Name: Sitosolik Ca ölçümü 2 + İzole Kontraktil Lenfatikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin, izole sıçan mezenterik lenfatik damarlarda sitozolik kalsiyum ölçümü ve kontraksiyon dinamiklerini nasıl değerlendireceğinizi. Fura-2 AM ile ratiometrik görüntüleme, lenfatik düz kas fonksiyonunu incelemek için kontrollü bir sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content"&gt; Bu çalışma NIH hibe P20RR018766 ve Alkol Araştırma ABMRF / Vakfı&#39;ndan hibe ile desteklenmiştir.</p

1. Hayvanlar <ol><li> Tüm işlemler, Louisiana State Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH yayın No 85-12, 1996 revize) kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Erkek Sprague-Dawley sıçan (Charles River Laboratuvarları, 270-350 g vücut ağırlığı), kontrollü bir sıcaklık (22 ° C) ve kontrollü aydınlatma (00:12 saat aydınlık karanlık döngüsü) ortamında yerleştirildiler. Gelişinden sonra fareler, bir haftalık bir aklimasyonundan süre için sunulmuştur ve standart sıçan yemi (2018 Teklad Global% 18 Protein Kemirgen Diyet, Harlan) ve su ad libitum verilmiştir . </li></ol> 2. Set-Up Deney <ol><li> Montaj lenfatikler Cam mikropipetler filament OD 1.2mm ID 0.69mm (Sutter Enstrüman BF 120-69-15) Borosilikat yapılır. Flaming / Brown Mikropipet Çektirme model P-97 (Sutter Aletleri, pipetler çekinKBB) ve ~ 60 mm dış çapa sahip bir kesik uç elde etmek için bir Micro Öğütücü EG 400 (Narishige) olan konik. </li><li> Mikropipetler izole damar odası (CH-1 modeli, Oturma Sistemleri, Burlington, VT) monte edin. Pipetler (aynı boyutta açma) direnç uyumlu olmalıdır. </li><li> Dolgu odası (5 ml) ve albümin-fizyolojik tuz çözeltisi ile mikropipetler (APSS bkz. Tablo 1). Mikropipetler veya tüp hiçbir baloncuklar olmadığından emin olun. </li><li> Knot overhand oftalmik sütür ve her mikropipet bir yer hazırlayın. </li></ol> 3. Lenfatik İzolasyon Toplama <ol><li> (1 ml), BD şırınga ve iğne (BD intradermal konik 26G3 / 8), ketamin / xylazine bir intramüsküler enjeksiyon (sırasıyla 90 ve 9 mg / kg) ile hayvanların anestezisi. </li><li> Karın bölgesinde,% 70 alkol ile sterilize etmek için Sprey orta hat laparotomi yapmak ve ince barsak ve mezenter exteriorize ve özel tüketim. Ic içinde doku yerleştirin.e-soğuk APSS. Aşırı dozda ketamin / xylazine hayvanlar Euthanize ve göğüs (ötenazi Amerikan Veteriner Hekimler Derneği kurallar başına) açarak ölüm onaylayın. </li><li> Diseksiyonu odasında buz APSS ile dolu bir mezenter bir bölümü Pin. Dikkatlice bir stereomikroskopta yardımı ile yağ ve bağ dokusu çevresindeki lenfatik damar toplanması teşrih (80-200 mikron iç çapı ve uzunluğu 1-2 mm). (Güzel Bilim Araçları # 15.000-03) Dumont forseps-INOX 55 diseksiyon (Güzel Bilim Araçları # 11.255-20) ve yaylı makas diseksiyon kullanın. Deney süresince tüm segmentinde en uygun basınç kontrolü sağlamak için sadece bir vana ile izole damarlarda kullanın. </li><li> APSS 5 ml'lik izole damar odasına izole lenfatik aktarın. Oftalmik sütür bağlama gemi direnç eşleştirilmiş iki cam mikropipetler üzerine monte edin. </li><li> Odasının ters bir floresan mikroskop Devret (bizim bir NikTE-2000U), xenon lambası (Sutter Aletleri Lambda LS2 300 W) 340/380 filtre tekerlek sistemi (Krom Teknoloji 340 ve 380 nm eksitasyon filtreler ile Sutter Lambda 10-3), 510 nm dikroik emitör (Krom Teknoloji D510 ile donatılmıştır / 80m), hassas CCD kamera (Photometrics HQ 2) ve satın alma için yazılım (Nikon Elements AR) (Şekil 1) . </li><li> Ya ayarlı rezervuarlar veya basınç ve debi değiştirmek için kullanılabilecek hem servo-feedback pompa sistemi (Living Sistemleri Enstrümantasyon, Burlington VT), mikropipetler kaynaklı boru takın. </li><li> Odasının ısıtma ünitesi (Living Systems) bağlayın ve 37 ° C'ye kadar banyo seti </li><li> 10X objektif (Nikon Planı Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0.17, 16.0 WD) ile odanın tabanında doğrudan lamel lenfatik gör. Hızlı time-lapse görüntü setleri görüntü elde etme yazılımı (bizim sistemi Nikon Elements AR yazılımı) kullanarak elde edilebilir. </li></ol>2 +] i oranlı metrik Ölçme <ol><li> [Ca 2 +], izole lenfatik düz kas i + algılama boya Fura 2-acetoxymethyl ester (PM) (Moleküler Probları, Eugene, OR) Ca 2 ile ölçülür . </li><li> 37 30 dakika Fura 02:00 (2 mcM) ve pluronic asit (0.2% wt / vol) içeren bir çözüm APSS banyo alışverişi Fura-2 AM lenfatik damar Yük ° C </li><li> 30 dakika sonra çözüm APSS geri banyo değiştirmek. Fura-2 banyo çözüm yıkamak için 2 kez durulayın. 20 dakika önce en az bir dengeleme zamanı gemi bırakın [Ca 2 +] i ölçümler izin vermek için spontan kasılmaların yeniden kurulması. </li><li> Alternatif olarak her biri 50 ms süreler için 340 ve 380 nm dalga boylarında aydınlatan bir satın alma protokolü ile oranlı metrik Fura-2 ölçüm izole lenfatiklerde toplayın. Chroma Te dikroik ayna (400 nm floresan ışık geçer;chnology Corp 400DCLP) ve geniş bant emisyon filtresi (510 nm, 80 nm bant genişliği; Chroma Technology Corp D510/80m) ve Photometrics HQ 2 kamera ile elde edilir. Biz 2 cm H 2 O bir temel intraluminal basınç ve +2 adım artar, 4, 6, 8 sırasında 2 dakika veri toplamak ve 10 cm H 2 O </li><li> Ortalama çözümlemek için [Ca 2 +] i, tüm lenf gemi ve gemi tam gevşeme ve kasılma (Şekil 2) sırasında izlenen böylece çevredeki içeren bir ilgi bölgesi (ROI) çizin. Ya mikropipet görüş alanı ise bu alanlarda yatırım getirisi dahil edilmemelidir. Daha küçük ROI'ler küçük ROI'ler potansiyel bir sorun da ancak geminin daraltır ve rahatlatır damarı duvarlarının ROI boyuna biraz hareket etmiş olabileceğini, seçilebilir. Bir diğer potansiyel sorun, bazı damarların kasılması sırasında büküm olduğunu ve bu lenfatiklerde çalışma için kullanılmamalıdır. The büküm hareketleri genellikle izole lenfatik &lt;1 mm uzunluğu sınırlayarak kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, bazen bir vana iki tarafta segmentleri sıkmak yok / senkronize rahatlayın. Bu durumda, çünkü bu kesimleri ayrı işlevsel lymphangions temsil, lenfatik vana sadece bir tarafında eğitim olmalıdır, ya da her lymphangion iki tarafında yerleştirilen bir yatırım getirisi ile ayrı ayrı incelenebilir. 10X objektif kullanırken, damar duvarları Ancak bu alanlarda yatırım getirisi dahil edilmemelidir kasılmalar sırasında odak duvarların herhangi bir parça vardır, fazik kasılmaları sırasında odak kalmalıdır. Arka plan ROI da kullanılır ve gemi (örneğin görüntünün köşesinde) uzak konulmalıdır. 340 / 380 oranında bir artış [Ca 2 +] i bir artış gösterir. Luminal çapı farklı zaman noktalarında (bkz. Bölüm 6) veya zamanla damar duvarları takip ederek yazılımın önlem işlevini kullanarak ölçülen olabilir./ Li&gt; </li></ol> 5. Basınç Kontrol Protokolü <ol><li> Bağımsız basınç uyguladığı akışı çalışma için boş servo geribildirim pompa ile aynı basınç her mikropipet uygulanabilir olmalıdır. Her mikropipet boru, pompa monte edilmiş ortak boru bir T-bağlayıcısı ile eklenir. Başlangıçta 45-60 dk. Lenfatik spontan kasılmaları gelişimine izin vermek için yeterli zamanı için 2 cm H 2 O intraluminal basınç ayarlayın. </li><li> Çalışma için dengeleme süre içinde aşağıdaki kriterlere uygun sadece damarları kullanın: (1) gemi, 2 cm H 2 O kendiliğinden gelişir ton (2) gemi, geminin uzunluğu boyunca makul üniform düzenli, spontan kasılmaları gelişir . Genellikle bir vana alanında downstream geminin geri kalanından daha fazla daraltır ve bu gemiler geminin kalan kontraktil faaliyet gösteren kanıt yoktur kullanılacaktır. </li><li>Basınç adım prosedürü sırasında hızlı time-lapse görüntüleri kaydedin. Her biri için, 30 saniye 2 cm H 2 O basınç başlayacak, sonra 6, 4, 2 ile bir adım, bir dakika için 8 veya 10 cm H 2 O yükseltilir ve geri indirdi 2 cm H 2 O, 30 s. </li><li> Basınç adım serisi tamamlandıktan sonra, yukarıdaki luminal baskıların her maksimal pasif çapı (D Max) ve Ca 2 + floresans ölçümleri ölçmek için banyo çözüm + ücretsiz APSS 37 Ca 2 ° C değiştirin. D Max, tonu hesaplamak ve farklı boyutlarda lenfatikler arasında veri normalleştirmek için kullanılır . </li></ol> 6. Lenfatik Kontraktil parametreler <ol><li> Zamanla damar çapı değişiklikler, çoğu görüntü analiz yazılımı paketleri nesne izleme araçları kullanılarak tespit edilebilir. Bu kanalların sadece biri (340 nm kanalı kullanılan ancak 380 kanal da olabilir) kullanılarak elde edilebilir. Bir kontrast eşik appdamar duvarları vurgulanır böylece görüntü yığın yalan ve sonra her bir duvarı kapsayan ROI (Şekil 3 A), zaman içinde onları izlemek için çizilir . Iç çapı Her duvarın kalınlığı eksi yarısı, her duvarın centroid ölçme ve iki kütle merkezleri arasındaki mesafe hesaplanırken tespit edilebilir. Luminal alanda güçlü bir sinyal nedeniyle her duvar izlemek için zor bir ikinci seçenek, dış çapı ölçümü ve damar duvarlarının iç çapı elde etmek için statik bir ölçüm dayalı bir düzeltme faktörü kullanmak için. Bu durumda, yatırım getirisi, tüm gemi kapsar ve dış çapı (Şekil 3 B) izlenir . Bu yöntem aynı zamanda lenfatik tüm görüntülenebilir kesit alanı (Şekil 3 C) belirlemek için kullanılabilir. Çünkü bir lymphangion tipik şekli, bu ikinci seçenek, her kasılma ile seçilen bir parçası çapı kullanmaktan daha pompalanır gerçek sıvısı hacminin daha iyi bir tahmin sağlar.Geminin. </li><li> Time-lapse çalışma lenfatik luminal çap ölçümleri 4,12,13 aşağıdaki parametreleri belirler: Daralma frekans (CF), dakikada fazik kasılmaları sayma sayısı tarafından belirlenir. Fazik bir daralma hemen önce çapı diyastolik çapı (EDD), End. Sistol sonu çapı (ESD), fazik bir daralma sonunda çapı. Daralma Genlik (AMP = EDD-ESD), atım hacmi basitleştirilmiş bir dizin. Lenfatik düz kas tarafından üretilen sesi belirlemek için kullanılabilir ve aynı zamanda değişik çap lenfatikler arasında veri normalleştirmek için kullanılır, ya da maksimal pasif her basınçta çapı (Ca 2 + ücretsiz koşulları belirlenir Max D) Aynı lenfatik farklı luminal basınçlarda okudu. EDD 1, basınç adımdan sonra ilk daralma ile ilişkili EDD. Bu bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılır.luminal basıncı 5 bir adım artışa yanıt olarak lenf damar miyojenik daralma belirleyici. D / Max basınç adımdan sonra izole bir lenfatik miyojenik daralma normalize değişim = 100 * (EDD 1 EDD) bir basınç adım artış aşağıdaki EDD tarafından temsil edilmektedir. Hesaplanmış olabilir, ancak başka ayrıntı 4 tartışılmıştır ek değişkenler şunlardır: Ton = 100 * (Max D - EDD) D / Max, normalize AMP = AMP / Max D Strok volüm indeksi (SVI) = π (EDD 2 - ESD 2) Ejeksiyon Fraksiyonu (EF) = SVI / (πEDD2) Debi Endeksi (VFI) = CF x SVI. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Her fazik daralma başında, [Ca 2 +] i (Şekil 4) geçici bir artış vardı. Buna ek olarak, luminal basınç adım artar sonra, frekans Ca 2 + transientler ve phasic kasılmaları senkronize arttı. Bu gözlemler, bir tel myograph 14 üzerine monte edilmiş ve salınım Ca 2 + sürümü fazik kasılma döngüsü 15 altında yatan mekanizma iç mağazalar için merkezi bir rol gösteren önceki verileri destek torasik kanalları kullanarak bir önceki bulmaya benzer . Biz de araştırıldı olmadığını [Ca 2 +] i diyastolde (Ca 2 ila + transientler ve fazik kasılmaları), lenfatik sesi ve basınç adım artar (Şekil 5) dayatılan streç neden miyojenik daralma ile ilişkilidir . Hemen basınç adım (Şekil 5B) evvelki göre giderek artan diyastolde 4 cm H 2 O ve üzeri, [Ca 2 +] i, basınç adım artar. Buna ek olarak, çapı, basınç (EDD 1) adım artışları nedeniyle ilk artıştan sonra, miyojenik daralma (Şekil vardıönceki raporlarda 5,12 EDD 1 EDD bir azalma olarak tanımlanır ure 5C). Farklı basınç adımları arasında EDD ortalama normalize değişim karşılaştırıldığında, önemli ölçüde daha fazla daralma 8 artış sonra ve 10 cm H 2 O 2 cm H 2 O (Şekil 6 A) . Istikrarlı bir yükseliş [Ca 2 +] i de Ca 2 de anlamlı olarak daha yüksek değişikliklere neden adım +6 artar, 8 ve 10 cm H 2 O, basınç ile ilgili + den 2 cm H 2 O ( Şekil 6 B). Ancak, basınç adım Ca 2 + ilişki de bu baskılara plato gibi görünüyor. Bu sonuçlar, Ca 2 +-bağımlı bir mekanizma streç yanıt lenfatik miyojenik daralma ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Ancak, plato basınç adım Ca 2 + ilişki + duyarlılık, aynı zamanda artan miyojenik constri katkıda bulunabilir Ca 2 arttıran bir mekanizma öneriyoryüksek basınç adım ction. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 ölçümü için kullanılan mikroskop sistemi şematik [Ca 2 +] i izole bir lenfatik. Inverted mikroskop aşamasında izole lenfatik odasına yerleştirilir. Örnek, 340 ve 380 nm dalga boyunda alternatif aydınlatılmış ve lenfatik tarafından yayılan floresan sinyal bir CCD kamera ile toplanır ve kişisel bir bilgisayarda saklanır. Lenfatik intraluminal basınç boş bir servo-geribildirim sistemi tarafından kontrol edilir. Kullanıcı sistemi için basıncı ayarlar ve basınç dönüştürücüleri lenfatik in-line geri besleme sistemi, dinamik yükseltmek, ya da bir pompa aracılığı ile düşük basınç intraluminal basınç rölesini. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. İlgi Bölgesi Örneği (ROBen izole lenf damarlarına Fura-2 oranlı metrik görüntüleme çalışmaları için) seçimi. Seçilen bölge, geminin tüm kurs için takip edilecek sağlamak için en gemi (mikropipetler dokunmadan alanlar hariç) ve çevresini içerir. Arka plan YG (sağ üst köşe) de çevresindeki hamamı nonspesifik sinyal ortadan kaldırmak için kullanılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 pompalama izleme lenfatik Yöntemleri. A. İç çapı ROI'ler kullanarak zamanla tespit edilebilir, damar duvarları takip hareketi. B. kontrast eşiği tüm gemi olarak ayarlandığında, dış çapı tek bir yatırım getirisi ile takip edilebilir. İç çapı, duvar kalınlığı düzelterek bu ölçümler tahmin edilebilir. C . Başka bir seçenek ve duvar kalınlığı düzelterek ses düzeyini hesaplamak için kullanılabilir alan gemi kapsadığı izlemek içinlenfatik varsayarak silindirik geometri vardır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 arasındaki ilişki [Ca 2 +] i ve lenfatik çapı. Izole bir lenfatik Fura-2 yoğunluğu (ısı haritası biçimi) bir time-lapse video Temsilcisi görüntüler. Her resimde oklar geminin dış çapı anahat. Resim 1 diyastolde lenfatik, nispeten düşük [Ca 2 +] i gösterir. Görüntü 2, damar duvarlarında 340/380 oranı arttıkça yoğunluğu, görüntüleri 3-5 oluşur fazik daralma hemen önce. Resmi 4 Ca 2 + geçici sona erdi ve görüntü 5, sistolik faz sona erdi ve damar dinlenme haline geri dönüyor. B. [Ca 2 +] i ve lenfatik luminal çapı bir arsa, geçici bir artış [Ca 2 +] i her biri için hemen önce gerçekleştiğini gösteriyorfazik daralma. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 lenfatik değişiklikler [Ca 2 +] i ve lenfatik kontraktil yanıt döngüsü basınç artışları adım. Basınç adım protokolleri (A), [Ca 2 +] i (B) ve (C) üzerinde lenfatik çapı değişiklikleri temsil 340/380 oranı verileri, gösterilmiştir. A. Temel luminal basıncı 2 cm H 2 O ve lenfatik damar +2 artış, 4, 6, 8 adım maruz kaldı ve 10 cm H 2 O Her basınç adım kayıt arasındaki zaman aralığı 1-2 dakika idi. Her basınç adım, geçici artar hem de frekans bir artışa neden olmuştur [Ca 2 +] i (B) ve fazik kasılmaları (C) . Lenfatik çapı da her adım luminal basınç artışı ile artan ve 4-10 cm H 2 O basınç adımları, af oluştu EDD bir ilk düşüş olduter EDD1 (C), daha önce lenfatik miyojenik daralma olarak tarif. Bazal istikrarlı bir artış vardı [Ca 2 +] i transientler arasında hemen her adım basınç artışı (B). Miyojenik daralma büyük basınç adımları daha belirgindir Ancak bazal [Ca 2 +] artış i H 2 O basınç adımları (B) 4-10 cm için yaklaşık aynıydı. AMP önceden bildirilen bir telafi edici artış 6-10 cm H 2 O (C) basınç adımlardan sonra da belliydi . <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3438/3438fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 basınç adım artışları kısa bir süre sonra Lenfatik miyojenik daralma ve ücretsiz olarak kademeli bir artış [Ca 2 +] i diyastolde. EDD 1 ay sonra 30-50 sn arasında EDD ortalaması, her bir basınç adım için normalize EDD değişimi hesaplamak için kullanılır. B. 1 EDD sonra 340/380 oranı 30-50 s yoğunluğu başlangıca sırasında ortalama 340/380 oranı (2 cm H 2 O) tarafından ikiye bölündü. * P &lt;0.05 2 cm H 2 O basınç adım vs. N = 4 gemilerin okudu. Movie 1 Örnek çalışma için kullanılan bir izole lenf damarı fazik kasılmaları. Luminal 2 cm H 2 O basınç kuruldu Geçen süre ve bir ölçek çubuğu alt kısmında. Time-lapse görüntüleri 10X amacı ile iletilen ışık kullanılarak toplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3438/3438movie1.avi">film izlemek için buraya tıklayın.</a> Pompalama izole lenfatik Movie 2 oranlı metrik Fura-2 görüntüleme. Bir ısı haritası ölçeği sol üst kısmında gösterilir ve geçen zaman ve ölçek çubuğu alt kısmında gösterilir. Basıncı başlangıçta 2 cm H 2 O ve 0.5 dak ve returne başlayan 8 cm H 2 O büyüdüd 1.5 min 2 cm H 2 O <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3438/3438movie2.avi">film izlemek için tıklayınız.</a>

<ol><li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+system%3A+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, Suppl 1. 94-94 (2010).</li>
<li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+biology+and+the+microcirculation%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li>
<li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li>
<li>Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+constriction+and+dilation+of+isolated+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).</li>
<li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li>
<li>Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin+luminescence+during+activation+of+single+isolated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells.</a> Nature. 280, 506-506 (1979).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li>
<li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements%2C+distribution%2C+and+functions+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li>
<li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity%3A+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li>
<li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II%3A+modulated+by+G+proteins%2C+kinases%2C+and+myosin+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat.+Res.+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li>
<li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li>
<li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li>
<li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2%2B+concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Lenf damarları pompalama içsel çalışma yöntemleri yeni bir kombinasyonu kullanılmıştır. Aynı anda değişiklikleri ölçmek için yeteneği [Ca 2 +] i ve pompa lenfatikler çap Ca 2 göreceli katkıları +-bağımlı ve Ca 2 + lenfatik kasılma döngüsünü düzenleyen genel mekanizması duyarlılaştırıcı sinyalizasyon yolaklar çalışmaları için izin verecek Lenfatik kasılma döngüsü ton üzerinde üst üste fazik kasılmaları oluşur. Verileri her fazik bir kasıl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Zil 5x STOKUN </td></tr><tr><td Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Potasyum klorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1.75 g </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1.47 g </td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td&gt; <td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125.6 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td> 4 otoklavlanmış mağaza şişe ve içine steril filtre ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Albumin Fizyolojik Tuz Çözeltisi (APSS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> Zil stoku (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Mops Tampon </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0.168 g </td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sodyum salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albümin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steril Filtreli su </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 1 L Getir </td></tr><tr><td> 37 ° pH 7.4 &#39;e ayarlayın ° C, 4 otoklavlanmış şişe ve depoya sonra steril filtre ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Özel Reaktifler. 4 Tüm Mağaza ° C

sitosolik ca ölçümü 2 + İzole kontraktil lenfatikler

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lenf damarları, merkezi dolaşıma lipidler teslim sıvı homeostazı korur ve potansiyel olarak zararlı antijenler için bir gözetim sistemi gibi davranır, mukozal bağışıklık ve adaptif immün yanıtları 1 optimize çok fonksiyonlu bir ulaşım sistemi oluşturmaktadır. Lenf kör uçlu ilk lenfatikler girer ve daha sonra büyük toplama lenfatiklerde bir basınç gradiyenti karşı taşınır interstisyel sıvı oluşur. Her toplama lenfatik akışı önlemek Biküspit valfleri ile ayrılmış, lymphangions adı verilen parçalar bir dizi oluşur. Her lymphangion 2 merkez dolaşımını doğru bir basınç gradiyenti karşı lenf propels bir kasılma döngüsü sahiptir. Bu fazik kontraktil desen, sistolik ve diyastolik aşamaları kalp döngüsü benzer ve daha düşük bir daralma frekansı 4 . Buna ek olarak, lenfatik düz kas tonu üretir ve miyojenik daralma ve dilatasyon görüntüler In sırasıyla luminal basınç artar ve azalır, 5 yanıt. Böylece lenfatiklerin fazik ve tonik kontraktilite destekleyen bir melez moleküler mekanizmaları önerilmiştir. Düz kas daralma genellikle sitozolik Ca 2 tarafından düzenlenir + konsantrasyonu ([Ca 2 +] i) Ca 2 artı hassasiyet + 6 hücre çevresindeki ortam değişikliklerine yanıt olarak kontraktil elemanları. [Ca 2 +] i Ca 2 + plazma zarı ligand veya voltaj kapılı Ca 2 + kanalları ve Ca 2 + iç mağazalardan salınımı ve alımı yoluyla hareketin kombinasyonu ile belirlenir. Sitosolik Ca 2 + kalmodulin bağlanır ve miyozin hafif zincir gibi enzimleri harekete geçirir (MLC) da MLC aktin-miyozin aracılı kasılma 8 önde gelen fosforile kinaz (MLCK). Ancak, bu yolun Ca duyarlılığını <sup&gt; 2 + MLC fosfataz (MLKP) 9 ile düzenlenir. MLKP faaliyet Rho kinaz (ROCK) ve miyozin fosfataz inhibitörü protein TÜFE-17 tarafından düzenlenir. Burada, Ca 2 +-bağımlı ve Ca 2 + lenfatik düz kas kasılması-duyarlılaştırıcı mekanizmaları araştırmak için izole perfüze lenfatikler zamanla [+ Ca 2] i değişiklikleri değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Izole sıçan mezenterik toplama lenfatikler kullanarak [+ Ca 2] i ve kontraktil aktivite streç bağlı değişiklikleri okudu. Izole lenfatik modeli, basınç, debi, ve banyo çözüm kimyasal bileşimi sıkı bir şekilde kontrol edilebilir avantaj sunuyor. [Ca 2 +] i oranlı metrik, Ca 2 + bağlayıcı boya Fura-2 lenfatikler yükleyerek tespit edildi. Bu çalışmalar daha geniş fazik düzenleyen farklı moleküler mekanizmaları eğitim sorunu için yeni bir yaklaşım sağlayacaktır.tonik daralma karşı lenfatik düz kas kasılmaları.

Biz sitozolik Ca değerlendirmek için bir yaklaşım tanıtmak<sup&gt; 2 +</sup&gt; Ca çalışmada izole lenfatiklerde konsantrasyon<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Bağımlı ve Ca<sup&gt; 2 +</supLenfatik düz kas kasılması&gt; duyarlılaştırıcı mekanizmaları.

Sitosolik Ca ölçümü 2 + İzole Kontraktil Lenfatikler

Lenfatik damarlar; sıvı homeostazını koruyan, lipidleri merkezi dolaşıma ileten ve ... şeklinde görev yapan çok fonksiyonlu bir taşıma sisteminden oluşur.

Bu deneysel sistem, hücre içi kalsiyumdaki değişimlerin, yükseltilmiş lüminal basıncın neden olduğu lenfatik kasılma paterni değişiklikleriyle ilişkili olup olmadığını belirler. İlk olarak, sıçan mezenterinden kasılabilir bir lenfatik damar çıkarın ve lüminal basıncı sıkı bir şekilde kontrol etmek için her iki ucunu kanüle edin. Ardından, damarı, 40 ve 80 nanometrelik dönüşümlü üç eksitasyonla floresan mikroskopi kullanarakle sitozolik kalsiyumdaki değişimlerin ölçülmesine olanak tanıyan rasyometrik kalsiyum algılayıcı boya fira 2:00 AM ile yükleyin.Damar lümen basıncına maruz bırakılırken lenfatik damar çapındaki değişimleri ve sitozolik kalsiyum seviyelerini kaydedin. Adım protokolü ayrıca elde edilen zaman atlamalı görüntülerden lenfatik çapı da belirler. Sonuçlar, sitozolik kalsiyumdaki geçici artışlar ile lenfatik damarların fazik kasılmaları arasında zamansal bir ilişki olduğunu ve kalsiyum seviyeleri ile miyojenik daralma arasında bir korelasyon olduğunu göstermektedir.Bu tekniğin intravital mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; inflamasyon hızı, nörojenik ve endrin kontroller ile lüminal basınç ve akış dahil olmak üzere lenfatik pompalama üzerindeki dışsal

measurement-of-cytosolic-ca2-in-isolated-contractile-lymphatics

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Murin sol ventrikül papiller kas in vitro kardiyak kontraktiliteyi araştırmak için kullanılabilir. Bu makalede ayrıntılı olarak izolasyon ve deneysel protokoller kalp kasılma özelliklerini incelemek için açıklar.

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Bu makale, sıçan kalbinden izole edilen kardiyak miyositlerde kasılma sırasında miyofilament Ca2+ duyarlılığındaki değişiklikleri değerlendiren bir protokolü açıklamaktadır. Kardiyak elektrofizyoloji, sistolik/diyastolik sitozol Ca2+ seviyeleri ve kasılma/gevşeme ile birlikte bu ölçüm, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesine aracılık eden mekanizmaların desteklenmesinde zorunludur.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca2 + rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.

Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Bu protokol, kasılan lenf damarlarında sitosolik, serbest kalsiyum [Ca2 +] i ve damar çapını gerçek zamanlı olarak ölçmek ve ardından mutlak Ca2+ konsantrasyonlarının yanı sıra kasılma / ritmiklik parametrelerini hesaplamak için bir yöntemi tanımlar. Bu protokol, çeşitli deneysel koşullarda Ca2+ ve kasılma dinamiklerini incelemek için kullanılabilir.

İzole, Basınçlı Lenf Damarlarında Mutlak, Sitosolik, Serbest Ca2+ ve Karşılık Gelen Kontraktilitenin Gerçek Zamanlı Değerlendirmesi

Öğrenin, izole sıçan mezenterik lenfatik damarlarda sitozolik kalsiyum ölçümü ve kontraksiyon dinamiklerini nasıl değerlendireceğinizi. Fura-2 AM ile ratiometrik görüntüleme, lenfatik düz kas fonksiyonunu incelemek için kontrollü bir sistem sunar.

Sitosolik Ca ölçümü^{2 +} İzole Kontraktil Lenfatikler

Daha fazla video keşfet