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और, TaqMan करके Genogrouping बच्चों के मल से noroviruses डिटेक्शन एक कदम RT-पीसीआर

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Summary

एक कदम और बच्चों के दस्त, कि प्राइमरों और TaqMan खुला पढ़ने फ्रेम 1 है (ORF1) ORF2 जंक्शन क्षेत्र, Norovirus जीनोम का सबसे संरक्षित क्षेत्र है करने के लिए विशिष्ट जांच इस्तेमाल से में Norovirus आइसोलेट्स की genogroup पहचान का पता लगाने के लिए परख RT-पीसीआर वर्णित. एक गैर वाणिज्यिक, लागत प्रभावी शाही सेना निष्कर्षण विधि की विस्तृत.

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Apaza, S., Espetia, S., Gilman, R. H., Montenegro, S., Pineda, S., Herhold, F., Pomari, R., Kosek, M., Vu, N., Saito, M. Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR. J. Vis. Exp. (65), e3232, doi:10.3791/3232 (2012).

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Abstract

Protocol

1. मल के नमूने

  1. मल के नमूने शाही सेना में बनाए रखने के जमे हुए संग्रहित किया जाना चाहिए. 10% मल निलंबन करने के लिए, विकल्प मल नमूना की लगभग 0.1 जी लेने के लिए और पीबीएस साथ 1 मिलीग्राम पूरा.
  2. 200 μl में अशेष भाजक ठंड से बचने के लिए और दोहराया विगलन. -70 डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर
  3. पिघलना और निष्कर्षण में उपयोग करने से पहले 10 मिनट के लिए 4,000 g aliquots अपकेंद्रित्र.

2. Guanidine और सिलिका के साथ निष्कर्षण के लिए सिलिका के कण तैयार

  1. आरटी पर, सिलिकॉन डाइऑक्साइड की 30 ग्राम निलंबित और 250 एमएल के लिए DH 2 हे के साथ पूरा.
  2. अवसादन के 24 घंटे के बाद, चूषण द्वारा 215 एमएल की सतह पर तैरनेवाला हटा दें. 250 एमएल के लिए DH 2 हे, और सिलिका गोली झटकों से निलंबित.
  3. एक और 24 बजे के बाद, चूषण द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और पीएच 2.0 के लिए सिलिका निलंबन का पीएच को समायोजित करने के लिए, हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग. गिलास बीओटी में सिलिका निलंबन अशेष भाजकtles और आटोक्लेव.

3. Guanidine और सिलिका के साथ निष्कर्षण के लिए L6 के बफर तैयार

  1. आरटी पर guanidinium thiocyanate की 60 ग्राम (GuSCN) और ट्राइटन की 1.3 जी एक्स-100 0.1 एम Tris हाइड्रोक्लोराइड, पीएच 6.4, और 0.2 एम EDTA, पीएच 8.0 समाधान की 11 एमएल की 50 एमएल में घुला देनेवाला द्वारा L6 के बफर तैयार.

4. Guanidine और सिलिका के साथ निष्कर्षण के लिए L2 के बफर तैयार

  1. आरटी में 0.1 एम Tris हाइड्रोक्लोराइड, पीएच 6.4 की 150 एमएल में guanidinium thiocyanate की 180 ग्राम (GuSCN) भंग कर L2 बफर तैयार.

5. निष्कर्षण प्रक्रिया

  1. प्रत्येक निष्कर्षण में एक नवम्बर सकारात्मक मल नमूना, सकारात्मक नियंत्रण है, और DEPC इलाज पानी के रूप में, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए.
  2. एक अपकेंद्रित्र सूक्ष्म ट्यूब में निम्न मिश्रण, L6 के बफर, सिलिका के कण के 20 μL 1 एमएल और 10% मल निकालने निलंबन के 200 μL जोड़ें. भंवर संक्षिप्त और 15 मील के लिए आरटी पर छोड़ देंएन.
  3. 6000 जी में 10 एस के लिए निलंबन और अपकेंद्रित्र, 1ml साथ बफर L2 गोली दो बार धोना, 70% इथेनॉल के साथ दो washes और एसीटोन के साथ एक समय के बाद. 56 में एक सूखी हीटिंग ब्लॉक डिग्री सेल्सियस में 5 मिनट के लिए सूखी गोली.
  4. सिलिका गोली में RNase मुक्त 2 DH 0 50 μL जोड़कर हाइड्रेट शाही सेना. 15 मिनट के लिए 1 RNasin की μL, inverting के ट्यूब और सेते हैं द्वारा 56 पर मिश्रण डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
  5. पूरी रफ्तार से 3 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में, अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला युक्त शाही सेना की 40 μL इकट्ठा.
  6. यों निकाले शाही सेना Nanodrop 2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग कर नमूने. फिर -70 की दुकान ° सी का उपयोग करें जब तक, 6 महीने के लिए. (नोट: कुल शाही सेना को अक्षुण्ण बनाए रखने के लिए एक बेहतर तरीका यह सीडीएनए में परिवर्तित होता है).

6. वैकल्पिक वाणिज्यिक शाही सेना QIAamp वायरल शाही सेना किट का उपयोग निष्कर्षण

पूर्ण निर्देश पुस्तिका prov में पाए जाते हैंQIAGEN किट के साथ ided. संक्षिप्त प्रक्रिया निम्नानुसार है:

  1. Pipet बफर AVL के 560 μL एक 1.5 एमएल ट्यूब में वाहक शाही सेना से युक्त, और 10% मल निलंबन की 140 μL जोड़ें. 15 सेकंड के लिए पल्स vortexing द्वारा मिक्स. आर टी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. नमूना और पल्स vortexing द्वारा मिश्रण करने के लिए 15 सेकंड के लिए इथेनॉल के 560 μL (96-100%) जोड़ें, तो संक्षेप में अपकेंद्रित्र.
  3. एक स्पिन एक 2 एमएल संग्रह के ट्यूब में रखा स्तंभ के लिए इस समाधान की μL 630 लागू करें. 6000 जी में 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, तो एक साफ 2 एमएल ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह.
  4. बफर AW1 और अपकेंद्रित्र के 500 μL के साथ 1 मिनट के लिए 6,000 जी पर बाध्य शाही सेना से युक्त स्तंभ धो लें. एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब स्वच्छ में जगह स्तंभ.
  5. AW2 बफर 500 μL और 3 मिनट के लिए पूर्ण गति (20,000 या 14,000 rpm के छ) में अपकेंद्रित्र के साथ स्तंभ धो लें.
  6. जगह एक साफ 1.5 एमएल सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्पिन स्तंभ, 40 μL पानी के DEPC का इलाज जोड़ने और पूरी गति से शाही सेना elute. पर दोहराएँeluted शाही सेना के एक अंतिम 80 μL के लिए है CE.
  7. यों निकाले शाही सेना Nanodrop 2000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग कर नमूने. फिर -70 की दुकान ° सी का उपयोग करें जब तक, 6 महीने के लिए. (नोट: कुल शाही सेना को अक्षुण्ण बनाए रखने के लिए एक बेहतर तरीका यह सीडीएनए में परिवर्तित होता है).

7. निकाले शाही सेना में Norovirus की एक कदम वास्तविक समय RT-पीसीआर विशिष्ट TaqMan जांच के साथ जांच

साधन StepOnePlus वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड Biosystems).

कार्यप्रणाली

  1. पोछो और RNase साथ सब काम सतहों, pipettes, और centrifuges दूर साफ करने के लिए किसी भी संभावित RNase संदूषण को निकालने के.
  2. और pipet नवम्बर सैनिक और जी आई आई स्क्रीनिंग मास्टर तालिका 1 के अनुसार घोला जा सकता है. प्राइमरों और TaqMan जांच के तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं.
  3. अशेष भाजक उचित मास्टर मिश्रण की 10 प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के μL.
  4. 5 undiluted अज्ञात नमूना की μL जोड़ेंआरएनए, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी DEPC इलाज, या सैनिक क्रमशः जी आई आई सकारात्मक नियंत्रण शाही सेना इसी प्रतिक्रिया कुओं,. सभी नमूनों को दो प्रतियों में चलाया जाना चाहिए. 300 / μg μL और 500 / μg μL क्रमशः की एकाग्रता के साथ सकारात्मक और नियंत्रण मानकों के रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए राष्ट्रीय Calicivirus प्रयोगशाला केंद्र (सीडीसी) द्वारा प्रदान किया गया.
  5. 6000 जी में 10 सेकंड के लिए प्रतिक्रिया प्लेट अपकेंद्रित्र.
  6. प्रयोग गुण स्क्रीन में, परिभाषित करने और चलाने के लिए प्रयोग की एक प्रकार का चयन करें. सुनिश्चित करें TaqMan अभिकर्मकों अभिकर्मकों, और प्रकार कि पूर्व पीसीआर पढ़ा और प्रवर्धन कर रहे हैं चयनित के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं.
  7. 15 μL तालिका 3 में थर्मल प्रोफ़ाइल का उपयोग प्रतिक्रियाओं चलाएँ.
  8. परिणामों का विश्लेषण करें.

8. नवम्बर सैनिक और जी आई आई जीनोटाइपिंग पारंपरिक RT-पीसीआर और अनुक्रमण का उपयोग

(यह इस वीडियो में उल्लेख नहीं किया क्योंकि यह एक आम और व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता विधि रहा है.)

साधन. Biosystems StepOne और StepOnePlus Quantitec टेम्पलेट के साथ वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम लागू होता है.

कार्यप्रणाली

  1. जीनोटाइपिंग से पहले नमूनों की genogroup (सैनिक या जी आई आई) से स्क्रीनिंग RT-पीसीआर ऊपर वर्णित द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. सैनिक नवम्बर शाही सेना के लिए सैनिक जीनोटाइपिंग मास्टर और जी आई आई जीनोटाइपिंग मास्टर मिश्रण के साथ मिश्रण जी आई आई नवम्बर शाही सेना के साथ परिलक्षित हो गया है.
  2. और pipet नवम्बर सैनिक और जी आई आई जीनोटाइपिंग मास्टर तालिका 4 के अनुसार घोला जा सकता है. प्राइमरों - सैनिक SKF / SKR और G2 SKF / SKR 5 तालिका में सूचीबद्ध हैं.
  3. अशेष भाजक 0.2 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए उपयुक्त मास्टर मिश्रण के 45 μL.
  4. 5 DEPC इलाज पानी की प्रत्येक नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब μL, और पूर्व जांच, नवम्बर (सैनिक और / या जी आई आई) इसी प्रतिक्रिया ट्यूब सकारात्मक शाही सेना के 5 μL जोड़ें.
  5. 50 μL प्रतिक्रियाओं तालिका में 6 थर्मल प्रोफ़ाइल का उपयोग कर चलाएँ.
  6. पीसीआर उत्पादों contai भेजेंNing के कम से कम 100 एनजी / प्रवर्धित capsid क्षेत्र की μL शुद्धि और अनुक्रमण के लिए कंपनी Macrogen. (9700 ग्रेट Seneca हाईवे रॉकविल, 20,850 एमडी और अनुक्रमण प्रति नमूना प्रति $ 10).

9. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 से एक कदम RT-पीसीआर जब परख अतिसारीय बच्चों से मल के नमूने से निकाले शाही सेना के लिए इस्तेमाल किया TaqMan प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. एक सकारात्मक नमूने के लिए सीमा चक्र (सीटी) या सैनिक और जी आई आई सीटी के लिए 39 के लिए 37 सीटी के बराबर कम पर स्थापित किया गया था. सकारात्मक नियंत्रण के लिए सीटी मूल्यों को कम से कम 27 और 18 सैनिक और GII, क्रमशः के लिए जंक्शन ORF1 ORF2 का होना पाया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2

मास्टर मिक्स अंतिम सान्द्र मात्रा (μL)
एच 2 0 पीसीआर 2.875
Quantitect RT-पीसीआर मास्टर मिक्स 1x 6.250
आरटी मिक्स 1x 0.125
50 माइक्रोन दांता आर प्राइमर एक माइक्रोन 0.250
50 माइक्रोन दांत एफ प्राइमर 1माइक्रोन 0.250
10 माइक्रोन की अंगूठी जांच एक माइक्रोन 0.125/0.250 *
10.00

प्रत्येक जांच के 0.250 μL सैनिक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि प्रत्येक जांच के 0.125 μL जी आई आई परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया था.

टेबल 1 क्विएज़न के लिए स्क्रीनिंग सैनिक और जी आई आई Quantitect मास्टर मिश्रण (ट्रूजिलो एट अल, 2006) 7.

नाम Geno - समूह उपयोग अनुक्रम (5 '3')
दांत 1R सैनिक भजन की पुस्तक सीटीटी आगा CGC कैट कैट कैट TYA सी
दांत 1F सैनिक भजन की पुस्तक CGY TGG ATG CGN TTY कैट GA
दांत 2R GII भजन की पुस्तक TCG ACG सीसीए TCT TCA टीटीसी एसीए
दांत 2F GII भजन की पुस्तक कार GAR बीसीएन ATG TTY एजीआर TGG ATG एजी
अंगूठी 1A सैनिक जांच परिवार आगा TYG CGA Tcy CCT सीए - BHQ 1 गोरखा प्रशिक्षण केन्द्र
अंगूठी 1B सैनिक जांच परिवार आगा TCG CGG का TCT CCT सीए - BHQ-1 गोरखा प्रशिक्षण केन्द्र
Ring2 - टी.पी. GII जांच परिवार - TGG भूमिकाः GGC जी ए टी CGC सीटी - BHQ 1 AAT

टेबल 2 प्राइमर. और जांच genogroups मैं, (द्वितीय Kageyama एट अल. के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक RT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया oligonucleotides है,2003) 8.

कदम तापमान (° C) समय (मिनट)
1 50 30:00 सीडीएनए संश्लेषण
2 95 15:00 HotStart Taq पोलीमरेज़ सक्रियण
3 95 00:15
60 01:00 45X चक्र

तालिका3. एक कदम के लिए थर्मल प्रोफ़ाइल TaqMan वास्तविक समय RT-पीसीआर (ट्रूजिलो एट अल, 2006) 7.

मास्टर मिक्स अंतिम सान्द्र मात्रा (μL)
एच 2 0 पीसीआर 29.50
5X क्विएज़न बफर RT-पीसीआर 1x 10.00
10 मिमी dNTP मिक्स 0.4 मिमी 2.00
एनजाइम मिक्स 2.00
40 RNAsin यू / μL 20 यू / μL 0.50
10 माइक्रोन SKF 0.1 माइक्रोन 0.50
10 माइक्रोन SKR 0.1 माइक्रोन 0.50
45.00

4 टेबल क्विएज़न एक कदम RT-पीसीआर - जीनोटाइपिंग सैनिक और जी आई आई के लिए मास्टर मिश्रण.

नाम Geno - समूह उपयोग अनुक्रम (5 '3')
G1SKF सैनिक भजन की पुस्तक 5'-CTG सीसीसी GAA TTY GTA AAT GA - 3
G1SKR सैनिक भजन की पुस्तक एसीसी 5'-सीसीए कार सीसीए TTR टीएसी ए '3
G2SKF GII भजन की पुस्तक 5'-CNT के GGG AGG GCG एटीसी GCA एक - 3
G2SKR GII भजन की पुस्तक 5'-सीसीआर CCN GCA TRH सीसीआर TTR कैट 3 टीए

सारणी 5. प्राइमर्स capsid क्षेत्र के क्षेत्र सी (Kojima एट अल, 2002) के प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया 5.

कदम तापमान (° C) समय (मिनट)
1 60 30:00 सीडीएनए संश्लेषण
2 96 15:00 HotStart Taq पोलीमरेज़ सक्रियण
3 94 0:030
52 01:00 40X चक्र
72 00:30
4 72 10:00 एनीलिंग

6 टेबल एक कदम RT-पीसीआर TaqMan के लिए थर्मल प्रोफ़ाइल.

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Discussion

का प्रयोग विधि - घर में मल के नमूने से न्यूक्लिक एसिड अलग करने के लिए आर्थिक, हम वाणिज्यिक QIAmp क्विएज़न से वायरल शाही सेना किट के साथ के रूप में समान परिणाम प्राप्त करने के लिए, और एक साथ TaqMan RT-पीसीआर हमारी प्रयोगशाला में विकसित के साथ हम नवम्बर की एक व्यापक रेंज का पता लगा सकते हैं सैनिक और जी आई आई genogroup संबंधित जीनोटाइप. क्षेत्र सी प्रोटोकॉल के हाल के एक प्रकाशन 78 6% की जीनोटाइपिंग दर की सूचना दी. समकालीन नवम्बर उपभेदों की विविधता के बाद से पिछले वर्षों के दौरान बढ़ रहा है, सफलता की दर क्षेत्र सी के लिए परीक्षण किया जा रहा है नमूनों में प्राइमरों बेमेल पर निर्भर करेगा. परख नैदानिक ​​दिनचर्या के लिए उपयोगी है के रूप में इसे बाद प्रवर्धन उत्पाद प्रसंस्करण समाप्त, इस प्रकार 7 समय के आसपास बारी छोटा है. इसके अलावा निदान से, इस प्रोटोकॉल नवम्बर संक्रमण की महामारी विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार इस रोग के सार्वजनिक स्वास्थ्य नियंत्रण के लिए उपयोगी किया जा रहा है.

जब स्क्रीनिंग चल RT -पीसीआर, भजन की पुस्तक / जांच सेट के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं (नेकां) प्रतिदीप्ति विकास से घटता है कि सीमा रेखा पार नहीं एक्ज़िबिट चाहिए. यदि एक झूठी सकारात्मक / प्राइमर जांच के सेट नेकां प्रतिक्रियाओं में से एक या एक से अधिक के साथ होता है, नमूना संदूषण हुई हो सकती है, और ऐसे सभी मामलों में, पूरे रन अवैध था और सख्त दिशा निर्देशों के पालन के साथ दोहराया.

क्रॉस के लिए प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग RT-पीसीआर सैनिक और जी आई आई सकारात्मक मानकों सीडीसी द्वारा प्रदान का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. नहीं पार प्रतिक्रिया सैनिक और प्राइमरों जी आई आई शाही सेना और इसके विपरीत के साथ जांच के बीच मनाया गया. RT-पीसीआर स्क्रीनिंग के reproducibility के सीटी-मान के रूप में उच्च था जहां सकारात्मक नियंत्रण से दोहराया शाही सेना के साथ रन के लिए इसी तरह की. शाही सेना से बच्चों के मल के नमूने है कि नवम्बर के लिए किया गया था सकारात्मक पाया और मूल्यों सीटी के बीच 20 और 33 जहां बाद में पारंपरिक RT-पीसीआर द्वारा प्रवर्धित और जीनोटाइपिंग लिए भेजा था. सीटी 35 और 38 के बीच मूल्यों के साथ पांच सकारात्मक नमूने sequen के लिए नहीं भेजा गयाजहां बाद पारंपरिक आरटी - पीसीआर प्रवर्धन के लिए बहुत कम हो पाया वायरल लोड के रूप में cing.

वर्तमान में, norovirus के निदान की उपलब्धता सीमित है क्योंकि तरीकों के लिए स्थानीय प्रयोगशालाओं में केवल बुनियादी उपकरणों के साथ लागू किया जा करने में सक्षम नहीं हैं. इस देरी और व्यक्ति दस्त के मामलों में या फैलने में निदान, उपचार. किट विधि विश्वसनीय और तेजी से है अभी तक समय और संसाधनों का एक महत्वपूर्ण राशि के देशों में माल परिवहन की आवश्यकता है. लागत तीन गुना है कि हमारे विधि की है. हम एक सहायक है कि समान रूप से सरल, तेज, और विश्वसनीय है नवम्बर का पता लगाने के लिए आसानी से उपलब्ध में देश अभिकर्मकों का उपयोग विधि से पता चला है. यह लागत प्रभावी विधि नजरअंदाज सामग्री पर निर्भरता विदेश में खरीदा है, इसके परिवहन पर अंतरराष्ट्रीय और अंतर राष्ट्रीय नीतियों जो अंततः एक सुलभ निदान और चर्चा में आंत्रशोथ का सबसे आम वायरल कारणों की एक तेजी से उपचार के लिए नेतृत्व करेंगे की समस्याओंildren.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

लेखकों के लिए नवम्बर के लिए एक मानक और नियंत्रण सकारात्मक की तरह उपहार के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए राष्ट्रीय Calicivirus प्रयोगशाला केंद्र (सीडीसी) का शुक्रिया अदा करना होता है, और जॉन्स हॉपकिन्स पर अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य के स्कूल की प्रयोगशालाओं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate Sigma-Adrich G9277
Tris HCL Sigma-Aldrich T5941
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Silica Sigma-Aldrich S5631
Triton X 100 VWR 14530
Diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) Qiagen 52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) Qiagen 204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) Qiagen 210212
Rnase Inhibitor 2000 units A. Biosystems N808-0119 2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes Ambion AM12450
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550-100

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References

  1. Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
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  3. Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
  4. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
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  8. Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).

Comments

1 Comment

  1. thanks a lot

    Reply
    Posted by: mohamed h.
    May 4, 2015 - 5:20 PM

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