuur 1B toont cellen die moeten worden uitgesloten van de analyse. Genormaliseerde nucleaire stam gegevens worden samengevoegd uit ten minste drie onafhankelijke experimenten (elk met metingen van ~ 50 tot 10 kernen) en in vergelijking met andere cel of behandelgroepen door statistische analyse. Toegenomen genormaliseerde nucleaire stam geeft minder nucleaire stijfheid, zoals te zien in cellen met een verminderde expressie van de nucleaire envelop eiwitten lamine A / C (figuur 2).

Microneedle manipulatie assay

Voor de microneedle manipulatie test, we kernenergie en het cytoskelet verplaatsingen belicht tijdens het gelokaliseerde cytoskelet stam toepassing. Cellen die beschadigd raken of los zijn uitgesloten van de analyse. Voor de analyse, meten we de omvang van de nucleaire en cytoskelet bewegingen naar de kracht toepassing site in enkele, hechtende cellen. Bijvoorbeeld, in figuur 3, we volgen mitochondriale (marker voor het cytoskelet) verplaatsingen voor en na cytoskeletale stam en vervolgens plot van de verplaatsingen als vectoren. Elke vector staat voor de verplaatsing berekend als de verschuiving tussen de oorspronkelijke locatie en de nieuw geïdentificeerde positie. Gebieden met een lage intensiteit afbeelding of onvoldoende structuur (bijvoorbeeld regio's buiten de cel) zijn uitgesloten van de analyse. Het cytoskelet en nucleaire verplaatsingen worden vervolgens gekwantificeerd in geselecteerde gebieden op het verhogen van afstanden van de stam toepassing site (figuur 4, gebieden die overeenkomen met de gekleurde boXES in kader). In de muis embryonale fibroblasten met intacte nucleo-cytoskelet koppeling, zijn krachten overgebracht door de hele cel, wat resulteert in geïnduceerde nucleaire en cytoskelet vervormingen die langzaam verdwijnen uit de buurt van de stam toepassing site (figuur 4). In tegenstelling, fibroblasten met verstoorde nucleo-cytoskelet koppeling (of gewijzigde organisatie van het cytoskelet) weer te geven gelokaliseerde verplaatsingen in de buurt van de plaats van toediening, zoals weergegeven in figuur 4 en slechts weinig veroorzaakte vervormingen verder weg. Vergelijkbare cytoskelet stam toepassing op de microneedle inbrengen site (orange box) is waargenomen voor beide controle fibroblasten (mCherry alleen) en fibroblasten met een verstoorde nucleo-cytoskelet koppeling (DN KASH). Echter, veroorzaakte nucleaire en cytoskelet verplaatsingen (blauw, geel en rode vakjes) in andere regio's waren beduidend kleiner in de fibroblasten met verstoorde nucleo-cytoskelet koppeling (DN KASH) dan in controle cellen (mCherry alleen) (figuur 4). Zo, afname van het cytoskelet en nucleaire verplaatsingen uit de buurt van de stam toedieningsplaats, geeft aan dat de krachtoverbrenging tussen het cytoskelet en de kern was verstoord.

Belangrijk is, hebben we ook op aangedrongen dat mitochondria geschikt cytoskelet marker, door het uitvoeren van microneedle manipulatie op de muis embryonale fibroblasten getransfecteerd met GFP-of mCherry actine en GFP-vimentine en fluorescent gelabelde met Mitotracker groen of rood. Cytoskelet displacement maps werden onafhankelijk berekend op basis van het fluorescerende signaal van de mitochondria en het actine-of vimentine cytoskelet. De gemiddelde absolute verplaatsing was berekend voor vier verschillende regio's op het verhogen van het cytoskelet afstanden uit de buurt van de stam toepassing site. De helling en R-kwadraat waarden werden berekend op basis van de lineaire regressie tussen de metingen verkregen uit mitochondriën en van actine-of vimentine, respectievelijk. Voor actine, de helling was 0,99 en de R 2-waarde was 0.986, voor vimentine, de helling was 1,04 en de R2-waarde was 0.971, wat bevestigt dat mitochondriale verplaatsingen dienen als betrouwbare indicatoren voor het cytoskelet vervormingen.

