Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Biology
 

Summary

Een basisprotocol voor het scheiden van DNA-fragmenten met agarose gel elektroforese beschreven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Agarosegelelektroforese de meest effectieve manier te scheiden DNA fragmenten van variërende grootte van 100 bp tot 25 kb 1. Agarose is geïsoleerd van het zeewier geslachten Gelidium en Gracilaria, en bestaat uit herhaalde agarobiose (L-en D-galactose) subeenheden 2. Tijdens gelering, agarose polymeren niet-covalent geassocieerd en een netwerk vormen bundels die poriegrootten bepalen van een gel moleculaire zeven eigenschappen. Het gebruik van agarose gel elektroforese revolutie de scheiding van DNA. Voorafgaand aan de vaststelling van agarose gels, werd DNA in de eerste plaats gescheiden met behulp van sucrose dichtheidsgradiënt centrifugeren, die alleen voorzien in een aanpassing van de grootte. DNA met agarose gel elektroforese scheiden, wordt het DNA geladen prefab putjes in de gel en een stroom toegepast. De fosfaat ruggengraat van het DNA (en RNA) molecuul negatief geladen derhalve, wanneer geplaatst in een elektrisch veld wordt DNA fragmenten migreren naar de positively geladen anode. Omdat DNA heeft een massa / ladingsverhouding worden DNA-moleculen gescheiden op grootte op een agarose gel in een zodanig patroon dat de afstand afgelegd omgekeerd evenredig met de log van het molecuulgewicht 3. De belangrijkste model DNA bewegen door een agarose gel wordt "voorgespannen reptation", waarbij de voorrand voren beweegt en trekt de rest van het molecuul aan 4. De snelheid van migratie van een DNA molecule via een gel wordt bepaald door de volgende: 1) maat van DNA-molecuul; 2) agarose concentratie 3) DNA conformatie 5, 4) toegepaste voltage, 5) de aanwezigheid van ethidiumbromide, 6) type agarose en 7) elektroforese buffer. Na de scheiding kan het DNA moleculen zichtbaar onder UV-licht na kleuring met een geschikte kleurstof. Door het volgen van dit protocol, moet de student in staat zijn om:

  1. Begrijpen mechanisme waardoor DNA fragmenten worden gescheiden in een gelmatrix
  2. Begrijpen hoe conformatie van deDNA-molecuul zal zijn bepalend voor de mobiliteit door middel van een gel matrix
  3. Vaststellen van een agarose-oplossing van geschikte concentratie voor hun behoefte
  4. Bereid een agarose gel elektroforese van DNA
  5. Stel de gel elektroforese apparatuur en voeding
  6. Kies een geschikte spanning voor de scheiding van DNA-fragmenten
  7. Begrijp het mechanisme waarmee ethidiumbromide zorgt voor de visualisatie van DNA-banden
  8. Bepaal de grootte van DNA fragmenten gescheiden

Protocol

1. Bereiding van de gel

  1. Weeg de juiste massa van agarose in een erlenmeyer. Agarose gels worden bereid met een w / v oplossing percentage. De concentratie van agarose in een gel zal afhangen van de grootte van de DNA fragmenten worden gescheiden, met de meeste gels tussen 0,5% -2%. Het volume van de buffer niet groter dan 1/3 van de capaciteit van de kolf.
  2. Voeg loopbuffer de agarose-bevattende kolf. Swirl te mengen. De meest voorkomende gel uitgevoerd buffers TAE (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) en TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA).
  3. Smelt de agarose / buffer mengsel. Dit wordt meestal uitgevoerd door verhitting in een magnetron, maar kan ook via een bunsenvlam. Op 30 s intervallen, verwijder dan de kolf en zwenk de inhoud goed te mengen. Herhaal dit totdat de agarose volledig is opgelost.
  4. Voeg ethidiumbromide (EtBr) tot een concentratie van 0,5 pg / ml. Als alternatief kan de gel worden gekleurd na electrophoresis in lopende buffer die 0,5 ug / ml EtBr 15-30 min, gevolgd door ontkleuren in loopbuffer een gelijke lengte van de tijd.

Let op: EtBr is een verdacht carcinogeen en moet op de juiste wijze te worden van de per instelling regelgeving. Handschoenen moeten altijd gedragen worden bij het werken met gels die EtBr. Alternatieve kleurstoffen voor de kleuring van het DNA zijn beschikbaar, maar EtBr blijft de meest populaire vanwege de gevoeligheid en kosten.

  1. Laat de agarose hetzij op het stationaire of door incubatie afkoelen in een 65 ° C waterbad. Doet u dit niet zal vervormen de gel lade.
  2. Plaats de gel lade in de casting apparaat. Alternatief kan men ook kleef de open randen van een gel lade een mal maken. Een geschikte kam in de gel vorm aan de putjes maken.
  3. Giet de gesmolten agarose in de gel mal. Laat de agarose op te zetten bij kamertemperatuur. Verwijder de kam en plaats de gel in de gel doos. Als alternatief kan de gel kunnen worden verpakt in plastic en bewaard bij 4 ° C tot gebruik (Fig. 1).

2. Het opzetten van Gel Apparatuur en scheiding van DNA-fragmenten

  1. Voeg laden kleurstof aan de DNA-monsters worden gescheiden (fig. 2). Gel laden kleurstof wordt meestal gemaakt op 6X concentratie (0,25% broomfenolblauw, 0,25% xyleen cyanol, 30% glycerol). Loading kleurstof helpt om bij te houden hoe ver je DNA monster is gereisd, en maakt het ook mogelijk het monster weg te zinken in de gel.
  2. Programmeer de voeding aan op de gewenste spanning (1-5V/cm tussen de elektroden).
  3. Voeg genoeg loopbuffer het oppervlak van de gel te dekken. Het is belangrijk om dezelfde buffer uitgevoerd als die welke gebruikt om de gel te bereiden.
  4. Bevestig de draden van de gel doos om de voeding. Schakel de voeding en controleer of zowel de gel box en de voeding werken.
  5. Verwijder het deksel. Langzaamzorgvuldig laden DNA monster (s) in de gel (Fig. 3). Een geschikte DNA-marker grootte moet altijd worden geladen, samen met experimentele monsters.
  6. Plaats het deksel op de gel box. De kathode (zwarte draden) dient het nauwst zijn de putten dan de anode (rode draden). Controleer of de elektroden zijn aangesloten op de juiste sleuven in de voeding.
  7. Schakel de stroom in. Laat de gel totdat de kleurstof is gemigreerd naar een geschikte afstand.

3. Het observeren van Gescheiden DNA-fragmenten

  1. Wanneer elektroforese is voltooid, schakelt u de voeding en verwijder het deksel van de gel doos.
  2. Verwijder de gel uit de gel doos. Giet overtollige buffer van het oppervlak van de gel. Plaats de gel lade op keukenpapier om extra lopen buffer op te vangen.
  3. Verwijder de gel uit de gel lade wordt blootgesteld gel met UV licht. Dit wordt meestal uitgevoerd met een gel documentatiesysteem (Fig. 4). DNA-banden moeten tonenals oranje fluorescerende groepen. Een foto van de gel (Fig. 5).
  4. Gooi de gel en loopt buffer per instelling regelgeving.

4. Representatieve resultaten

Figuur 5 is een typisch resultaat na agarosegelelektroforese PCR-producten. Na scheiding, de verkregen DNA-fragmenten zichtbaar duidelijke band. De DNA standaard of ladder moeten worden gescheiden in een mate waardoor de nuttige bepaling van de grootte van het monster banden. In het getoonde voorbeeld, DNA fragmenten van 765 bp, 880 bp en 1022 bp gescheiden op een 1,5% agarose gel samen met een log2 DNA ladder.

Figuur 1.
Figuur 1. Gestolde agarosegel na verwijdering van de kam.

Figuur 2.
Figuur 2. Een student toe te voegen laden kleurstof aan haar DNA-monsters.

Figuur 3.
Figuur 3. Een student het laden van het DNA-monster in een goed in de gel.

Figuur 4.
Figuur 4. Een voorbeeld van een gel documentatiesysteem.

Figuur 5.
Figuur 5. Een beeld van een gel na elektroforese. EtBr werd toegevoegd aan de gel voor elektroforese tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml, gevolgd door afscheiding van 100 V gedurende 1 uur. De gel werd blootgesteld aan UV-licht en de foto genomen met een gel documentatiesysteem.

Discussion

Agarosegelelektroforese blijkt een efficiënte en effectieve manier te scheiden nucleïnezuren zijn. Hoge gel Agarose de kracht maakt de behandeling van lage percentage gels voor het scheiden van grote DNA-fragmenten. Moleculaire zeef wordt bepaald door de grootte van de poriën gegenereerd door de bundels agarose 7 in de gelmatrix. In het algemeen hoger de concentratie van agarose, hoe kleiner de poriëngrootte. Traditionele agarose gels meest effectief bij de scheiding van DNA-fragmenten van 100 bp tot 25 kb. DNA-fragmenten groter dan 25 kb scheiden, wordt een puls moeten gebied gelelektroforese 6, waarin de toepassing van wisselstroom uit twee verschillende richtingen omvat gebruiken. Op deze wijze grotere afmetingen DNA fragmenten worden gescheiden door de snelheid waarmee ze zich oriënteren van de veranderingen in stroomrichting. DNA-fragmenten kleiner dan 100 bp beter gescheiden door Polyacrylamide gel elektroforese. Andersagarose gels, wordt de polyacrylamidegel matrix gevormd door een vrijeradicaalmechanisme aangedreven chemische reactie. Deze dunnere gels zijn van hogere concentratie, zijn verticaal lopen en hebben een betere resolutie. In moderne DNA sequentiebepaling capillaire elektroforese wordt gebruikt, waarbij capillairen worden gevuld met een gelmatrix. Het gebruik van capillaire buizen voorziet in de toepassing van hoge spanningen, waardoor de scheiding van DNA-fragmenten (en de bepaling van de DNA-sequentie) snel.

Agarose kan worden aangepast aan laag smeltpunt agarose creëren door middel van hydroxyethylation. Laagsmeltende agarosegel wordt gewoonlijk gebruikt bij de isolatie van DNA-fragmenten gescheiden gewenst. Hydroxyethylation vermindert de dichtheid van de agarose bundels, effectieve vermindering van hun poriegrootte 8. Dit betekent dat een DNA fragment van dezelfde grootte langer duurt om door een laagsmeltende agarosegel in tegenstelling tot een standaard agarosegel. Omdat de bundels met elkaar koppelendoor niet-covalente interacties 9 is het mogelijk hersmelten een agarosegel na het uitharden.

EtBr is de meest voorkomende reagens DNA vlek in agarose gels 10. Bij blootstelling aan UV-licht, elektronen in de aromatische ring van ethidium molecuul geactiveerd, waardoor het vrijkomen van energie (licht) als elektronen terugkeer naar grondtoestand. EtBr werkt door te intercaleren zich in de DNA-molecuul in een concentratie-afhankelijke wijze. Dit maakt een schatting van de hoeveelheid DNA in een bepaalde DNA-band op de intensiteit. Door de positieve lading, het gebruik van EtBr vermindert de DNA migratie met 15%. EtBr is een verdacht mutageen en carcinogeen, daarom moet men voorzichtig met agarose gels waarin het voorkomt. Bovendien wordt EtBr als een gevaarlijke en worden afgevoerd. Alternatieve vlekken voor DNA in agarose gels zijn onder andere SYBR Goud, SYBR groen, Crystal Violet en Methyl Blue. HiervanMethyl Blue en kristalviolet niet nodig blootstelling van de gel met UV licht visualisatie van DNA-banden, waardoor de kans mutatie indien herstel van het DNA-fragment uit de gel wordt gewenst. Maar hun gevoeligheid lager dan EtBr. SYBR goud en SYBR groen zijn beide zeer gevoelig, uv afhankelijk van kleurstoffen met een lagere toxiciteit dan EtBr, maar ze zijn aanzienlijk duurder. Bovendien alle alternatieve kleurstoffen hetzij niet of niet goed werken als direct toegevoegd aan de gel, waardoor de gel moeten na gekleurde na elektroforese. Vanwege de kosten, gebruiksgemak, en gevoeligheid, EtBr blijft de kleurstof van de keuze voor vele onderzoekers. Echter, in bepaalde situaties, zoals bij het gevaarlijk afval is moeilijk of wanneer de jonge studenten een experiment uitvoeren, kan een minder giftige kleurstof de voorkeur.

Laden kleurstoffen in gelelektroforese dienen drie doeleinden. Eerst toe te voegen dichtheid om het monster, Waardoor het te zinken in de gel. Ten tweede, de kleur en kleurstoffen vereenvoudigen het laadproces. Ten slotte is de kleurstoffen verplaatsen standaardtarieven door de gel, waardoor de schatting van de afstand die DNA-fragmenten zijn gemigreerd.

De exacte maten van gescheiden DNA fragmenten kunnen worden bepaald door het uitzetten van de log van het molecuulgewicht van de verschillende banden van een DNA standaard tegen de afstand van elke band. De DNA-standaard bevat een mengsel van DNA-fragmenten van vooraf bepaalde afmetingen kunnen worden vergeleken met de onbekende monsters DNA. Het is belangrijk op te merken dat verschillende vormen van DNA door de gel te bewegen met verschillende snelheden. Plasmide DNA, vanwege de compacte bouw, zich door de gel snelste, gevolgd door een lineaire DNA fragment van dezelfde grootte, met de open cirkelvorm reizen de laagste.

Tenslotte, aangezien de toepassing van agarose gels in 1970 voor de scheiding van DNA, heeftbewezen als een van de meest bruikbare en veelzijdige technieken in de biologische wetenschappen onderzoek.

Disclosures

Wij hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose I Amresco 0710
Boric acid Sigma-Aldrich B7901
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637 Carcinogenic—needs to be disposed of as hazardous waste
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP2401-212 Corrosive
Glycerol Fisher Scientific G33-1
Xylene cyanol FF Sigma-Aldrich X4126
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Investigator/FX gel documentation system Fotodyne Incorporated
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system Thermo Fisher Scientific, Inc. B1-PTM
EPS 301 power supply GE Healthcare 18-1130-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. 3rd, (2001).
  2. Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. 9-22 (1991).
  3. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
  4. Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
  5. Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
  6. Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
  7. Devor, E. J. IDT tutorial: gel electrophoresis. Available from: http://cdn.idtdna.com/Support/Technical/TechnicalBulletinPDF/Gel_Electrophoresis.pdf (2010).
  8. Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
  9. Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
  10. Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).

Comments

5 Comments

  1. Well understood................great explanation

    Reply
    Posted by: Muhammad Rizwan A.
    February 27, 2015 - 4:01 PM
  2. Agarose Gel Image -

    We offer a single point of contact to design custom Staphylococcus Test Kits, Gel Imaging Systems and Agarose Gel Image that respond to our client different needs.

    For More Info :- http://www.bioolympics.com/

    Reply
    Posted by: Jennifer C.
    March 23, 2015 - 7:49 AM
  3. too good

    Reply
    Posted by: Rosella B.
    April 26, 2015 - 10:12 AM
  4. Thank you!

    Reply
    Posted by: Axel W.
    November 30, 2016 - 1:55 AM
  5. very clear thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2017 - 6:11 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics