Voorbereiding van de myeloïde suppressor cellen (MDSC) van naïeve en pancreas tumor-dragende muizen met behulp van flowcytometrie en geautomatiseerde Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit is een snelle en uitgebreide methode van immunofenotypering myeloïde suppressor cellen (MDSC) en het verrijken van Gr-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC zijn een heterogene populatie van onvolwassen macrofagen, dendritische cellen en granulocyten die zich ophopen in de lymfoïde organen in pathologische aandoeningen, waaronder parasitaire infectie, ontsteking, traumatische stress, graft-versus-host-en vaatziekten, diabetes en kanker 1-7. Bij muizen, MDSC express Mac-1 (CD11b) en Gr-1 (Ly6G en Ly6C) oppervlakte-antigenen 7. Het is belangrijk op te merken dat MDSC goed worden bestudeerd in verschillende tumor-dragende hosts waar ze aanzienlijk worden uitgebreid en anti-tumor immuunrespons ten opzichte van naïeve collega's 7-10 te onderdrukken. Afhankelijk van de pathologische aandoening er verschillende subpopulaties MDSC met verschillende mechanismen en doelen van onderdrukking 11,12. Doeltreffende methoden levensvatbare MDSC populaties isoleren belangrijk in het ophelderen van de moleculaire mechanismen van onderdrukking in vitro en in vivo.

Onlangs heeft de Ghansah groep heeft gemeld de uitbreiding van MDSC in een muizen alvleesklierkanker model. Onze tumor-dragende MDSC tonen een verlies van homeostase en een verhoogde onderdrukkende functie in vergelijking met naïeve MDSC 13. MDSC percentages zijn beduidend minder in de lymfoïde compartimenten van naïeve versus tumor-dragende muizen. Dit is een belangrijke voorbehoud dat vaak belemmert nauwkeurige analyse van deze vergelijkende MDSC. Daarom is het verrijken van Gr-1 + leukocyten van naïeve muizen voorafgaand aan Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) verhoogt de zuiverheid, de levensvatbaarheid en vermindert de soort tijd. Echter, verrijking van Gr-1 + leukocyten van tumor-dragende muizen is optioneel, omdat deze zijn er in overvloed voor een snelle FACS sorteren. Daarom is in dit protocol beschrijven we een zeer efficiënte methode voor het immunofenotypering MDSC en verrijkende Gr-1 + leukocyten van de milt van naïeve muizen voor het sorteren van MDSC tijdig. Immunocompetente C57BL / 6 muizen worden geënt met muizen Panc02 ceLLS subcutaan dat de naïeve muizen te ontvangen 1XPBS. Ongeveer 30 dagen na inoculatie; milt worden geoogst en verwerkt tot een cel suspensies behulp van een mobiele dissociatie zeef. Splenocyten worden dan rode bloedcellen (RBC) gelyseerd en een hoeveelheid van deze witte bloedcellen worden gekleurd met behulp van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen Mac-1 en Gr-1 tot immunofenotype MDSC percentages met behulp van flowcytometrie. In een parallel experiment worden hele leukocyten van naïeve muizen gekleurd met fluorescent geconjugeerde Gr-1 antilichamen, geïncubeerd met PE-microbolletjes en positief geselecteerde gebruikmaking van een automatische magnetische geactiveerde celsortering (autoMACS) Pro Separator. Vervolgens wordt een hoeveelheid van Gr-1 + leukocyten gekleurd met Mac-1-antilichamen aan de toename van MDSC percentages met behulp van flowcytometrie te identificeren. Nu deze Gr1 + verrijkte leukocyten klaar voor het sorteren van FACS MDSC worden gebruikt in vergelijkend analyses (naïeve tegen tumor-dragende) in in vivo en in vitro

Protocol

Voorafgaand aan het starten, de voorbereiding van de volgende oplossingen:

3% kleuring Media (SM):

-3% Foetaal runderserum (FBS) in 1X fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 0,5% runderserum albumine van (BSA) in 1XPBS

1. Oogsten milt van muizen

  1. Subcutaan injecteren 6-8 weken oud C57BL / 6 muizen (Harlan) met 1,5 x 10 5 muizen Panc02 cellen gesuspendeerd in 100 ul 1x PBS (tumor-dragende, TB). Controle muizen (Naïve) ontvangt 100 ul 1XPBS.
  2. Ongeveer 4 weken na de injectie, euthanaseren muizen door kooldioxide stikken.
  3. Oogsten milt van muizen door stompe dissectie behulp van een tang en schaar weeg met behulp van een balans. Plaats milt in aparte, gelabeld 50 ml conische buizen met 1 x PBS.

