Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Published 12/28/2011
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Cite this Article

Copy Citation

Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), e3302, doi:10.3791/3302 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Terwijl talrijke studies hebben onderzocht genexpressie verandert van homogenaten van hartweefsel, dit voorkomt dat het bestuderen van de inherente stochastische variatie tussen cellen in een weefsel. Isolatie van pure cardiomyocyte de bevolking door middel van een collagenase perfusie van de muis harten vergemakkelijkt de generatie van de cel-microarrays voor hele transcriptoom genexpressie, of qPCR van specifieke doelen met behulp van nanofluidic arrays. We beschrijven hier een procedure om enkele cel genexpressie profielen van cardiomyocyten geïsoleerd uit het hart te onderzoeken. Dit paradigma kan voor de evaluatie van de statistieken van belang die niet afhankelijk zijn van het gemiddelde (bijvoorbeeld variantie tussen de cellen binnen een weefsel), wat niet mogelijk is wanneer met behulp van conventionele hele weefsel workflows voor de evaluatie van genexpressie (figuur 1). We hebben bereikt robuuste versterking van de interne cel transcriptoom waardoor microgram dubbelstrengs cDNA dat het gebruik van microarrays op i vergemakkelijktNDIVIDUELE cellen. In de procedure beschrijven we het gebruik van NimbleGen arrays die werden geselecteerd voor hun gebruiksgemak en de mogelijkheid om hun ontwerp aan te passen. U kunt ook een reverse-transcriptase - specifieke doelamplificatie (RT-STA) reactie, zorgt voor qPCR van honderden doelstellingen door nanofluidic PCR. Met behulp van een van deze benaderingen, is het mogelijk te onderzoeken of het variabiliteit van expressie tussen de cellen, evenals onderzoeken expressie profielen van zeldzame celtypen vanuit een tissue. Algemeen, de enkele cel genexpressie aanpak zorgt voor het genereren van gegevens die mogelijk kunnen identificeren eigenzinnige expressie profielen die typisch zijn gemiddeld bij het onderzoek van de expressie van miljoenen cellen van de typische homogenaten gegenereerd op basis van hele weefsels.

Protocol

1. Stap 1 - Cardiomyocyte isolatie

  1. Bereid de spijsvertering buffer als volgt:
    10 x Spijsvertering Buffer (made in ultra-pure H 2 O)
    Final Conc. g / L g/500 ml 10x oplossing g / L
    NaCl 130 mM 7.597 3.3 75,97
    KCl 5 mM 0.4 0.2 4.0
    Pyrodruivenzuur 3 nM 0,33 0.165 3,30
    HEPES 25 mM 5,96 2,85 59,6
    MgCl 2 0,5 mM 0.101 0,05 1,01
    NaH 2PO 4monobasic 0,33 mM 0,04 0,02 0,40
    Dextrose 22 mM 3,96 1,98 39,6

    pH buffer tot 7,4 met NaOH
  2. Met behulp van de 10x Digestion Buffer, de volgende vier oplossingen voor elk hart dat zal worden geperfundeerd (made in ultra-pure H 2 O):

Spijsvertering Buffer A (Maak drie monsters van deze oplossingen)

  • 50 ml - 1x Vertering Buffer met daarin:
    • 75 pi - EGTA-oplossing (100 mM EGTA)

Spijsvertering Buffer B (Maak een van deze)

  • 25 ml - 1x Vertering Buffer met daarin:
    • 1.25 il - CaCl 2-oplossing (1 M)
    • 1 mg - Protease
    • 25 mg - Collagenase (can ook gebruik maken van 75% van dit bedrag = 18,75 mg) **

Collectie Buffer (Maak een van deze)

  • 2,5 ml - 1x Vertering Buffer met daarin:
    • 1.25 il - CaCl 2-oplossing (1 M)
    • 0,5 mg - Protease
    • 15 mg - Collagenase (75% = 11,25 mg) **
    • 125 mg - BSA

Neutralisatie Wash Buffer (Maak een van deze)

  • 25 ml - 1x Vertering Buffer met daarin:
    • 6.25 il - CaCl 2-oplossing (1 M)
    • 250 mg BSA

** Afhankelijk van de bron en de partij van collagenase, kan de enzymactiviteit variëren. Het kan nodig zijn om de hoeveelheid enzym toegevoegd aan deze buffer tot ruim-vergisting te voorkomen dat te optimaliseren.

  1. Stel het isolatiesysteem zoals eerder beschreven in detail 1,2 met drie 15 ml bekers van Spijsvertering Buffer A op ijs, een 50 ml tube Spijsvertering Buffer A en de 25 ml Digestion buffer B klaar voor perfusie (spijsvertering Buffer A moet gespoeld worden via de lijn, op minimum van 5 ml lopen door het systeem), Collection Buffer opgewarmd in een waterbad om de temperatuur te verhogen tot 37 ° C, en de neutralisatie Wash Buffer bij RT.
  2. Vul de perfusie canule en de dissectie gerecht waar het hart zal worden gereinigd en vastgebonden op de perfusie tip losjes met koud spijsvertering buffer A. knoop enkele hechting (4-O om 6-O-formaat) rond het bovenste gedeelte van de canule. Dit zal later worden gebruikt om de aorta te houden naar het hart afglijdt de canule te voorkomen.
  3. Terminaal rustig de muis met een IP-injectie van anestheticum (0,25 mL natriumpentobarbital oplossing) en zorgen voor de muis is bewusteloos en reageert op pijnprikkels. Snijd voorzichtig openen van de borstholte aan de thoracale marge met het snijden van de membraan(Figuur 2). Naar boven superieur snijden en de voorste ribbenkast (deze insnijdingen zijn aangewezen B en A, respectievelijk in Figuur 2) reflecteren Kritisch -. De muis moet nog worden voordat ademhaling deze insnijdingen.
  4. Met behulp van een plastic pipet op maat gesneden, zachtjes zuigen het hart in de pipet. Snijd het hart uit de borstholte voorzichtig om genoeg van de aorta te verlaten op het hart om duidelijk de aorta tak (figuur 3). Een pipet wordt gebruikt omdat het veroorzaakt minimale schade aan het hart.
  5. Drop het hart in een beker met ijs koude Spijsvertering Buffer A en weg te spoelen het bloed. Na 15 - 45 sec plaats het hart in de tweede beker van ijs koude spijsvertering Buffer A in het kort weer te spoelen. Overdracht van het hart in de petrischaal ook gevuld met koude spijsvertering buffer A.
  6. Bekijk het hart in de schotel van de spijsvertering Buffer A onder de dissectie omvang en zorgvuldig te isoleren van de aorta en zijn vertakkingen. Zorgvuldig te trimmen gewoon inferieur aan de laatste branch (Figuur 4).
  7. Plaats de canule tip in de aorta en ligeren in plaats met de 4-O om 6-O hechting met behulp van het podium setup onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat de canule niet te laag gaan zitten in de aorta en blijft boven de kransslagaders (figuur 4).
  8. Met Spijsvertering Buffer A die door de perfusie setup, plaats de perfusie tip over om de setup, en beginnen aan het hart perfuseren totdat het grootste deel van het bloed wordt gewassen uit het hart en vocht het verlaten van het hart is duidelijk. Kritisch - de temperatuur van de perfusie vloeistof moet zo dicht mogelijk tot 37 ° C als het gaat uit van de katheter. Als de oplossing is te warm of te koud is dan is de doorbloeding zal doden het weefsel. De tijd tot de doorbloeding van het hart is ook kritisch. Het tijdvenster moet minder dan 5-10 minuten vanaf wegnemen van het hart tot perfusie begint. Het hart moet worden verwijderd onder narcose, geen CO 2 aanbrengen of cervicale dislocatie.
  9. Zodra het bloed is washed uit het hart, naar de destructie-buffer B van de destructie-buffer A. Zorg ervoor dat de destructie-Buffer B nu stroomt door het hart. De oplossing begint met een gele tint hebben. Wacht 2-3 min tot het hart tekenen van het verliezen van zijn vorm en op zoek gaat naar ronde dat is een indicatie dat de spijsvertering werkt. Het myocard moet lichter verschijnen als de perfusie opbrengst.
  10. Snijd de ventrikels af met een schaar en plaats in een 50 ml conische buis met 15 ml van de collectie buffer bij 37 ° C. Voorzichtig snijden van de hartkamer in kleine stukjes, terwijl het plaatsen van het weefsel in de collectie Buffer. Meng voorzichtig met een plastic pipet naar de cel-cel adhesie los op en vul een enkele cel cardiomyocyt mengsel.
  11. Wanneer de meeste van het weefsel is opgelost, (minder dan 1 min) laat de grotere stukken weefsel zinken naar de bodem. Verwijderen en sla het supernatant om een ​​15 ml conische buis. Laat de zwaartekracht een pellet te trekken van het supernatant over 10 tot 20 min (15min bij voorkeur) bij kamertemperatuur.
  12. Verwijder de supernatant. Was pellet door het toevoegen van 5 ml van de neutralisatie Wash Buffer naar de pellet en meng de cellen om ze te mengen. Op dit moment worden de cellen direct klaar om te worden geselecteerd voor single cell analyse (ga naar stap 2).

2. Stap 2 - Isolatie van individuele cellen

  1. Bereid een micromanipulator met behulp van een vlam en een glazen capillaire buis die zal worden gebruikt om cellen te manipuleren. De micromanipulator is gewoon een heel fijn capillair, die vervolgens wordt aangesloten op een lang stuk flexibele slang die kunnen verplaatsen of pick-up-cellen wanneer afzuiging wordt toegepast.
  2. Onmiddellijk overgaan tot de selectie van de individuele cellen onder een microscoop (Nikon Eclipse TS100, 20x) met behulp van een micromanipulator dat is opgericht met een getrokken pipet en een luchtsluis om materiaal te voorkomen worden overgebracht naar de cel monsters monster. Zorg ervoor dat de cel populatie gezond is(70% levensvatbare) en niet beschadigd door de isolatie proces.
  3. Verdun de cellen die in een kleine petrischaal, zodat ze kunnen afzonderlijk worden geselecteerd. Bij het uitkiezen cellen moet u de cellen vast te leggen in een klein volume (minder dan 2 pi). Selecteer alleen gezonde cellen dat het onderscheidend normale cardiomyocyt morfologie (figuur 5).
  4. Plaats individuele cellen in de bodem van de individuele PCR-buizen en onmiddellijk te bevriezen ze op droog ijs. Deze cellen worden vervolgens opgeslagen bij -80 ° C tot ze worden gebruikt voor de analyse van genexpressie.

3. Stap 3A - Single cell qPCR genexpressie

Voor het uitvoeren van qPCR op enkele cellen maken gebruik van een protocol overgenomen uit een ontwikkeld voor enkele cel genexpressie door Fluidigm Corporation voor hun biomarkers nanofluidic qPCR arrays (Fluidigm - Advance Development Protocol # 30) 3,4.

  1. De voorbereiding van de reverse transcriptie - Specifieke Target Amplification (RT-STA). Te wordengin, hersuspenderen alle primerparen (we hebben gebruikt tot 125 primer paren met succes) voor de genen van de belangstelling op 100 uM in 1x DNA suspensie buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Combineer en verder van de forward en reverse primer paren te verdunnen tot 20 uM voor elke assay. Ten slotte, verdunnen alle primerparen in een oplossing met een concentratie van 200 nM voor elke test die zal worden versterkt in de RT-STA reactie. Om dit te doen, neem elk primerpaar en verdun ze 1:100. Bijvoorbeeld, als u 30 assay primerparen bij 20 uM, moet u een pi van elk paar (30 pi totaal) toe te voegen, en vervolgens de rest van het volume met 70 pi van DNA suspensie buffer om de finale te bereiken verdunning volume van 100 ul.
  2. Nu de primer oplossingen worden bereid, monteren van de RT-STA reactie master mix. Bereid voldoende Master Mix voor elk van de individuele cellen die u wenst te versterken.
    Reagens Volume in pi (per reactie)
    CellsDirect 2x Reactie mix 5.0
    SuperScript III RT Plantinum Taq mix 0.2
    RT-STA Primer mix (200 nM elk assay) 2.5
    Nuclease Gratis H 2 O (of 1x DNA suspensie buffer) 1.3
    Totaal 9.0
    Tabel 1. RT-STA master mix
  3. Verwijder onmiddellijk bevroren cellen en centrifugeer bij maximale RCF gedurende 30 seconden om ervoor te zorgen dat de cellen bevinden zich op de bodem van de buis. Voeg 9 ul van RT-STA mix aan de buis en ga naar de reactie in een thermocycler.
    1. 50 ° C - 15 minuten
    2. 95 ° C - 2 minuten
    3. 18 cycli van
      1. 95 ° C gedurende 15 seconden
      2. 60° C gedurende 4 minuten
    4. Houd bij 4 ° C
  4. Haal de buizen van de PCR-machine en voeg 4 pi van ExoSAP-IT voor de reactie. ExoSAP-IT is een PCR schoonmaakbeurt reagens dat overtollige primers en enzym zal verwijderen uit de RT-STA reactie. Voer de buizen via de volgende reactie in een PCR-machine.
    1. 37 ° C - 15 minuten
    2. 80 ° C - 15 minuten
    3. Houd bij 4 ° C
  5. Wanneer de ExoSAP-IT de behandeling klaar is, verdunnen de monsters 1:05 met DNA suspensie buffer. De monsters worden nu voorbereid om qPCR analyse. Wij gebruiken dit materiaal in combinatie met Gene Fluidigm's uitdrukking qPCR Arrays (48.48, 96.96 of platen). Het is ook mogelijk om deze benadering te gebruiken met meer traditionele qPCR instrumentatie (96 goed of goed 384 formaten). Echter, deze instrumenten vergen doorgaans veel meer monster-ingang waardoor het aantal testen dat kan worden beperkt performed van een enkele cel.

3. Stap 3B - Hele transcriptoom versterking en microarray van enkele cellen

Extractie en Versterking

  1. Gebruik Sigma's WTA2 kit (Cat # WTA2) tot dubbel-strengs cDNA van zowel pellets en enkele cellen te versterken. Enkele cellen worden "uitgepakt" via de eerste stap van Sigma's WTA2 protocol volgens de instructies van de fabrikant. Tijdens deze eerste stap de incubatie met bibliotheek synthese buffer bij 37 ° C gedurende 5 minuten verstoort het membraan van de afzonderlijke cellen en "extracten" de boodschap voor de versterking.
  2. Amplify enkele cellen in twee rondes, met behulp van de aanwijzingen van WTA2 kit de Sigma-Aldrich's. Voer de bibliotheek prep stap volgens protocol van de fabrikant; dan 1 / 5 van de bibliotheek monster toe te voegen aan 70 pi van de WTA2 versterking
    Master Mix. Amplify de monsters voor 25 cycli met de aanbevolen fiets-parameters.
  3. Zuiver de monsters using Qiagen's QIAquick PCR Purification Kit (Cat # 28104) en proces op Qiacube Qiagen's met behulp van de "Cleanup QIAquick PCR amplificatiereacties Standard V4" protocol.
  4. Concentreer de gezuiverde monsters naar 5 uL, met behulp van een vacuüm snelheid, en door een tweede ronde van versterking voor 17 cycli (WTA2 versterking protocol en fietsen parameters herhaald).
  5. Zuiver monsters met behulp van de PCR Purification Kit QIAquick en controleert de kwaliteit met behulp van een spectrofotometer NanoDrop en Agilent's BioAnalyzer DNA-7500 kit volgens protocol fabrikant.

Etikettering en NimbleGen Gene Expression Arrays

  1. Label 2 ug van dubbelstrengs cDNA van elk geamplificeerd cel monster met behulp van NimbleGen's One Color Labeling Kit (Cat # 05223555001) volgens protocol van de fabrikant.
  2. Hybridiseren 5 ug van Cy3 gelabeld monster op Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Arrays (Cat # 05543797001) conformOrding het protocol van de fabrikant. Na hybridisatie van de monsters naar het arrays, moeten de dia's dan worden gewassen en gedroogd voordat ze kunnen worden afgebeeld op een laser scanner.
  3. Scan Gene Expression Arrays met behulp van een laser scanner. Hier gebruiken we een Molecular Devices GenePix 4200A Scanner met de instellingen van 100POW, en 300-350PMT. Vervolgens genereert het paar bestanden voor elke array met NimbleScan software NimbleGen en vervolgens voor het hele transcriptoom expressie te analyseren vanuit elke afzonderlijke cel array (een tabel van de typische stabiel tot expressie cardiomyocyte transcripties is opgenomen als een supplement, tabel S1).

Als het hart perfusie werkte goed er moet een hoog percentage gezond hart cellen die hun typische rechthoekige morfologie behouden op isolatie worden. Als de doorbloeding niet goed verloopt dan zal er een groot percentage van de dode cellen (zie afbeeldingen in figuur 5) zijn. Als de cellen juist versterkt met behulp van de WTA2 of RT-STA methoden den de eindproducten moet passeren de daaropvolgende kwaliteitscontroles voor de kwaliteit van mRNA monsters door NanoDrop en BioAnalyser (figuur 6). Voor de microarray workflow, wordt deze voltooid na WTA versterking waarbij het mRNA wordt getest door zowel NanoDrop en Bioanalyzer. Vertegenwoordiger van positieve resultaten voor deze analyse zijn weergegeven in figuur 6. De WTA2 monsters moet blijken een robuuste versterking van zowel de NanoDrop spectrofotometer te lezen, evenals de electropherogram uitlezen van de Bioanalyzer (BA) chip (Figuur 6). Een tabel van de genen die stabiel werden ontdekt via microarray van enkele cellen is opgenomen als een voorbeeld (tabel S1). Voor de qPCR proces, kan de kwaliteit van de gegevens worden beoordeeld door het uitvoeren van een smelt stap aan het einde van de PCR-reactie om ervoor te zorgen dat de primer sets het gewenste product (figuur 7) versterken. Indien correct, moet dit smelten stap genereert een specifieke smelten piek. Ter illustratie van dit punt, is een subset van nanofluidic qPCR gegevens weergegeven in een heatmap van de piek smelten temperature (figuur 8) 8. Het is mogelijk om de kwaliteit van een PCR-product door de smelttemperatuur te beoordelen op het ontbreken van niet-specifieke producten 5 te garanderen. Elke rij van deze kaart vertegenwoordigt een cel monster (S1-S40) getest in 43 afzonderlijke qPCR assays (A1-A43). In deze figuur is het duidelijk dat sommige assays zijn nogal variabel en zijn waarschijnlijk minder betrouwbaar dan de meer stabiele testen met een hogere PCR specificiteit.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van de enkele cel isolatie en genexpressie analyse. De procedure zal tonen de chirurgische verwijdering van de muis het hart en de isolatie van de individuele hartspiercellen. De methoden besproken in deze procedure zijn de methoden voor zowel qPCR of microarray analyse na volledige transcriptoom amplificatie (WTA). De WTA-procedure begint met het lysis (A), dan de binding van Sigma's universele primers (B) op de mRNAzwembad. De uitbreiding van deze primers (C) en de versterking (D) fase maken microgram versterkt materiaal. Deze versterking wordt vervolgens herhaald (E) om voldoende materiaal voor de microarray procedure te genereren.

Figuur 2
Figuur 2. Vertegenwoordiging van de locatie van de incisies om het hart te verwijderen van de muis. Snijd langs de laterale wand van de ribbenkast (A) en snijd langs de onderste rand van de ribbenkast (B). Het snijden van de schepen boven en onder het hart zorgen voor het verwijderen en toch laat genoeg van de aorta naar het hart canule. Afbeeldingen aangepast van MJ Cook 6.

Figuur 3
Figuur 3. Schematische voorstelling van de thorax van de muis. De gestippelde lijnen geven de locaties van de incisies (A) voor weg te snijden het hart van de borstholte, zonder beschadiging van de h eart weefsel. Afbeeldingen aangepast van MJ Cook 6.

Figuur 4
Figuur 4. Afbeelding van de aortaboog en haar takken. De grijze lijn geeft de ideale locatie van waar de aorta (A) trim. De resterende aorta bevestigd aan het hart is canule, zodat het uiteinde van de canule (B) gaat naar het juiste niveau binnen de aorta (C). Afbeeldingen aangepast van F. Gaillard 7.

Figuur 5
Figuur 5. Selectie van enkele cellen voor genexpressie analyse. Elk paneel toont cardiomyocyten afgebeeld onder de lichtmicroscoop met typische morfologie van de hartspiercellen. Gezonde cardiomyocyten zijn aangegeven met de groene pijlen. Cellen die dood of stervend worden weergegeven met rode pijlen. Deze dode cellen mogen niet worden gebruikt in de analyse.

iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" Afbeelding 6 "/>
Figuur 6. Kwaliteitscontrole WTA resultaten voor de enkele cel versterking. (A) Afbeelding van een spectrofotometer NanoDrop uitlezing die geschikt is voor de versterkte transcripties van de WTA reactie. (B) Het uitlezen van de chip BioAnalyzer toont de resultaten van drie versterkt cellen.

Figuur 7
Figuur 7. QPCR versterking bochten (links grafiek) en piek smelttemperatuur curves (rechts grafiek). (A) De uitdrukking het gevolg is van een kwaliteit assay worden weergegeven met een enkele smelt piek ondanks verschillende versterking curves. (B) Smelt curves voor een slechte primer set, die zeer variabel smelten pieken die niet ideaal is voor expressie analyse.

Figuur 8
Figuur 8. Kwaliteitscontrole resultaten voor de enkele cel qPCR reagerenionen. Deze warmte kaart is gemaakt om de smelt temperaturen als een kleurenschaal weer te geven. De piek smelttemperatuur voor elke qPCR assay (A1-A43) is getoond voor 40 individuele cellen (S1-40). De testen werden gegroepeerd volgens hun smelttemperatuur. Door te kijken naar de kolom voor elke assay is het mogelijk om de variatie te zien smelten in alle monsters. Dit cijfer toont aan dat sommige qPCR assays zijn zeer specifiek terwijl anderen zijn zeer variabel en zijn dus niet geschikt voor single cell analyse.

Tabel S1. Aanvullende tabel van microarray data. Deze genen worden opgesomd volgens de robuustheid waarin ze zijn aangetroffen in enkele cardiomyocyten over een groot dataset. Dit gen lijst geeft de gevoeligheid van de detectie van een aantal genen die normaal gesproken worden uitgedrukt in een cardiomyocyten.

Discussion

Deze methode heeft de mogelijkheid om cardiomyocyten voor een aantal functionele en genexpressie studies te genereren. Het onderzoek van enkele cellen is een snel groeiende gebied in genexpressie analyse. Het voordeel van het onderzoek transcriptionele niveau op het niveau van de enkele cel is dat het onderzoek van een zuivere celpopulatie, wat niet mogelijk is van hele weefselpreparaten mogelijk maakt. Bovendien, single cell analyse maakt voor het onderzoek van stochastische variatie van mRNA niveaus in individuele cellen te celpopulaties die voorheen gedacht werd dat ze homogeen 8,9 definiëren. In aanvulling op het identificeren van genen die mogelijk in hun stochastische genexpressie 10,11,12, de methode maakt het ook mogelijk voor de identificatie van zeldzame celpopulaties gedefinieerd door hun genexpressie profielen.

Hoewel deze methode biedt een aantal interessante mogelijke toepassingen in de analyse van genexpressie, zijn er some bedenkingen en overwegingen bij het gebruik van enkele cellen. De belangrijkste beperking aan single cell analyse, is de verzameling van voldoende cellen in het experiment om statistische significantie te bereiken met betrekking tot de metriek van belang, bijvoorbeeld variantie. In gevallen waarin het aantal cellen geïsoleerd uit het weefsel van belang is geen beperking, kan men nagaan honderden cellen per groep, met behulp van benaderingen, zoals next-generation sequencing, of nanofluidic arrays. Echter, in sommige gevallen, kan er moeilijk bij het verkrijgen van voldoende cellen uit het weefsel van belang. Dit kan voor een deel veroorzaakt worden door eigenzinnige tijdrovende procedures voor de verzameling van de beoogde celtype. Kunnen echter een zorgvuldige planning en voorbereiding voordat u verdergaat met enkele cel collectie nog steeds zorgen voor strenge single cell analyse met een beperkte technische fout. Bij het onderzoek van de resultaten moet worden aangenomen, dat, hoewel deze procedure voor het isoleren van cellen is gebruikt in tal van Studies (waaronder microscopie, elektrofysiologie, enz.), kan de isolatie zelf mogelijk effect genexpressie. Zoals bij elke methode waarin de biologische monsters manipuleert, moeten de resultaten van uw bevindingen zorgvuldig worden gevalideerd om ervoor te zorgen de enkele cel expressie representatief is voor het weefsel zelf en niet van technische aard bias. Methoden, zoals in situ hybridisatie kan nuttig zijn om deze resultaten te verifiëren in de intact weefsel. Ten slotte is het essentieel om ervoor te zorgen dat de geproduceerde gegevens zorgvuldig wordt gecontroleerd op kwaliteit te controleren. De gegevens in figuur 8 laat zien dat qPCR assays kunnen zeer robuust zijn in hun specificiteit, zoals de test # 13 (A13) of hebben een hoge mate van variabiliteit die kan leiden tot technische variantie zoals de test # 34 (A34).

Acknowledgements

De auteurs willen graag de technische bijstand van de C. Zambataro te erkennen tijdens de opnames van dit protocol. Wij dankbaar erkennen de steun van de Glenn Stichting voor Medisch Onderzoek (SM), De Hillblom stichting, en de National Institutes of Health voor een Nathan Shock Center award (P30AG025708) en PO1AG025901. JMF werd ondersteund door T32AG000266 toegekend aan het Buck Instituut voor Onderzoek on Aging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich 71378
KCl Sigma-Aldrich 60128
Pyruvic Acid Sigma-Aldrich P4562
Hepes Sigma-Aldrich 54457
MgCl2 Sigma-Aldrich M1020
NaH2PO4 monobasic Sigma-Aldrich P9791
Dextrose Sigma-Aldrich G6721
NaOH Sigma-Aldrich 72068
EGTA Sigma-Aldrich O3777
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115
Protease, Type XIV Sigma-Aldrich P5147
Collagenase, Type I Worthington Biochemical C9891
1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) TEKnova, Inc. PN T0221
BSA Sigma-Aldrich B8667
Sodium Pentobarbital Henry Schein Contact supplier for ordering *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional
ExoSAP IT Affymetrix 78201
CellsDirect 2x Rxn Mix Invitrogen 11737-030
SuperScript III RT Platinum Taq Mix Invitrogen 10928-042
RT-STA Primer Mix IDT Custom
Nuclease Free water Sigma-Aldrich W4502
WTA2 Sigma-Aldrich WTA2-50rxn
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
Qiacube Qiagen 9001292
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop 2000c
BioAnalyzer DNA 7500 kit Agilent Technologies 7500 kit
One Color Labeling kit Roche Group 5223555001
Mus Musculus 12x135k array Roche Group 5543797001
GenePix 4200A Scanner Molecular Devices 4200A
TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) Sigma-Aldrich WTA2-50RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271, (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
  2. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57, (6), 327-335 (2007).
  3. Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18, (4), 675-685 (2010).
  4. Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121, (3), 1217-1221 (2011).
  5. D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50, (4), 262-270 (2010).
  6. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. Academic Press. (1965).
  7. Gaillard, F. Aorta. Radiopaedia. (2008).
  8. Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39, (4), e24-e24 (2011).
  9. Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8, (1), 68-74 (2008).
  10. Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441, (7096), 1011-1014 (2006).
  11. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, (2), 216-226 (2008).
  12. Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, (5584), 1183-1186 (2002).

Comments

1 Comment

  1. My 1st visit!
    As a retired physicist your site best exemplfies the exponential growth of technology-for useful and benefical purposes! Of course duality applies and the potential for misuse cannot be overestimated ! Envy greed and ego are primitive impulses :)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 31, 2011 - 12:09 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats