Name: HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 학습하세요 Gaussia 루시페라제 mRNA의 시험관내 전사 및 캡핑 방법을 HeLa 세포에 도입하여 발광 활성을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 고수율 RNA 합성과 효소적 캡핑을 통해 안정적인 단백질 발현을 검증합니다.

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Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.

RNase는 일반적으로 피부, 머리카락, 먼지, 실험실 표면, 용액 등에 존재합니다. RNase 오염을 방지하기 위해 사용 전 장갑을 착용하고 벤치 표면, 피펫 등을 철저히 세척하십시오. nuclease-free 피펫 팁, 튜브, 유리 기구 및 시약의 사용을 강력히 권장합니다.
1. T7 High-yield RNA Synthesis Kit를 이용한 In vitro 전사
전사 반응을 위한 DNA 템플릿은 Gaussia 루시퍼레이스 유전자와 코딩 서열 상류의 T7 프로모터를 포함하는 선형화된 플라스미드입니다(그림 1B).
<ol>
	<li>T7 High Yield RNA Synthesis kit의 구성 성분을 해동하여 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>uncapped RNA의 경우, 상온에서 다음 순서대로 반응액을 조제하십시오:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>부피 (μl)</td>
			<td>최종</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>뉴클레아제 프리 워터*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X 반응 완충액</td>
			<td>2</td>
			<td>1배수</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>템플릿 DNA *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA 중합효소 믹스</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>합계</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*1 μg DNA를 첨가하고 nuclease free water로 전체 반응 부피를 20 μl로 맞춥니다. 첨가할 물의 양은 템플릿 DNA의 농도에 따라 달라집니다.
<ol start="3">
	<li>캡핑된 RNA의 경우: 상온에서 다음 순서대로 반응을 준비합니다:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>성분</td>
			<td>부피 (μl)</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Reaction Buffer</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G cap analog (ARCA)(40mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template DNA*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase Mix</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 합계</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*1 μg DNA를 첨가하고 nuclease free water로 전체 반응 부피를 20 μl가 되도록 맞춥니다. 첨가할 물의 양은 템플릿 DNA의 농도에 따라 달라집니다.
<ol start="4">
	<li>볼텍싱으로 잘 섞은 후, 건식 공기 배양기에서 37 °C로 2시간 동안 반응물을 배양합니다.</li>
	<li>단계 1.3-1.4를 사용하여, CLuc 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드로부터 Cypridina luciferase (CLuc)의 캡핑된 전사체를 합성합니다. 이 mRNA는 GLuc 발현의 정규화를 위해 캡핑 및 비캡핑 GLuc mRNA와 함께 공동 형질전환됩니다.</li>
</ol>
2. 템플릿 DNA 제거
정제 단계로 넘어가기 전, DNA 템플릿을 제거하기 위해 전사 반응물에 DNase I을 처리합니다.
<ol>
	<li>전사 반응액에 nuclease free water 70 μl를 넣은 후, DNase I 반응 버퍼 10 μl를 추가합니다.</li>
	<li>반응액에 DNase I 2 μl를 추가합니다.</li>
	<li>드라이 에어 인큐베이터에서 37 °C로 15분 동안 배양합니다.</li>
</ol>
3. 캡핑 및 비캡핑 RNA의 컬럼 정제
<ol>
	<li>제조사의 지침에 따라 MEGAclearKit를 사용하여 캡핑 및 비캡핑 RNA를 정제합니다(모든 스핀 컬럼 기반 RNA 정제 키트를 사용할 수 있습니다).</li>
	<li>NanoDrop 분광광도계를 사용하여 RNA 양을 측정합니다.</li>
	<li>제조사의 지침에 따라 Agilent RNA 6000 Nano Kit 및 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA 시료의 품질을 평가합니다.</li>
</ol>
4. Vaccinia Capping System을 이용한 RNA 캡핑
<ol>
	<li>정제된 uncapped GLuc mRNA 10 μg을 취합니다.</li>
</ol>
표준 캡핑 반응으로는 최대 10 μg(100nt 이상)의 RNA를 캡핑할 수 있습니다. 더 많은 양의 RNA를 캡핑해야 하는 경우, 그에 맞춰 반응 규모를 확대할 수 있습니다.
<ol start="2">
	<li>nuclease free water를 사용하여 부피를 15 μl로 늘립니다.</li>
	<li>2차 구조를 제거하기 위해 RNA를 65 °C에서 10분 동안 가열합니다. 그 후 얼음 위에 5분 동안 둡니다.</li>
	<li>capping 반응을 준비하기 위해, 15 μl의 변성된 RNA에 2 μl 10X Capping Buffer, 1 μl GTP (10 mM), 1 μl 새로 희석한 S-adenosyl methionine (2 mM), 그리고 1 μl (10 units) Vaccinia capping enzyme을 첨가합니다.</li>
	<li>부드럽게 vortexing하여 잘 섞은 후, 건식 공기 배양기(dry air incubator)에서 37 °C로 30분 동안 반응을 진행합니다.</li>
</ol>
5. 캡핑된 RNA의 컬럼 정제
<ol>
	<li>MEGAclear Kit를 사용하여 캡핑된 RNA를 정제하십시오(스핀 컬럼 기반의 모든 RNA 정제 키트를 사용할 수 있습니다).</li>
	<li>제조사의 지침에 따라, Agilent RNA 6000 Nano Kit와 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA 샘플의 품질을 평가하십시오.</li>
</ol>
6. TransIT mRNA Transfection Kit를 이용한 HeLa 세포 트랜스펙션
<ol>
	<li>10% fetal bovine serum가 첨가된 150 μl Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose를 사용하여 HeLa 세포를 48-well plate에 분주한다(0.7-2.3 × 105 cells/well).</li>
	<li>세포의 합쳐짐(confluency)이 60-90%가 되도록 37 °C에서 16-24시간 동안 배양한다.</li>
	<li>GLuc (capped 및 uncapped)와 CLuc RNA를 100 ng/μl 농도로 희석한다.</li>
</ol>
각 형질전환은 8회 반복으로 수행합니다.
<ol start="4">
	<li>Eppendorf 튜브 8개를 준비합니다. 튜브. 각 튜브에 다음을 첨가한다. 1 μl 캡이 없는 GLuc RNA, 1 μl 캡핑된 CLuc RNA(정규화를 위해) 및 25 μl 무혈청 DMEM의. 잘 혼합한다.</li>
	<li>8개의 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)를 준비합니다. 각 튜브에 다음을 첨가합니다. 1 μl 캡핑된 GLuc RNA (캡 유사체), 1 μl 캡핑된 CLuc RNA (정규화를 위해) 및 25 μl 무혈청 DMEM을 사용하여 잘 혼합합니다.</li>
	<li>8개의 에펜도르프 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 다음을 추가합니다. 1 μl 캡핑된 GLuc RNA (백시니아), 1 μl 캡핑된 CLuc RNA(정규화를 위해) 및 25 μl 무혈청 DMEM을 사용하여 잘 혼합한다.</li>
	<li>추가하십시오 0.2 μl 첫 번째 8개 튜브 세트에 mRNA Boost Reagent를 넣고 혼합합니다.</li>
	<li>추가하십시오 0.2 μl 번역첫 번째 8개 튜브 세트에 mRNA 시약을 넣고 혼합합니다.</li>
	<li>실온에서 2~5분 동안 배양하십시오. (5분 이상 배양하지 마십시오).</li>
	<li>HeLa 세포 배양액이 들어 있는 웰에 형질전환 혼합물을 한 방울씩 추가하십시오(참조 그림 3 (플레이트 설정을 위해).</li>
	<li>2번 샘플을 사용하여 7단계부터 10단계를 반복하십시오.nd 및 3rd 8개 튜브 세트.</li>
	<li>다음 온도에서 하룻밤(16시간) 동안 배양하십시오. 37 °C 5% CO 내에서2.</li>
</ol>
7. Gaussia Luciferase (GLuc) 분석
BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit를 사용하여 다음과 같이 각 웰의 상층액에서 GLuc 활성을 측정합니다:
<ol>
	<li>BioLux GLuc Assay Buffer 1.5 ml에 BioLux GLuc Substrate 15 μl를 첨가하여 신선한 분석 용액을 준비합니다(샘플당 50 μl의 분석 용액 필요). 샘플 분석 및 루미노미터 인젝터 프라이밍에 충분한 양을 준비하십시오(제조사 지침 참조).</li>
	<li>튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞어줍니다(볼텍싱 금지).</li>
</ol>
발광은 Berthold Technologies의 Centro LB 960 마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 측정합니다.
<ol start="3">
	<li>루미노미터의 주입 부피를 50 μl로, 적분 시간을 2-10초로 설정합니다.</li>
	<li>각 웰의 세포 배양 상등액 10 μl를 96-웰 블랙 플레이트에 넣습니다.</li>
	<li>인젝터를 분석 용액으로 프라이밍한 후 발광 측정을 진행합니다.</li>
	<li>형질전환되지 않은 웰에서 얻은 값은 음성 대조군으로 사용합니다.</li>
</ol>
8. Cypridina 루시페라아제 (CLuc) 분석법
BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit를 사용하여 다음과 같이 각 웰의 상층액에 대한 CLuc 활성을 측정하십시오.
<ol>
	<li>키트 매뉴얼에 기재된 지침에 따라 신선한 재구성 기질(100x)을 준비합니다.</li>
	<li>BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer를 해동하고 잘 섞습니다(빛으로부터 보호하십시오).</li>
	<li>CLuc 분석 용액을 준비하려면, BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer 1.5 ml에 재구성 기질(100x) 15 μl를 추가합니다(시료당 50 μl의 분석 용액이 필요합니다). 시료 분석 및 루미노미터 인젝터 프라이밍에 충분한 양을 준비하십시오(제조업체 지침 참조).</li>
	<li>튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞습니다(볼텍싱하지 마십시오).</li>
	<li>용액을 상온에서 30분 동안 유지합니다(빛으로부터 보호하십시오).</li>
</ol>
발광은 Berthold Technologies의 Centro LB 960 마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 측정합니다.
<ol start="6">
	<li>루미노미터를 주입량 50 μl, 지연 시간 1-2초, 통합 시간 2-10초로 설정합니다.</li>
	<li>각 웰의 세포 배양 상청액 10 μl를 96-웰 블랙 플레이트에 넣습니다.</li>
	<li>인젝터를 CLuc 분석 용액으로 프라이밍한 후 발광도를 측정합니다.</li>
	<li>트랜스펙션을 하지 않은 웰에서 얻은 값은 음성 대조군으로 사용됩니다.</li>
</ol>
9. 대표 결과
T7 High Yield RNA Synthesis Kit를 사용하면 20 μl 반응당 최대 180 μg의 uncapped RNA와 40~50 μg의 capped RNA를 생산할 수 있습니다. Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석했을 때, 품질이 좋고 손상되지 않은 RNA는 RNA 전사체를 나타내는 단일하고 날카로운 피크를 보여야 합니다. 넓은 피크나 여러 개의 피크가 나타나는 것은 RNA 분해를 의미합니다. 또한 RNA의 크기를 확인하는 것이 중요합니다. 예상보다 긴 길이의 RNA 전사체가 생성되었다면 이는 템플릿 플라스미드 DNA의 불완전한 소화로 인한 것일 수 있습니다. RNA 분해 및 수율 저하는 보통 템플릿 DNA로부터 반응액으로 유입된 오염 물질로 인해 발생합니다. 그림 2는 고품질의 손상되지 않은 RNA를 Bioanalyzer로 분석하여 얻은 전기영동도와 젤 이미지의 예시입니다.
Capped 및 uncapped GLuc RNA를 모두 HeLa 세포에 transfection한 후, 배양하고 세포 배양 상층액의 luciferase 활성을 측정합니다. 5' cap 구조는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 분해로부터 RNA를 보호하고8 mRNA의 번역 개시를 촉진하는 데9 중요합니다. 따라서 RNA capping은 transfection 실험에서 필수적인 단계입니다. 공동 전사(cap analog) 방법으로는 약 80%가 capping된 40 μg의 RNA를 얻을 수 있습니다. Vaccinia capping enzyme을 이용한 프로토콜은 반응당 최대 10 μg의 RNA(100 nt 이상)를 거의 100%의 효율로 capping합니다.
그림 4는 캡핑된 RNA 샘플과 캡핑되지 않은 RNA 샘플을 형질전환시킨 배양물 간의 루시퍼레이즈 발현 차이를 보여줍니다. 캡핑된 RNA를 형질전환시킨 세포 배양물이 캡핑되지 않은 RNA를 형질전환시킨 배양물(루시퍼레이즈 활성이 나타나지 않음)에 비해 훨씬 더 높은 루시퍼레이즈 발현을 보임을 명확히 확인할 수 있습니다. 또한, 그림 4는 캡 유사체(cap analog) 사용과 Vaccinia 캡핑 효소 사용이라는 두 가지 캡핑 기술 모두 단백질로 번역될 수 있는 기능적인 캡핑 RNA 전사체를 성공적으로 생성함을 입증합니다. t-검정으로 얻은 양측 p-값은 0.2583으로, 이는 두 가지 캡핑 방법의 발광 데이터 사이에 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 나타냅니다.
<img alt="T7 전사 도식; DNA 템플릿, RNA 전사체; 뉴클레오타이드 서열 과정." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1.">
그림 1A. T7 RNA 중합효소에 의한 RNA 합성
 
<img alt="pCMV-GLuc의 플라스미드 맵 다이어그램, 5764 bp; 유전자 발현, 클로닝 벡터, 제한 효소 부위." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 2."> 
그림 1B. GLuc 유전자와 T7 프로모터를 포함하는 pCMV-GLuc 벡터.
 
<img alt="RNA 크로마토그래피 결과; 캡이 없는 RNA와 캡이 있는 RNA 분석; 전기영동 차트." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 2."> 
그림 2. 캡이 있는 RNA와 캡이 없는 RNA의 Bioanalyzer 전기영동도 및 젤 이미지. X축은 뉴클레오타이드(nt) 단위의 RNA 크기이며, Y축은 형광 단위(FU)를 나타냅니다. A) 정제 후 GLuc mRNA(캡 없음)의 전기영동도. B) GLuc mRNA(Vaccinia 캡핑 효소를 사용하여 캡 처리됨)의 전기영동도. C) GLuc mRNA(캡 유사체를 사용하여 공동 전사 방식으로 캡 처리됨)의 전기영동도. D) Bioanalyzer로 생성된 젤 형태의 이미지. 'L' 레인은 RNA 래더이며, 레인 1은 캡이 없는 GLuc mRNA, 레인 2는 캡 유사체를 사용하여 캡 처리된 GLuc mRNA, 레인 3은 Vaccinia 캡핑 효소를 사용하여 캡 처리된 GLuc RNA입니다.
 
<img alt="유전자 발현 실험을 위한 플레이트 배치도; 샘플 유형: uncapped/capped GLuc 및 CLuc." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 3."> 
그림 3. HeLa 세포 transfection을 위한 플레이트 설정 예시. 각 웰에는 60-90% 밀도로 배양된 HeLa 세포가 포함되어 있습니다. 적절한 GLuc RNA(uncapped, cap analog로 capping된 것 또는 Vaccinia capping enzyme으로 capping된 것), capped CLuc RNA(정규화를 위함), mRNA Boost Reagent 및 TransIT mRNA Reagent로 구성된 transfection 혼합물을 각 웰에 첨가합니다. 각 transfection은 8회 반복 수행됩니다(그림에서 동일한 색상의 웰).
 
 
<img alt="정규화된 발광량의 막대 그래프; 캡핑된 GLuc RNA와 캡핑되지 않은 GLuc RNA; RNA 분석 결과." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 4."> 
그림 4.HeLa 세포에서의 GLuc 발현. 정제된 캡핑 및 비캡핑 GLuc mRNA를 HeLa 세포에 트랜스펙션하고 37 °C에서 하룻밤(16시간) 동안 배양하였다. 각 웰의 세포 배양 상층액에서 GLuc 및 CLuc 활성을 측정하여 발광 값을 기록하였다. GLuc 발광 값은 캡핑된 CLuc RNA의 발광 값으로 정규화하였다.
<img alt="GLuc 발광 비율 공식, 발광 측정, 정규화된 값의 방정식, RLU." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="식 1">
* 정규화 전, GLuc 및 CLuc 값에서 형질전환되지 않은 세포의 발광 값을 뺐습니다.
 
상표
BioLux는 New England Biolabs, Inc.의 상표입니다.
TransIT은 Mirus Bio LLC의 등록 상표입니다.
MEGAclear는 Ambion의 상표입니다.

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모든 저자는 New England Biolabs, Inc.의 직원입니다.

In vitro 전사는 다양한 응용 분야에서 고수율의 RNA를 얻기 위한 유용한 방법입니다. T7 High Yield RNA Synthesis Kit 사용의 주요 장점은 RNA의 고수율을 달성하도록 배합이 최적화되었다는 점입니다. 또한, 키트에 제공된 시약에는 오염된 뉴클레아제가 포함되어 있지 않아 고품질의 온전한 RNA 전사체를 합성할 수 있습니다. 이 키트는 안정성과 유연성이 높게 설계되어 mRNA, 염료 표지 RNA, 고비활성 방사성 표지 프로브 및 캡핑된 RNA 합성에 사용할 수 있습니다. 키트 매뉴얼에는 이러한 각 응용 분야에 필요한 구체적인 프로토콜과 추가 재료 목록이 포함되어 있습니다. 또한 PCR 산물과 합성 DNA 올리고뉴클레오타이드를 전사 템플릿으로 사용하는 방법에 대한 기술 정보가 포함되어 있습니다. 전사 키트는 T7 프로모터를 포함하는 DNA 템플릿만 사용할 수 있다는 점에 유의하십시오.
본 논문에서 설명하는 방법은 Vaccinia capping enzyme을 이용한 전사 후 RNA 캡핑과 RNA 캡 구조 유사체를 이용한 전사 동시 캡핑을 보여줍니다. 우리는 두 방법 모두 형질전환 후 기능적으로 활성화되는 캡핑된 RNA를 합성한다는 것을 확인하였습니다. 5' 캡 구조는 RNA의 안정성과 번역 효율을 향상시키므로, 미세주입11 및 형질전환7 실험에서 중요합니다. 전사 동시 캡핑 방법으로는 약 80%의 캡핑 효율로 40-50 μg의 캡핑된 RNA를 생성합니다. m7G의 3'-하이드록실기가 차단된 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 유사체(ARCA)를 사용하면 캡이 올바른 방향으로 삽입됨을 보장한다는 점이 중요합니다17. 더 많은 양의 RNA를 캡핑하기 위해 두 캡핑 방법의 표준 반응 규모를 확대할 수 있습니다. 그러나 전사 동시 캡핑은 상대적으로 고가인 캡 유사체를 사용하므로, 비용 면에서는 Vaccinia Capping System을 사용하는 것이 더 현실적인 선택일 것입니다. 또한 Vaccinia Capping System은 캡핑 효율이 거의 100%에 달하므로 더 우수한 방법입니다.
위에서 설명한 RNA 캡핑 방법들은 5' 말단에 cap 0 구조를 가진 RNA를 합성합니다. Cap 1 구조는 RNA의 5' 말단에 있는 첫 번째 뉴클레오타이드 리보스 당의 2'-O 위치에 추가적인 메틸화가 포함됩니다. Cap 1 구조는 RNA 번역 효율을 높이는 것으로 보고되었으며18, 2'-O-Methyltransferase를 사용하여 도입할 수 있습니다20, 21.
본 논문에서 설명하는 방법은 원하는 모든 mRNA를 전사, 캡핑 및 형질전환하는 데 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 여러 장점이 있는 루시퍼라제 GLuc와 CLuc를 구체적으로 사용하였습니다. 이들은 세포 배지로 직접 분비되므로 세포 용해 과정이 필요하지 않습니다. 또한, 높은 생물 발광 신호 강도를 생성하며, 활성 분석법이 매우 민감하고 수행하기 쉽습니다. 세포 내 GLuc 발현은 RNA 자체의 기능성 외에도 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다. 이에 대한 예로 피펫팅 오류, 웰당 세포 수의 차이, 형질전환 효율 등이 있습니다. 이러한 요인들을 보정하기 위해 데이터 정규화가 사용됩니다. 본 프로토콜에서는 GLuc RNA와 함께 내부 대조군으로 CLuc RNA를 공동 형질전환합니다. GLuc 발광 값을 CLuc 대조군 값으로 나누면, 형질전환 시 발생하는 오류와 변동성에 대해 정규화됩니다19.

<table><tbody><tr><td>T7 고수율 RNA 합성 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G RNA 캡 구조 아날로그</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Capping 시스템</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT mRNA 형질전환 키트</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* 클래식 액체 배지: Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium, High Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 비필수 아미노산</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; 루시퍼레이스 분석 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; 루시퍼레이스 분석 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제, 마우스 유래</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제, 인간 태반 유래</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc 대조군 플라스미드</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

hela 세포 transfection 얹는 gaussia의 루시페라제의 mrna의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro 전사는 해당 프로모터 서열(T7, T3, SP6)과 전사될 유전자를 포함하는 선형 DNA 템플릿으로부터 RNA 중합효소에 의해 RNA 전사체가 합성되는 과정입니다(그림 1A). 전형적인 전사 반응은 템플릿 DNA, RNA 중합효소, 리보뉴클레오타이드 삼인산, RNase 억제제 및 Mg2+ 이온이 포함된 완충액으로 구성됩니다.
다양한 응용 분야를 위해 다량의 고품질 RNA가 요구되는 경우가 많습니다. in vitro 전사는 스플라이싱과 같은 RNA 구조 및 기능 연구1, 포유류 세포 내 RNAi 실험2, "Eberwine method"를 이용한 안티센스 RNA 증폭3, 마이크로어레이 분석4 및 RNA 백신 연구5에 사용된다고 보고되었습니다. 이 기술은 방사성 표지 및 염료 표지 프로브를 제작하는 데에도 사용될 수 있습니다6. 최근 Warren et al.은 in vitro 전사된 캡핑 RNA(capped RNA)를 트랜스펙션하여 인간 세포를 리프로그래밍하는 방법을 보고했습니다7. New England Biolabs의 T7 High Yield RNA Synthesis Kit는 20 μl 반응당 최대 180 μg의 RNA를 합성할 수 있도록 설계되었습니다. 이 키트를 사용하여 최대 10kb 길이의 RNA를 성공적으로 전사했습니다. 선형화된 플라스미드 DNA, PCR 산물 및 합성 DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사할 유전자 상위에 T7 프로모터 서열이 있는 한 전사 템플릿으로 사용할 수 있습니다.
RNA의 5' 말단에 캡 구조를 추가하는 것은 진핵생물에서 중요한 과정입니다. 이는 RNA 안정성8, 효율적인 번역9, 핵 수송10 및 스플라이싱11에 필수적입니다. 이 과정은 RNA의 5' 삼인산 말단에 7-메틸구아노신 캡을 추가하는 것을 포함합니다. RNA 캡핑은 캡핑 효소를 사용하여 전사 후(post-transcriptionally)에 수행하거나, 캡 유사체를 사용하여 전사 동시(co-transcriptionally)에 수행할 수 있습니다. 효소 방법에서는 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소12,13를 사용하여 mRNA를 캡핑합니다. 이 효소는 GTP와 S-아데노실 메티오닌을 공여체로 사용하여 RNA의 5' 말단에 7-메틸구아노신 캡을 추가합니다(cap 0 구조). 두 방법 모두 트랜스펙션이나, 역유전학 시스템을 위한 바이러스 게놈 RNA 생성15 및 eIF4E와 같은 캡 결합 단백질의 결정학적 연구16와 같은 기타 응용 분야14에 적합한 기능적으로 활성된 캡핑 RNA를 생성합니다.
아래 설명된 방법에서는 NEB의 T7 High Yield RNA Synthesis Kit를 사용하여 캡핑 및 비캡핑 처리된 Gaussia luciferase (GLuc) 및 Cypridina luciferase (CLuc) RNA 전사체를 합성합니다. 비캡핑 GLuc RNA의 일부는 Vaccinia Capping System (NEB)을 사용하여 캡핑합니다. GLuc 또는 CLuc 유전자와 T7 프로모터를 포함하는 선형화된 플라스미드를 템플릿 DNA로 사용합니다. 전사된 RNA를 HeLa 세포에 트랜스펙션하고, 세포 배양 상청액의 루시퍼라제 활성을 측정합니다. 캡핑된 CLuc RNA는 GLuc 발현을 정규화하기 위한 내부 대조군으로 사용됩니다.

Gaussia 루시페라아제 (GLuc) 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드로부터 캡핑 및 비캡핑 mRNA를 모두 고수율로 in vitro 합성하는 방법을 설명합니다. 합성된 RNA를 정제하고, 비캡핑 RNA의 일부를 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 효소적으로 캡핑합니다. 마지막 단계로, mRNA를 HeLa 세포에 형질전환하고 세포 배양 상청액의 루시페라아제 활성을 측정합니다.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

시험관 내 전사(In vitro transcription)는 상응하는 프로모터 서열을 포함하는 선형 DNA 템플릿으로부터 RNA 중합효소에 의해 RNA 전사체를 합성하는 과정입니다...

본 절차의 전반적인 목적은 capped 및 uncapped mRNA 형태의 gal luciferase 전사체를 hela 세포에 형질전환(transfection)하고, 세포 배양물에서 luciferase 활성을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 T seven high yield RNA synthesis kit를 사용하여 in vitro transcription을 통해 uncapped 및 capped mRNA 형태의 Gaia luciferase 전사체를 합성함으로써 수행됩니다. mRNA를 캡핑(capping)하는 두 가지 방법이 제시됩니다.하나는 전사 과정에서 캡 유사체(cap analog)를 사용하고, 다른 하나는 전사 후 캡핑을 위해 vaccinia capping enzyme을 사용합니다. 다음 단계는 캡핑된 mRNA 전사체와 캡핑되지 않은 mRNA 전사체를 heli 세포에 형질전환하는 것입니다. 최종적으로, 캡핑되지 않았거나 캡핑된 mRNA로 인해 발생하는 루시퍼레이스 활성을 heli 세포 배양 상청액에서 비교합니다.사용자가 직접 전사 반응을 설정하는 것보다 이 방법이 갖는 주요 장점은 T7 high yield RNA synthesis kit가 높은 수율, 그리고 더 중요한 고품질의 전체 길이 RNA 전사체를 생성하도록 테스트 및 최적화되었다는 점입니다. 이는 성공적인 RNA 번역과 기능적으로 활성된 단백질의 발현에 매우 중요합니다. 따라서 이 방법은 RNA transfection에 대한 통찰을 제공하며, in vitro에서 전사된 RNA는 미세주입, 마이크로어레이 분석, 하이브리드화 기반 블롯, 그리고 RNA 구조 및 기능 연구와 같은 다른 응용 분야에도 사용될 수 있습니다.본 예시 반응을 위한 DNA 템플릿은 Gaussian luciferase 또는 gluc 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드입니다. T7 프로모터를 사용하여 캡핑된 생성물과 캡핑되지 않은 생성물을 모두 합성할 수 있습니다. T7 high yield RNA synthesis kit의 구성 성분들을 해동하여 얼음 위에 보관하는 것으로 시작하십시오.RNA 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하고 실험대 표면, 피펫 및 기타 재료를 철저히 세척하십시오. 캡이 없는 RNA를 합성하려면 nuclease-free 피펫 팁, 튜브 및 유리 기구를 사용하는 것이 강력히 권장됩니다. 실온에서 10 x buffer와 물을 먼저 넣고, 이어서 뉴클레오타이드, DNA 템플릿, 마지막으로 polymerase mix 순으로 반응액을 준비하십시오.캡(capped) RNA를 합성하려면 시약 첨가 순서가 중요합니다. 캡 유사체(cap analog)를 사용하여 유사한 반응 혼합물을 만들되, 캡 유사체 뉴클레오타이드를 첨가하십시오. 표준 뉴클레오타이드를 첨가한 후, 부드럽게 볼텍싱(vortexing)하여 반응 성분을 혼합하고, 펄스 스핀(pulse spin)한 다음 건식 공기 배양기에서 37 °C로 2시간 동안 반응물을 배양하십시오. 내부 대조군 설정을 위해 선형화된 플라스미드로부터 c Luke의 캡 전사물을 합성하는 두 번째 반응을 준비하십시오. C Luke 발현은 gluc 발현을 정규화하는 데 사용됩니다.배양 후, 각 반응 혼합물에서 DNA 템플릿을 제거합니다. nuclease free water 70 µL를 추가하고, 이어서 DNAs 10, reaction buffer 1, 그리고 DNAs 2 µL를 추가합니다. DNAs가 37 °C의 건식 공기 배양기에서 15분 동안 반응하도록 둡니다.이제 스핀 컬럼 기반의 RNA 정제 키트를 사용하여 반응물을 정제하고, NanoDrop TM 분광광도계를 사용하여 RNA 양을 정량합니다. 마지막으로 Agilent RNA 6, 000 nano Kit와 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. 표준 캡핑 반응을 위해, 정제된 uncapped gluc mRNA 10 micrograms를 nuclease free water 15 microliters에 희석하여 준비합니다.이 과정은 필요에 따라 규모를 확대할 수 있습니다. RNA를 65 °C에서 10분 동안 가열하여 2차 구조를 해체한 후, 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 캡핑 반응을 준비하려면, 캡핑 버퍼, GTP, 새로 희석한 S-adenosyl-L-methionine 및 vaccinia capping enzyme을 변성된 RNA에 첨가합니다. 반응 성분을 가볍게 볼텍싱하고 짧게 원심 분리한 후, 건식 공기 배양기에서 37 °C로 30분 동안 반응을 배양합니다.배양 후, 이전 섹션의 마지막 단계에서 수행한 것과 동일하게 RNA를 정제하고 분석하십시오. 먼저 HeLa 세포를 플레이팅하는 것으로 시작합니다. 48-웰 플레이트의 28개 웰에 각 웰당 70~230,000개의 세포와 10% serum이 첨가된 high glucose DMEM 150 microliters를 분주합니다.세포가 60~90% 합류(confluent)될 때까지 플레이트를 37 °C에서 배양하며, 이는 보통 16~24시간이 소요됩니다. 세포 준비가 완료되면 형질전환 혼합물을 준비합니다. RNA를 100 ng/µL 농도로 희석합니다.그런 다음 세 가지 서로 다른 반응을 위해 24개의 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 8개의 튜브에 각각 8회씩 중복하여 분주합니다. 정규화를 위해 캡을 열지 않은 gluc RNA 1 µL, 캡을 닫은 cluke RNA 1 µL, 그리고 무혈청 배지 25 µL를 첨가합니다.다음 8개의 튜브에 DMEM을 피펫으로 잘 섞어줍니다. 동일한 반응 조건을 설정하되, 마지막 8개의 튜브에는 캡이 없는 gluc RNA 대신 캡 아날로그(cap analog)를 사용하여 준비한 캡이 있는 gluc RNA를 첨가합니다. 캡 아날로그를 사용하여 준비한 gluc RNA 대신, 이제 첫 번째 8개 튜브 세트에 백시니아(vaccinia) 반응에서 얻은 캡이 있는 gluc RNA를 첨가하고, 캡이 없는 gluc RNA와 함께 0.2 µL의 mRNA boost 시약을 혼합한 후, 다시 0.2 µL를 섞어줍니다.Transit mRNA 시약을 사용하여 반응이 실온에서 5분 이상 지속되지 않도록 합니다. 반응 시작 2분 후, 각 혼합물을 배양된 세포가 들어 있는 웰에 한 방울씩 옮기기 시작합니다. vaccinia 반응에서 얻은 cap, analog cap gluc, RNA 및 capped gluc RNA가 포함된 다음 두 세트의 튜브에 대해서도 이 단계를 반복합니다.4개의 웰을 음성 대조군으로 남겨두고, 37 °C, 5% carbon dioxide 배양 조건에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. Gluc 분석을 위해 Biox GIA Luciferase 분석 키트를 사용하여 앞서 언급한 과정을 수행합니다. Biox gluc 분석 버퍼 1.5 mL에 biox gluc 기질 15 µL를 첨가하여 신선한 분석 용액을 준비합니다.최종 혼합물을 볼텍싱하지 마십시오. CLU 분석을 위해 튜브를 뒤집어 섞어줍니다. 100x 새로 재구성된 기질을 준비하십시오.그런 다음, 재구성된 기질 15 µL를 Blu Ciena 루시퍼레이스 분석 버퍼 1.5 mL에 첨가하여 분석 용액을 만듭니다. C Luke 분석 용액을 볼텍싱 없이 혼합하고, 빛이 차단된 상온에서 30분 동안 배양합니다. 분석 용액 준비가 완료되었습니다.마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 세포의 발광을 측정합니다. 루미노미터가 2~10초 동안 50 µL의 분석 용액을 주입하도록 설정하십시오. 그다음, 각 세포 배양 상층액 10 µL를 96-웰 블랙 플레이트의 웰로 옮깁니다.인젝터를 분석 용액으로 프라이밍한 후 발광도를 측정합니다. T seven high yield RNA synthesis kit를 사용하면 Agilent 2100 bioanalyzer 분석 시 20 µL 반응당 최대 180 µg의 uncapped RNA와 40~50 µg의 capped RNA를 생산할 수 있습니다. 양질의 온전한 상태입니다.RNA는 RNA 전사체를 나타내는 하나의 날카로운 피크를 보여야 합니다. 넓은 피크나 여러 개의 피크가 나타나면 RNA 분해를 의미합니다. 또한 RNA의 크기를 확인하는 것이 중요합니다.예상보다 더 긴 전사체는 템플릿 Plasmid의 불완전한 제한효소 절단으로 인해 발생할 수 있으며, DNA-RNA 분해 및 낮은 수율은 일반적으로 템플릿에서 반응액으로 유입된 오염 물질로 인해 발생합니다. DNA transfection 후 인큐베이션을 거쳐 루시퍼레이스(luciferase) 활성을 분석하였습니다. 5' 캡 구조는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 분해로부터 RNA를 보호하고 번역 개시를 촉진하는 데 중요합니다.따라서 RNA capping은 transfection 실험에서 필수적인 단계입니다. capped transcript와 uncapped transcript를 transfection한 세포 배양물 간의 측정된 발광도 차이가 이를 명확히 뒷받침하며, 이는 cap analog를 사용하는 방법과 vaccinia capping enzyme을 사용하는 방법 모두 기능적인 capped RNA transcript를 성공적으로 생성함을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 transfection 및 기타 다양한 응용 분야에 사용할 고품질의 capped RNA transcript를 합성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vitro-transcription-capping-gaussia-luciferase-mrna-followed-hela

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연구

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시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

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라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

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여기서는 해상 추출액을 준비하고 초파리 배아를 이용한 시험관 내 번역 방법에 대해 자세히 설명합니다.

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HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

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