2. Genereer een Single-cell Suspension leukocyten van Milten

Alle procedures dienen te worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een Biologische Veiligheid Hood en cellen en antilichamen bewaard op ijs.

  1. Monteren van de cel dissociatie zeef door toevoeging van de gaas in de opening van de kop naar beneden. Plaats vervolgens de borgring in de schroefdraad gebied met de gleuf naar boven en gebruik de ring om de borgring vast, dus houdt het scherm op zijn plaats. Plaats de gemonteerde zeef in een petrischaal met 10 ml 1 x PBS.
  2. Pool milt en gebruik glas stamper om milten malen tegen gaas van de cel dissociatie zeef en de petrischaal. Herhaal dit voor elke behandeling groep van muizen.
  3. Filter celsuspensie in een 50 ml conische buis met een 70 urn zeef cel en 5 ml serologische pipet. Centrifugeer bij 12.000 rpm (250-300 xg) gedurende 5 minuten.
  4. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml 1 x RBC lysis buffer per milt. Pipet op en neer krachtig. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Stop de reactie door toevoeging van 20 ml 1 x PBS. Pipet op en neer krachtig. Centrifugeer bij 12.000 rpm (250-300 xg) gedurende 5 minuten.
  5. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 20 ml steriel 1 x PBS. Pipet op en neer krachtig.
  6. Tellen cellen met trypanblauw en hemacytometer en hersuspenderen van gewenste concentratie van 3% SM zodat 50 pi is gelijk aan 5x10 1x10 5 6 cellen (1x10 7 cellen / ml - 2x10 7 cellen / ml).

3. Cel-oppervlakte-kleuring / immunofenotypering van MDSC met behulp van flowcytometrie

  1. Label de wells van een 96-well V bodemplaat voor de controle en experimentele monsters en enkele vlekken voor compensatie voordelen (geen Beits, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC en DAPI).
  2. Voeg 5x10 1x10 5 6 cellen overeenkomend met 50 ul / putje van splenocyten hun respectieve putjes in de 96-well V-bodemplaat. Centrifugeerplaat bij 12.000 rpm (250-300 xg) gedurende 5 minuten.
  3. Bereid "meester Mix" (MM) van Mouse BD Fc Block (Rat anti-muis CD16/32 monoklonaal antilichaam) verdund in 3% SM, een 1,5 ml microcentrifugebuisje op ijs. Als uitgangspunt gebruikt 1 pg Fc blok in 3% SM een eindvolume van 50 ul per putje.
  4. Verwijder supernatant uit elk putje van de 96-well V-bodemplaat snel omkeren van de plaat over en weer over een afvalhouder of sink zonder onderbreking van de celpellets.
  5. Vortex, kort Fc Blok MM centrifugeren gedurende 5 seconden en 50 ul van alle pellets in de 96-wells V-bodemplaat toe te voegen. Meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren, waardoor monsters in hun putten. Incubeer plaat gedurende 15 minuten in het donker op het ijs. Centrifugeer plaat bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten.
  6. Bereid "meester Mix" (MM) van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen verdund in 3% SM in 1,5 ml microcentrifugebuisje op ijs, terwijl monsters geïncubeerd met Fc blok. Antilichamen dient te worden getitreerdoptimale verdunningen bepalen kleuringen. Als uitgangspunt combineren 1:25 verdunning van Mac-1-FITC en 1:20 verdunning van Gr-1-APC in 3% SM een eindvolume van 50 ul per monster goed.
  7. Voorzichtig supernatant uit elk putje van de 96-well V-bodem zoals eerder beschreven.
  8. Vortex, kort centrifugeren MM van TL-geconjugeerde vlekken antilichamen gedurende 5 seconden en voeg 50 ul om de controle en experimentele pellets. Meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren. Voor enkele vlek compensaties toevoegen 1:25 verdunning van Mac-1-FITC 1:20 verdunning van Gr-1-APC en 75 ng / ml DAPI, in 3% SM een eindvolume van 50 pl per putje hun respectieve putjes. Voeg 50 ul 3% SM goed onbesmet (geen vlekken). Mengen en incuberen cellen in 96-well V-bodemplaat 30 minuten in het donker op ijs.
  9. Label FACS buizen (5 ml, 12 mm x 75 mm polystyreen rondbodem buizen) overeenkomen met elke well in 96-well de V-bodemplaat. Voeg 200 ul 3% SM elk FACSbuis.
  10. Centrifugeer plaat bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten en verwijder supernatanten. Was pellets door toevoeging van 100 pi 3% SM elke pellet en meng goed door voorzichtig en neer te pipetteren. Centrifugeer plaat bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten. Herhaal stap was eens te meer.
  11. Voorzichtig supernatant uit elk putje van de 96-well V-bodem zoals eerder beschreven. Resuspendeer elke pellet in 100 ui 3% SM en meng goed.
  12. Breng 100 pi geresuspendeerde pellet uit elk putje van de 96-well V-bodemplaat met zijn de labels FACS buis.
  13. Voorafgaand aan cytometrie analyse Flow, voeg 75 ng / ml DAPI te controleren en experimentele monsters en DAPI enkele vlek compensatieregeling.
  14. Voer flowcytometrische data-acquisitie van MDSC percentages. Voer vergoeding gebruik van de negatieve (geen vlek controle) en de enkele positieve controles. Stel een dot plot dat de voorwaartse (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) in log-schaal geeft, zodat leukocyten populaties vanbelang kan worden geïdentificeerd. Teken een grote poort op alle leukocyten, met uitzondering van puin en klompen met de laagste naar voren en zijwaartse verstrooiing. Van deze ouder poort, een nieuwe dot plot dat SSC versus DAPI de poort en wordt weergegeven op DAPI-(live) cellen. Selecteer deze nieuwe gated bevolking en een dot plot dat Mac-1 versus Gr-1 en gate wordt weergegeven op uw dubbele positieve (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Magnetische Verrijking van Gr-1 + Leukocyten