Figuur 1
Figuur 1. Ondergrond spanning toepassing op muis embryonale fibroblasten (MEF). Muis embryonale fibroblasten verspreid over twee verschillende gebieden op de silicium membraan werden afgebeeld met fase contrast en fluorescentie microscopie voor, tijdens en na toepassing van 20% eenassige rek. (A) Voorbeeld van een geslaagd experiment met geldige kernen van cellen die de stam toepassing overleefd zonder schade of onthechting en (B) voorbeeld van cellen die intrekken / gedeeltelijk los tijdens stam aanvraag; resultaten van de cellen afgebeeld in (B) zijn uitgesloten uit de analyse. In (B), de cel aan de linkerkant vertoont tekenen van cytoskeletale schade en nucleaire collaps (pijl), terwijl de cel aan de rechterkant los gedeeltelijk en trekt tijdens de stam applicatie. Dit kan een indicatie van overbelasting aanvraag. Voor een betere vergelijking, in (A) en (B) de rand van een van de niet-uitgerekte celmembranen is geschetst in rood en gesuperponeerd op dezelfde cel tijdens en na de stam applicatie. In (A) de grens van de niet-uitgerekte kern is geschetst in het groen en gesuperponeerd op dezelfde kern tijdens en na de stam applicatie.

Figuur 2
Figuur 2. Analyse van de genormaliseerde nucleaire stam in een panel van verschillende MEF cellijnen MEF van de Lmna -. / - En Lmna + / - genetische achtergrond ectopisch dat zich een lege vector-of wild-type lamin A werden geanalyseerd. In vergelijking met MEFs van wild-type nestgenoten (Lmna + / +), verlies van lamin A / C uitdrukking resulteert in een verminderde nucleaire stijfheid die volledig kunnen worden hersteld door de herintroductie van wild-type Lamin A. Met name verminderde nucleaire stijfheid wordt weerspiegeld door verhoogde waarden van genormaliseerde nucleaire stam. De fout balken geven standaard fouten.

Figuur 3
Figuur 3. Micronaaldjes manipulatie test om intracellulaire krachtoverbrenging te meten. Fase contrast (A, B) en fluorescentie (C, D) beelden van een fibroblast gelabeld met nucleaire kleuring (blauw) en MitoTracker mitochondriale vlek (groen). Een microneedle werd ingevoegd in het cytoskelet op een bepaalde afstand van de kern (A en C) en vervolgens verplaatst naar de cel periferie (B, D). Cytoskelet en nucleaire verplaatsingen werden gekwantificeerd door het bijhouden van fluorescent gelabelde kern en mitochondriën met behulp van een op maat geschreven cross-correlatie algoritme. (E) Verplaatsing kaart van de laatste cytoskelet (groen) vervormingen berekend op basis van fluorescentie-image serie; pijl lengte wordt vergroot door 2x voor een betere zichtbaarheidteit. Schaal van bars, 10 urn.

Figuur 4
Figuur 4. Analyse van de intracellulaire krachtoverbrenging tijdens micronaaldjes manipulatie. Induced cytoskeletale en nucleaire verplaatsingen tijdens microneedle manipulatie, gemeten in de gebieden die overeenstemmen met de gekleurde vakjes (inzet in A). The Orange Box is de stam applicatie site. Ondanks soortgelijke stam toepassing in het cytoskelet (oranje doos), veroorzaakte nucleaire en cytoskelet verplaatsingen (blauw, geel en rode vakjes) waren significant kleiner in de muis embryonale fibroblasten dat met een verstoorde nucleo-cytoskelet koppeling (DN KASH) in vergelijking met de controlegroep ( mCherry alleen) cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Substraat stam assay

Stam aanvraag is met succes gebruikt door ons en andere groepen om geïnduceerde nucleaire vervormingen in de cellen blootgesteld aan mechanische belasting te bestuderen en om de bijdrage van specifieke nucleaire envelop-eiwitten te onderzoeken nucleaire stijfheid. 4-8 Het voordeel van deze techniek is dat het sondes mechanische eigenschappen van het leven kernen in hun normale cellulaire en cytoskeletale milieu en dat de ondergrond stam applicatie lijkt op de fysiologische belasting die wordt toegepast zoals die in vele weefsels, zoals spieren of aanbestedende bloedvatwanden. negen Bovendien stam toepassing maakt het mogelijk om te veel cellen in parallel, waardoor het aantal van cellen die kunnen worden geanalyseerd in een enkel experiment. Een beperking van de ondergrond stam test is dat het geen rechtstreekse metingen van de nucleaire stijfheid. In plaats daarvan, deze methode is bepalend voor de relatieve stijfheid van de kern ten opzichte van de omringende cytoskelet. Gedetailleerde analyse van geïnduceerde nucleaire en cytoskelet spanning in de cellen blootgesteld aan eenassige substraat spanning laten zien dat in wild-type cellen, het cytoskelet stam is vergelijkbaar met de toegepaste substraat stam, terwijl de stijvere kern vervormt aanzienlijk minder. 4 Toch, extra testen, zoals de microneedle manipulatie test, kan het nodig zijn om te verzekeren dat waargenomen verschillen in nucleaire vervorming tussen de verschillende cellijnen niet zijn het resultaat van veranderde nucleo-cytoskelet koppeling of cytoskelet structuur. Ondanks deze beperkingen, het meten van de nucleaire mechanica in intacte cellen in plaats van in afgelegen kernen minimaliseert het risico van artefacten veroorzaakt door osmotische effecten, schade tijdens de isolatie procedure, of andere wijzigingen in verband met de nucleaire isolement. Echter, een strikte eis voor het substraat stam test is dat cellen stevig hechten aan de ondergrond. Ter verbetering van cellulaire adhesie, kunnen gerechten worden gecoat met verschillende extracellulaire matrix eiwitten zoals fibronectine, collageen of laminine tegen variabele concentraties, wij raden het bepalen van de optimale coating voorwaarden voor elke nieuwe cel type dat bij de experimenten.

Verder is het voor optimale resultaten, moet de toegepaste substraat stam groot genoeg zijn om de nucleaire vervormingen te detecteren terwijl het minimaliseren van schade aan de cellen. Voor muis en menselijke fibroblasten, we meestal van toepassing 5% biaxiale rek of 20% eenassige rek zonder openlijke celbeschadiging. In het algemeen vinden we dat cellen tolereren eenassige rek toepassing beter dan biaxiale spanning toepassing, zoals kleinere veranderingen in membraanoppervlak nodig zijn. Wat betreft de extracellulaire matrix coating, moet de optimale omstandigheden van de stam aanvraag worden bepaald voor elke nieuwe cellijn te testen.

Daarnaast vonden we dat de experimenten gevoelig zijn voor de cel dichtheid. Experimenten moeten idealiter worden uitgevoerd op sub-samenvloeiende cellen tot cel-cel interacties te minimaliseren, maar celdichtheden die te laag zijn vaak leiden tot een slechte overleving van cellen in reactie op stam en in een lage opbrengst van cellen per experimenten. Aan de andere kant, een celdichtheid dat is te hoog maakt het moeilijk om dezelfde cellen te identificeren voor, tijdens en na de stam applicatie. We raden aan om een ​​optimale celdichtheid-test voor individuele celtypes.

Een ander belangrijk advies voor de experimenten is dat de stam toepassing moet worden beperkt tot 10 minuten of minder om cellulaire aanpassing, zoals de verbouwing van het cytoskelet-elementen te voorkomen. Te dien einde, het gebruik van geautomatiseerde imaging software, bijvoorbeeld IPlab, in combinatie met een gemotoriseerde podium voor automatische re-lokalisatie van de cellen van de stam schotel en snellere beeldverwerking acquisitie. Verder hebben we gebruik van op maat geschreven beeldanalyse software (bijv. MATLAB) voor data-analyse. De software vereist een aantal marker punten op het membraan naar het berekenen van de toegepaste substraat stam, zoals de toegepaste stip, kleine tl-kralen of duidelijke onregelmatigheden op de silicium membraan. Tot slot, is validatie van elke kern nodig is om die van beschadigde of intrekken van cellen uit te sluiten, zoals de nucleaire vervormingen gemeten in deze cellen zijn niet representatief. Een mogelijke aanpassing van de ondergrond stam techniek is om substraat stam van toepassing op cellen gekweekt in drie-dimensionale collageen gels, die de analyse van nucleaire mechanische eigenschappen onder meer fysiologische omstandigheden, alsmede de methode toe te passen om meer te zwak hechtende cellen mogelijk maakt. Een andere variatie is om micropatterned ondergronden, bijv., ronde of rechthoekige vlekken van fibronectine op de silicium membraan, te gebruiken om consistente cel spreiding en afstemming te bereiken tijdens de stam applicatie. Ten slotte is het beter om de nucleaire monteurs op een meer fysiologisch niveau te begrijpen, kan cellulaire spanning worden toegepast op gehele weefsel in plaats van geïsoleerde cellen. We zijn momenteel met succes gebruik van deze techniek om de nucleaire stijfheid in model orga metenmechanismen zoals Drosophila melanogaster of Caenorhabditis elegans.

Microneedle manipulatie assay

De microneedle manipulatie test is een enkele cel-gebaseerde methode om intracellulaire krachtoverbrenging sonde door het kwantificeren van geïnduceerde nucleaire en cytoskelet verplaatsingen na de gelokaliseerde cytoskelet stam toepassing, waarbij het ​​bevorderen van een eerdere benadering ontwikkeld door Maniotis en collega's. 10 Deze techniek biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere gelokaliseerde force toepassing methoden zoals magnetische pincet of optische vallen. Zo kan spanning direct worden toegepast op de cytoskelet en kan worden gewijzigd variëren van de afstand van de microneedle. De microneedle kan ook worden geplaatst in de cel met hoge nauwkeurigheid, waardoor het experiment zeer reproduceerbaar, en de kracht applicatie tarief, dat direct gerelateerd is aan de microneedle snelheid, nauwkeurig kan worden gecontroleerd door de geprogrammeerde micromanipulator. In tegenstelling, zijn de magnetische korrels worden gebruikt in magnetische en optische pincet vallen vaak willekeurig gelokaliseerd op de apicale celoppervlak, en zowel optische en magnetische pincet te genereren onvoldoende krachten te resulteren in grootschalige cytoskelet vervormingen in veel soorten cellen. Hoewel de microneedle manipulatie test is een invasieve techniek en er is beperkte controle over welke cytoskelet structuren van de microneedle zich aan, kunnen we de resultaten te bevestigen met minder invasieve benaderingen (bv. substraat-stam). Zo microneedle manipulatie en substraat stam zijn twee complementaire testen die informatie over nucleaire mechanica opbrengst in intacte levende cellen met behoud van een normale nucleaire en cytoskeletale architectuur en het behoud van de juiste chemische samenstelling van het nucleoplasm en cytoplasma.

In de volgende, raden we eventuele wijzigingen of verbeteringen. Als cellen zijn te goed gespreid, kan de microneedle tip te breken tegen de glazen bodem schaal wanneer het proberen om deze positie in de dunne (~ 1-2 um) cytoskelet. Om te voorkomen dat deze problemen, raden wij aan het testen van een reeks van concentraties van extracellulaire matrix (ECM) moleculen, zoals fibronectine, collageen, of laminine, de voorwaarden dat er voldoende celadhesie te bereiken vast te stellen zonder dat de cellen om te dun te verspreiden. Een andere wijziging zou kunnen zijn om het bord van de cellen op ECM-gecoate micropatterned vlakken een uniforme cel verspreiden en oriëntatie te verzekeren. Een aanvullende of complementaire aanpak kan worden tot op het bord cellen op ECM-gecoate polyacrylamide gels en steek de microneedle via het cytoskelet in de gel voor een uniforme toepassing stam te maken tussen het cytoskelet. Het gebruik van een intact en fijne punt microneedle is absoluut essentieel voor het succes van de experimenten. We trekken regelmatig onze eigen micronaalden, en men kan experimenteren met verschillende vormen en maten. Als alternatief kan men ook de aankoop per stuk verpakt micronaaldjes met consistente geometrie (bijv. Eppendorf Femtotips). In ieder geval is het belangrijk om te verzekeren dat de microneedle blijft onbeschadigd tijdens de experimenten, als een gebroken microneedle tip, bijvoorbeeld na het maken van contact met het glazen substraat, zal beschadigen cellen. Tijdens de microneedle manipulatie procedure zelf, is het belangrijk om toe te passen constante snelheid en het bereik van de microneedle beweging, zoals de kern en cytoskelet zijn visco-elastische materialen met tijdsafhankelijk gedrag. Wij raden het gebruik van een computergestuurde micromanipulator, die ook zal helpen bij de coördinatie van de microneedle beweging en beeld acquisitie. Vanuit onze ervaring kunnen Mitotracker door cytotoxische, dus beperken de experimenten tot 30 minuten of gebruik andere fluorescente merkers, zoals GFP-actine of GFP-vimentine. Een wijziging van de hier beschreven benadering, vooral als het bestuderen van nucleo-cytoskelet koppeling, is om de micronaaldjes te voegen in de kern in plaats van het cytoskelet en het te verplaatsen naar de cel periferie.

Voor alle studies, als gevolg van de typisch grote cel-cel variabiliteit, moeten experimenten worden uitgevoerd ten minste drie onafhankelijke keer metingen te verrichten vanaf een minimum van 15-25 in totaal geldig cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 HL082792 en R01 NS059348) en het Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Leadership Group Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin EMD Millipore FC010
MitoTracker Red FM and Green FM Invitrogen M22425 and M-7514
H–chst 33342 Invitrogen H3570
Hank’s Buffered Salt Saline Invitrogen 14185
Phenol free, DMEM Invitrogen 21063
Fetal bovine serum Aleken Biologicals FBSS500
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100ML
Borosilicate Glass with filament Sutter Instrument Co. BF100-78-10
Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005" Specialty Manufacturing Inc.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200
35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Braycote 804 Vacuum Grease SPI Supplies 05133A-AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
  2. Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
  3. Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
  4. Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
  5. Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
  6. Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
  7. Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  8. Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
  9. Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
  10. Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics