Name: Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer de isolatie van volwassen muizen-cardiomyocyten en enkelvoudige-cel genexpressieanalyse met qPCR en microarray. Deze methode onthult cellulaire variabiliteit in cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de technische bijstand van de C. Zambataro te erkennen tijdens de opnames van dit protocol. Wij dankbaar erkennen de steun van de Glenn Stichting voor Medisch Onderzoek (SM), De Hillblom stichting, en de National Institutes of Health voor een Nathan Shock Center award (P30AG025708) en PO1AG025901. JMF werd ondersteund door T32AG000266 toegekend aan het Buck Instituut voor Onderzoek on Aging.

<ol><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li>
<li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li>
<li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li>
<li>Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).</li>
<li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Radiopaedia%22%5BJournal%5D)">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li>
<li>Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling%3A+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li>
<li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li>
<li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+nurture%2C+or+chance%3A+stochastic+gene+expression+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li>
<li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Gratis toegang en productie van dit van dit artikel is gesponsord Sigma-Aldrich.</p

Deze methode heeft de mogelijkheid om cardiomyocyten voor een aantal functionele en genexpressie studies te genereren. Het onderzoek van enkele cellen is een snel groeiende gebied in genexpressie analyse. Het voordeel van het onderzoek transcriptionele niveau op het niveau van de enkele cel is dat het onderzoek van een zuivere celpopulatie, wat niet mogelijk is van hele weefselpreparaten mogelijk maakt. Bovendien, single cell analyse maakt voor het onderzoek van stochastische variatie van mRNA niveaus in individuele cellen te celpopulaties die voorheen gedacht werd dat ze homogeen 8,9 definiëren. In aanvulling op het identificeren van genen die mogelijk in hun stochastische genexpressie 10,11,12, de methode maakt het ook mogelijk voor de identificatie van zeldzame celpopulaties gedefinieerd door hun genexpressie profielen. Hoewel deze methode biedt een aantal interessante mogelijke toepassingen in de analyse van genexpressie, zijn er some bedenkingen en overwegingen bij het gebruik van enkele cellen. De belangrijkste beperking aan single cell analyse, is de verzameling van voldoende cellen in het experiment om statistische significantie te bereiken met betrekking tot de metriek van belang, bijvoorbeeld variantie. In gevallen waarin het aantal cellen geïsoleerd uit het weefsel van belang is geen beperking, kan men nagaan honderden cellen per groep, met behulp van benaderingen, zoals next-generation sequencing, of nanofluidic arrays. Echter, in sommige gevallen, kan er moeilijk bij het verkrijgen van voldoende cellen uit het weefsel van belang. Dit kan voor een deel veroorzaakt worden door eigenzinnige tijdrovende procedures voor de verzameling van de beoogde celtype. Kunnen echter een zorgvuldige planning en voorbereiding voordat u verdergaat met enkele cel collectie nog steeds zorgen voor strenge single cell analyse met een beperkte technische fout. Bij het onderzoek van de resultaten moet worden aangenomen, dat, hoewel deze procedure voor het isoleren van cellen is gebruikt in tal van Studies (waaronder microscopie, elektrofysiologie, enz.), kan de isolatie zelf mogelijk effect genexpressie. Zoals bij elke methode waarin de biologische monsters manipuleert, moeten de resultaten van uw bevindingen zorgvuldig worden gevalideerd om ervoor te zorgen de enkele cel expressie representatief is voor het weefsel zelf en niet van technische aard bias. Methoden, zoals in situ hybridisatie kan nuttig zijn om deze resultaten te verifiëren in de intact weefsel. Ten slotte is het essentieel om ervoor te zorgen dat de geproduceerde gegevens zorgvuldig wordt gecontroleerd op kwaliteit te controleren. De gegevens in figuur 8 laat zien dat qPCR assays kunnen zeer robuust zijn in hun specificiteit, zoals de test # 13 (A13) of hebben een hoge mate van variabiliteit die kan leiden tot technische variantie zoals de test # 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Pyrodruivenzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasisch </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Supply * </td><td> Contact op met de leverancier voor het bestellen van </td><td> * Moet worden verkregen door middel van een dierenarts of een proefdier professionele </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primer Mix </td><td> IDT </td><td> Gewoonte </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease Gratis water </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR zuivering kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiacube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spectrofotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000C </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA-7500 kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 kit </td><td></td></tr><tr><td> Een kleur Labeling kit </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k reeks </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex compleet geheel Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptionele profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Terwijl talrijke studies hebben onderzocht genexpressie verandert van homogenaten van hartweefsel, dit voorkomt dat het bestuderen van de inherente stochastische variatie tussen cellen in een weefsel. Isolatie van pure cardiomyocyte de bevolking door middel van een collagenase perfusie van de muis harten vergemakkelijkt de generatie van de cel-microarrays voor hele transcriptoom genexpressie, of qPCR van specifieke doelen met behulp van nanofluidic arrays. We beschrijven hier een procedure om enkele cel genexpressie profielen van cardiomyocyten geïsoleerd uit het hart te onderzoeken. Dit paradigma kan voor de evaluatie van de statistieken van belang die niet afhankelijk zijn van het gemiddelde (bijvoorbeeld variantie tussen de cellen binnen een weefsel), wat niet mogelijk is wanneer met behulp van conventionele hele weefsel workflows voor de evaluatie van genexpressie (figuur 1). We hebben bereikt robuuste versterking van de interne cel transcriptoom waardoor microgram dubbelstrengs cDNA dat het gebruik van microarrays op i vergemakkelijktNDIVIDUELE cellen. In de procedure beschrijven we het gebruik van NimbleGen arrays die werden geselecteerd voor hun gebruiksgemak en de mogelijkheid om hun ontwerp aan te passen. U kunt ook een reverse-transcriptase - specifieke doelamplificatie (RT-STA) reactie, zorgt voor qPCR van honderden doelstellingen door nanofluidic PCR. Met behulp van een van deze benaderingen, is het mogelijk te onderzoeken of het variabiliteit van expressie tussen de cellen, evenals onderzoeken expressie profielen van zeldzame celtypen vanuit een tissue. Algemeen, de enkele cel genexpressie aanpak zorgt voor het genereren van gegevens die mogelijk kunnen identificeren eigenzinnige expressie profielen die typisch zijn gemiddeld bij het onderzoek van de expressie van miljoenen cellen van de typische homogenaten gegenereerd op basis van hele weefsels.

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Hoewel talrijke studies veranderingen in genexpressie in homogenaten van hartweefsel hebben onderzocht, verhindert dit het bestuderen van de inherente stochastische variatie ...

De doelstellingen van deze presentatie zijn om eerst de isolatie van levensvatbare volwassen muiscardiomyocyten te illustreren en vervolgens twee methoden voor genexpressieanalyse van individuele cellen te demonstreren. Na het dissecteren van het hart van een muis, wordt het hart geperfuseerd met een collagenase-digestie-oplossing om individuele cellen te verkrijgen. Voor kwantitatieve PCR van individuele cellen worden de gezuiverde cellen direct onderworpen aan QPCR-assays.De geïsoleerde cardiomyocyten kunnen ook worden gebruikt voor microarray-analyse. Microarray-analyse van enkelcellen omvat mRNA-extractie, amplificatie van het volledige transcriptoom via een plex-library, gevolgd door beperkte amplificatie, en tenslotte labeling en hybridisatie op een microarray-chip. De laatste stap van beide procedures is het waarborgen van gegevens van hoge kwaliteit.Deze procedures tonen aan dat een robuuste genexpressieanalyse mogelijk is vanuit individueel geïsoleerde volwassen cardiomyocyten. Het voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals genexpressieprofilering van een homogenaat van het gehele weefsel, is dat genexpressie op enkelcelniveau informatie verschaft over de expressie binnen een enkele cel, alsofحول de variabiliteit in expressie tussen cellen. Begin met een voorbereid isolatiesysteem, inclusief de benodigde oplossingen en buffers; sedeer een muis terminaal met een IP-injectie van 0,25 milliliters natriumpentobarbitaloplossing en zorg ervoor dat de muis bewusteloos is en niet reageert op pijnprikkels.Gebruik geen kooldioxide of cervicale dislocatie om de muis te euthanaseren voordat de ademhaling volledig is gestopt. Snijd voorzichtig open. Open de borstholte langs de thoraxrand tot aan het diafragma.Snijd vervolgens superieur naar boven en reflecteer de voorste borstkas. Zuig het hart voorzichtig in een vooraf gesneden plastic pipet en exciseer het hart uit de thorax. Plaats het hart in ijskoud digestiemedium.Buffer A en spoel het bloed na 15 tot 45 seconden weg, voer een tweede korte spoeling uit in buffer A en breng het hart vervolgens over naar de Petrischaal met buffer A en plaats het onder een dissectiemicroscoop. Isoleer voorzichtig de aorta en de vertakkingen ervan. Trim de aorta tot net onder de laatste vertakking.Plaats de canulepunt in de aorta boven de coronaire arteriën en ligatureer deze op zijn plaats met 4-0 of 6-0 hechtmateriaal. Begin de perfusie met digestiebuffer A. De uitstroom zal veranderen van rood naar helder naarmate het bloed uit het hart wordt gespoeld. De tijd tussen het offeren van het dier en het aansluiten van het hart op het perfusieapparaat is kritisch.Idealiter wilt u dit beperken tot vijf tot 10 minuten. Daarnaast moet de temperatuur van de vloeistof die door de perfusie-opstelling stroomt, op 37 °C worden gehouden. Als de vloeistof te warm of te koud is, zal dit het weefsel beschadigen.Zodra het bloed uit het hart is gespoeld, schakelt u over op de digestie. Perfundeer het hart gedurende twee tot drie minuten met Buffer b totdat het hart zijn vorm begint te verliezen en er afgerond uit gaat zien. Het myocard zou lichter van kleur moeten worden naarmate de perfusie vordert; snijd vervolgens de ventrikels af en snipper deze in kleinere stukjes.Plaats het ventrikelweefsel in een conische buis van 50 milliliter met 15 milliliter warme opvangbuffer. Meng het weefsel voorzichtig in de buffer met een plastic pipet om een mengsel van enkelvoudige cardiomyocyten te verkrijgen. Draag het mengsel na één minuut over naar een nieuwe buis en laat het bezinken zodra er een pellet is gevormd.Verwijder het supernatant en de resuspensie. Suspendeer de gepelletteerde cellen in vijf milliliters van de neutralisatie-wasbuffer. De cellen zijn nu klaar om te worden geselecteerd voor single-cell analyse.Verdun de cellen in een kleine Petrischaal, zodat ze individueel geselecteerd kunnen worden. Selecteer onder een microscoop gezonde individuele cellen met behulp van een getrokken pipet die is verbonden met een luchtsluis. Vermijd bij het opvangen van cellen contaminatie en beperk het opvangvolume tot minder dan 2 µL.Plaats de individuele cellen op de bodem van individuele PCR-buisjes en vries ze onmiddellijk in op droogijs. Bewaar de cellen vervolgens bij minus 80 °C. Begin met het resuspenderen van alle primerparen voor de genen van belang op 100 µM in één XDNA-suspensiebuffer, combineer deze en verdun de primerparen tot 20 µM. Verdun ten slotte alle primerparen tot één oplossing met een uiteindelijke concentratie van 200 nM.Nadat de primeroplossingen zijn voorbereid, stelt u de mastermix samen; haal de bevroren cellen onmiddellijk uit de vriezer en centrifugeer deze 30 seconden lang met maximale kracht. Voeg vervolgens negen µL van de mastermix toe aan elke buis en start de PCR. Haal de buizen uit het PCR-apparaat en voeg vier µL Exo-IT toe aan elke reactie.Laat vervolgens elke reactie 15 minuten lopen bij 37 °C, gevolgd door 15 minuten bij 80 °C. Sluit af door deze op 4 °C te houden. Verdun daarna de monsters in een verhouding van 1:5 met DNA-suspensiebuffer.De monsters zijn nu klaar voor kwantitatieve PCR-analyse. We gebruiken nu dit materiaal en het fluid IMS BIOMARK-systeem met de 48-punts 48 of 96-punts 96 genexpressie-arrays. Het is mogelijk om meer traditionele qPCR-formaten te gebruiken, zoals 96-well en 384-well platen.Dit is een well-formaat, maar dit beperkt het aantal assays dat uit een enkele cel kan worden uitgevoerd. Dit proces maakt gebruik van de WTA two kit van Sigma, waarmee dubbelstrengs cDNA uit zowel pellets als enkele cellen kan worden geamplificeerd. De kit ruptureert eerst het membraan van de enkele cellen en amplificeert vervolgens de boodschappen in twee ronden.Voeg na het uitvoeren van de stap voor de library-preparatie één vijfde van het library-monster toe aan 70 µL van de WTA two amplificatiemastermix en amplificeer de monsters gedurende 25 cycli volgens de parameters van de kit. Purificeer vervolgens de monsters met de Kayak Quick PCR-purificatiekit en verwerk deze op een Cain's Kayak Cube. Concentreer de gepurificeerde monsters na voltooiing tot vijf µL met behulp van een speed-vacuüm en gebruik de WTA two-kit om de monsters door 17 aanvullende amplificatiecycli te leiden met dezelfde parameters als bij de vorige amplificatie.Purificeer de monsters zoals eerder gedaan en controleer de kwaliteit ervan met een NanoDrop-spectrofotometer en de Bioanalyzer DNA 7.500 kit van Agilent. Label nu twee microgram dubbelstrengs cDNA van elk geamplificeerd celmonster met de one-color labeling kit van NimbleGen. Hybridiseer vijf microgram van het Cy3-gelabelde monster aan een NimbleGen gene expression array. Voer na de hybridisatie een wasbeurt uit en droog de slide zodat deze geïmageerd kunnen worden. Gebruik hiervoor een GenePicks 4.200 scanner van Molecular Devices met instellingen gekalibreerd op 100 POW en 300 tot 350 PMT.Analyseer de gene chips, genereer vervolgens paarbestanden voor elke array met de nimble scan-software van nimble gen en ga verder met de data-analyse. Een succesvol geprofundeerde hart produceerde een hoog percentage gezonde hartcellen die hun typische rechthoekige morfologie behielden. Als de profusie niet goed was verlopen, zouden veel cellen zijn afgestorven.Cellen werden geamplificeerd met de WTA two-methode en de kwaliteit van de eindproducten werd getest. Het monster vertoonde een robuuste amplificatie, zowel bij de Nanodrop-spectrofotometermeting als bij de elektroferogram-uitlezing van de bioanalyzer-chip. Samenvattend werden veel genen robuust tot expressie gebracht in de cardiomyocyten.Niet alle assays zijn echter even betrouwbaar, zoals blijkt uit deze heatmap van pieksmelttemperaturen uit een subset van nano fluid QPCR-gegevens. Elke rij van deze kaart vertegenwoordigt één enkelcelmonster in 43 afzonderlijke QPCR-assays. Sommige assays vertonen aanzienlijke variatie en zijn waarschijnlijk minder betrouwbaar dan assays met een hogere PCR-specificiteit.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u vooraf kwaliteitsvolle cellen moet verkrijgen. Dit waarborgt de kwaliteit van uw daaropvolgende genexpressie-profilering. Zodra de techniek onder de knie is, kan de procedure voor isolatie van enkelvoudige cellen in minder dan twee en een half uur worden voltooid, en kan de genexpressie-profilering van deze cellen in minder dan twee dagen worden afgerond.

single-cell-transcriptional-profiling-of-adult-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Leer de isolatie van volwassen muizen-cardiomyocyten en enkelvoudige-cel genexpressieanalyse met qPCR en microarray. Deze methode onthult cellulaire variabiliteit in cardiovasculair onderzoek.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Meer video's verkennen