  1. Aliquot 1x10 7 resterende ongekleurde leukocyten in het gepaste label FACS en centrifugeer bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten.
  2. Bereid MM van Gr-1-PE antilichaam in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tot 10 7 cellen, gebruik van een 1:10 verdunning van Gr-1-PE antilichaam in 50 pi MB, per monster. Voor een grotere cel aantallen, opschalen volumes dienovereenkomstig. Kort centrifugeren gedurende 5 seconden, toe te voegen aan leukocyten in FACS buizen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker. Voeg 2 ml MB tot FACS buizen, centrifuge bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten en gooi supernatant.
  3. Bereid MM van Anti-PE microbolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor maximaal 10 7 cellen, gebruik maken van een 1:4 verdunning van anti-PE microbolletjes in 200 ul MB, per monster. Voor een grotere cel aantallen, opschalen volumes dienovereenkomstig. Kort centrifugeren gedurende 5 seconden, toe te voegen aan leukocyten in FACS buizen en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker.
  4. Voeg 2 ml MB tot FACS buizen, centrifuge bij 12.000 toeren per minuut (250-300 xg) gedurende 5 minuten en gooi supernatant. Resuspendeer de cellen in 3 ml van SB. Filtreer door een 70 urn zeef in een nieuw, het label 50 ml conische buis.
  5. Bereid en prime Auto MACS Pro Separator. Vul alle flessen met geschikte oplossingen en leeg de resttoner, indien nodig. Zet instrument op en onderzoekt de status van vloeistoftanks en kolom (s) na het initialiseren. Alle symbolen moet groen zijn. Op het menu, selecteer "Scheiding" van de bovenstemenubalk gevolgd door "Now Was 'van de onderste menubalk. Selecteer "spoelen" van het pop-up optie gevolgd door "Run" om het priming proces te starten. Zodra het priming proces is voltooid, zal het instrument weer te geven dat het "klaar voor Scheiding" onder het menu Status.
  6. Kies geschikte gekoelde buis rek voor buisafmetingen en plaats 50 ml conische buis met magnetisch gelabelde cellen in rij A, 50 ml conische buis voor negatieve fractie collectie in rij B en 15 ml conische buis voor positieve fractie collectie in rij C
  7. Kies "POSSEL_S" celscheiding programma voor positieve selectie van gelabelde doelcellen in gevoelige mode van monsters. Magnetisch gelabelde doelcellen worden bewaard op de automaten kolom; ongelabelde cellen vrijkomen in de negatieve fractie verzamelbuis in rij B. Op automatische terugtrekking van de magneet, zal de gelabelde doelcellen worden vrijgegeven in de positieve verzamelbuis in rij C van de buis rek.

+ verrijkte Leukocyten

  1. Recount Gr-1 + en Gr-1 - fracties met behulp van trypanblauw en een hemacytometer. Hersuspenderen cellen gewenste concentratie van 3% kleuring medium dat 50 pi is gelijk aan 5x10 1x10 5 6 cellen (1x10 7 cellen / ml - 2x10 7 cellen / ml) en 50 pi dragen en dienovereenkomstig gekenmerkt FACS buizen.
  2. Bereid een MM Mac-1 alleen op een 1:25 verdunning in 3% SM een eindvolume van 50 pi per monster. Vlek cellen en voor te bereiden enkele vlek vergoedingen van Gr-PE, Mac-1 FITC en DAPI voor flowcytometrie-analyse. Voeg 200 ul 3% SM en DAPI levensvatbaarheid kleurstof zoals eerder beschreven.
  3. Voer flowcytometrische data-acquisitie te Gr-1 + en Gr-1 te bepalen - percentages en ook pre-en post-autoMACS verrijking vergelijken MDSC percentages.

6. Representatieve resultaten

Hier laten we r epresentative resultaten voor autoMACS verrijking van Gr-1 + leukocyten uit gepoold, naïeve milt voor latere FACS sorteren van MDSC (Figuur 1). 1x10 6 naïeve leukocyten werden gekleurd met Mac-1-FITC en Gr-1-APC antistoffen tegen MDSC percentages met behulp van een BD LSRII instrument te identificeren, voorafgaand aan autoMACS sorteren. 1x10 7 naïeve leukocyten werden vervolgens gekleurd met anti-Gr-1-PE antilichamen en PE-microbolletjes voor de verrijking van Gr-1 + leukocyten met behulp van een autoMACS Pro Separator. Post-autoMACS verrijking, Gr-1 percentages in Gr-1 + en Gr-1 - verzameld fracties werden geëvalueerd met behulp van flowcytometrie. 1x10 6 Gr-1 + leukocyten werden verwijderd en gekleurd met Mac-1-FITC antilichaam te analyseren en te vergelijken MDSC percentages van verrijkt, samengevoegd naïef leukocyten aan niet-verrijkte, samengevoegd tumor-dragende leukocyten door middel van flowcytometrie.

fig1.jpg "/>
Figuur 1. AutoMACS verrijking van Naïve Gr-1 + leukocyten voor MDSC FACS sorteren. Milt werden geoogst van de pancreas tumor-dragende en naïeve muizen en verwerkt tot een cel suspensies. Flow cytometrie analyse van naïeve leukocyten oppervlak gekleurd met Mac-1 en Gr-1 TL-geconjugeerde antilichamen, alvorens autoMACS verrijking (A). Flow cytometrie analyse van Gr-1 + (B) en Gr-1 - (C) fracties na autoMACS verrijking van Gr-1 + cellen samengevoegd naïeve leuckocytes gekleurd met Gr-1-PE-antilichamen en anti-PE microbolletjes. Flow cytometrie analyse van MDSC en Gr-1 + percentages na autoMACS verrijking van Gr-1 + cellen van gepoolde naïef leukocyten (D) in vergelijking met niet-verrijkte gepoolde leukocyten van tumor-dragende muizen (E) (naïeve muizen, n = 5 ; tumor-dragende muizen, n = 3). MDSC en Gr-1 percentages zijn gated in de representatieve contour kavels en histogrammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit is een gedetailleerde methode voor de verwerking en immunophentyping MDSC populaties die van toepassing is op verschillende lymfoïde weefsels van verschillende diermodellen. In het bijzonder kan autoMACS verrijking worden gebruikt voor de isolatie van verschillende populaties leukocyten met Gr-1 uitputting van splenocyten 4 zuivering van myeloïde subsets van splenocyten en lymfeknopen 5 isolatie van beenmerg neutrofielen 14 en zuivering van CD8 + T cellen van milt en de lymfeklieren 15. Ongeacht de celpopulatie van belang is de op een celsuspensies van leukocyten van de gewenste lymfoïde weefsels nodig optimale oppervlakte kleuring flowcytometrie analyse autoMACS verrijking en FACS sorteren. In dit protocol gebruikten we mechanische dissociatie op een celsuspensie van leukocyten te maken. Echter, het gebruik enzymdigestie zoals collagenase D is een goed alternatief dit protocol te verhogende opbrengst van leukocyten van milt of andere lymfoïde organen 5.

Flow cytometrie is een belangrijke techniek voor immunofenotypering leukocyten. Daarom passende voorbereiding flowcytometrie verrijking vereist ook het gebruik van geschikte buffers celsuspensie met de verdunning van antilichaam reagentia. Veel protocollen afwisselend FBS en BSA voor het bereiden van het kleuren van media en MACS buffer. Echter, deze reagentia zijn ook commercieel verkrijgbaar van bedrijven zoals eBioscience, BD Pharmingen en Miltenyi Biotec. Zoals door Miltenyi Biotec en eBioscience zowel BSA en FBS voorkomen dat niet-specifieke binding bij kleuring leukocyten met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen. Wat nog belangrijker is, een lage percentages van deze dierlijke serumeiwitten te behouden leefbaarheid en het voorkomen van klonteren van leukocyten 16. Echter, uit onze ervaring, BSA werkt beter voor een optimale kleuring en een betere resolutie voor autoMACS verrijking dan FBS en aanbevelingeningebouwd in een de beschreven protocol.

In dit protocol hebben we gekenmerkt muizen MDSC met behulp van CD11b-FITC en Gr-1-APC TL-geconjugeerde antilichamen en flowcytometrie. Het is noodzakelijk voor titreren deze antilichamen te gebruiken om een ​​hoge achtergrond fluorescentie kleuring verminderen niet-optimale resultaten te voorkomen. Daarnaast is bij het ​​kiezen van antilichamen voor multicolor flowcytometrie-analyse, mogelijke spectrale overlapping van de fluorochromen is ook een andere cruciale factor te worden beschouwd 17,18. Daarom, compensatie regelt in de vorm van enkele kleur vlekken voor elke fluorochome-geconjugeerd antilichaam van belang of compensatie kralen, kan corrigeren voor uitgiften van spectrale overlap 18. Een belangrijke overweging om nauwkeurige flowcytometrie resultaten is het gebruik van kleurstoffen levensvatbaarheid. Dode cellen kunnen niet-specifiek binden van antilichamen, waardoor vals-positieve resultaten 19. In dit protocol gebruiken we het nucleïnezuur vlek, DAPI als levensvatbaarheid kleurstof omuit te sluiten dode cellen van onze analyses als het beste een aanvulling op het paneel van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen gebruikt met een minimale spectrale overlap. Echter kunnen andere kleurstoffen zoals levensvatbaarheid 7 Aminoactinomycin D (7 AAD) en propidiumiodide (PI) worden gebruikt met de beschreven kleuringsmethoden afhankelijk paneel gebruikte antilichamen. Momenteel zijn er een aantal vastzetbaar dode cellen vlekken beschikbaar waarmee gekleurde cellen worden vastgesteld en doorlaatbaar zonder de mogelijkheid levensvatbaarheid (Invitrogen) onderscheiden. Over het algemeen andere vlekken technieken zijn ook belangrijk voor een nauwkeurige flowcytometrie-analyse. Bijvoorbeeld, in dit protocol het gebruik van 96-well V-bodemplaten dat kleine geconcentreerde hoeveelheden cellen en reagentia worden gebruikt voor de analyse van MDSC en leukocyten percentages gebruik van flow cytometrie. Het gebruik van de Master Mix (MM) benadering is ook een belangrijke techniek gelijke immunofluorescentie labeling van leukocyten in kleine hoeveelheden met behulp van 96-V-bodem plAtes of FACS Tubes. Deze technieken verminderen het risico van kruisbesmetting van monsters, onderhouden steriele antilichamen en vermindering van de hoeveelheid reagentia en antilichamen gebruikt.

De autoMACS Pro Separator zorgt voor een efficiënte en geautomatiseerde isolatie van celpopulaties van meerdere monsters, in alle soorten. In dit protocol wordt indirecte magnetische kenmerken van leukocyten met behulp van Gr-1-PE-antilichamen en magnetische PE microbolletjes gebruikt voor autoMACS verrijking van Gr-1 + leukocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor autoMACS scheiding met behulp van microbolletjes naar andere fluorochroom-geconjugeerde, gebiotinyleerd en ongeconjugeerd primaire antilichamen voor de verrijking van verschillende celpopulaties 20. In deze procedure, raden met PE-geconjugeerde antilichamen en anti-PE-microbolletjes tegenover FITC bijvoorbeeld de PE-molecuul wordt gezegd meerdere bindingsplaatsen hebben, hetgeen resulteert in sterker en magnetische kenmerken (Miltenyi Biotec ). Een pOGELIJKE wijziging van dit protocol is het gebruik van directe magnetische etikettering, aangezien er een grote verscheidenheid van MACS microbolletjes voor de isolatie van de mens, muis en rat leukocyten (Miltenyi Biotec). Echter, indirecte magnetische kenmerken met een fluorochroom-geconjugeerde primaire antilichaam maakt flowcytometrie evaluatie van verrijkt of verarmd leukocyt fracties zonder extra kleuring. Er zijn ook tal van MACS Scheidingstekens beschikbaar, maar de autoMACS Pro Separator systeem is voordelig omdat het zorgt voor hoge snelheid, geautomatiseerde sortering van maximaal zes monsters voor een zachte selectie van zeer levensvatbare leukocyten, in vergelijking met handmatige MACS scheidingsvellen. Echter, handleiding MACS Scheidingstekens geschikt zijn alternatieven voor de autoMACS Pro Separator, indien beschikbaar. Om verder te verrijken naïeve Gr-1 + leukocyten, een mogelijke wijziging van dit protocol zou zijn om opnieuw uit te voeren de positief opgevangen fractie wordt met een nieuwe autoMACS kolom aan de autoMACS Pro Separator. Verrijkingvan Gr-1 + tumor-dragende leukocyten met de autoMACS Pro separator afgeraden omdat in dit protocol resulteert in aanzienlijke vermindering van de terugwinning van Gr-1 fracties in deze cellen doorgaans met de kolommen kleven tijdens de aanrijking in naïve opzichte leukocyten . Daarom is dit protocol raadt het bundelen tumor-dragende leukocyten voor latere FACS het sorteren van levensvatbare MDSC.

Pre-verrijkte, samengevoegd naïeve leukocyten en samengevoegd tumor-dragende leukocyten kan voor toekomstige toepassingen zoals lage snelheid FACS sorteren voor de isolatie van MDSC populaties. Dit protocol is speciaal ontworpen om vervelend en tijdige FACS sorteren van MDSC van naïeve muizen, die het gevolg is van aanzienlijk lagere percentages van MDSC te omzeilen. AutoMACS verrijking van Gr-1 + leukocyten van naïeve muizen kunnen dan voor een snelle, gemakkelijke en efficiënte FACS sorteren van haalbare en functionele MDSC voor het gebruik ervan in de in vivo enin vitro experimenten. Direct sorteren van nederige uitgedrukt celpopulaties zoals naïef MDSC is een zeer inefficiënt proces met een lange soort tijden, hoge kosten en verminderde cel herstel en levensvatbaarheid. Voorbereiding en autoMACS verrijking van Gr-1 + leukocyten van naïeve muizen duurt ongeveer 45 minuten en neemt toe MDSC percentages van meer dan 4-voudige (figuur 1). Deze verrijking vermindert de tijd van FACS sorteren van ongeveer 12 uur niet verrijkte leukocyten ongeveer 20-30 minuten voor de isolatie van tenminste 1x10 6 levensvatbaar verrijkt MDSC van samengevoegde naïeve leukocyten. Echter, FACS sorteren van levensvatbare MDSC uit niet-verrijkte, samengevoegde leukocyten van tumor-dragende muizen vergt minder tijd als gevolg van een toegenomen overvloed aan MDSC percentages in reactie op last van de tumor. Het is belangrijk op te merken dat gesorteerde MDSC en leukocyten kan vervolgens worden gebruikt in zowel functioneel assays zoals gemengde leukocyt reacties (MLR) in vivo experimenten adoptieve overdracht 21 en in niet-functionele assays zoals qRT-PCR 22 ​​Western Blot 23 en cytospin / microscopie analyse 14. In het algemeen kan dit protocol worden aangepast voor immunofenotypering en verrijking van immunosuppressieve en leukocyten van lymfoïde weefsels of perifeer bloed van muizen, ratten en mensen te worden toegepast in een veelheid van in vivo en in vitro testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Wij erkennen de USF flowcytometrie Core Facility. We willen graag Dr Denise Cooper bedanken voor het delen van resources. Wij zouden ook graag Maya Cohen, Laura Pendleton en Diana Latour bedanken voor hun hulp bij het opzetten en filmen van deze video. NN ondersteund door NSF FG-LSAMP Brug naar het College voor Promoties Fellowship HRD # 0929435. Dit werk werd gefinancierd door de American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center uitgereikt aan TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics