Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een complementaire reeks van experimentele en computationele methoden voor het schatten van microbiële cultuur fitnesses. QFA schat het effect van genetische mutaties, drugs of andere toegepaste behandelingen microbe groei. Experimenten scaling van gerichte analyse van de afzonderlijke culturen tot duizenden parallelle culturen kan worden ontworpen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kwantitatieve Fitness Analyse (QFA) is een experimentele en computationele workflow voor het vergelijken van fitnesses van microbiële culturen gekweekt in parallel 1,2,3,4. QFA kan worden toegepast op gerichte waarnemingen van enkele culturen, maar is vooral handig voor genoom-brede genetische interactie of drugs schermen onderzoeken tot duizenden onafhankelijke culturen. De centrale experimentele methode is de inenting van onafhankelijke, verdunde vloeibare microbiële culturen op vaste agar platen die worden geïncubeerd en regelmatig gefotografeerd. Foto van elk tijdstip van levensbeëindiging geanalyseerd, van kwantitatieve celdichtheid schattingen, die worden gebruikt om groeicurves bouwen, waardoor kwantitatieve geschiktheid maatregelen worden afgeleid. Cultuur fitnesses kan vergeleken worden met te kwantificeren en te rangschikken genetische interactie sterke of overgevoeligheid voor medicijnen. Het effect op de cultuur geschiktheid van eventuele behandelingen toegevoegd in de ondergrond agar (bijvoorbeeld kleine moleculen, antibiotica of voedingsstoffen) of toegepast op platen externely (bijvoorbeeld UV-straling, temperatuur) kan worden gekwantificeerd door QFA.

De QFA workflow produceert groei schat analoog aan die verkregen door spectrofotometrische meting van parallelle vloeibare culturen in 96-wells of 200-wells plaat lezers. Belangrijk QFA heeft aanzienlijk hogere doorvoer vergeleken met deze methoden. QFA culturen groeien op een stevige agaroppervlak en daardoor goed belucht tijdens de groei zonder roeren of schudden.

QFA doorvoer is niet zo hoog als die van sommige synthetische Genetische Array (SGA) screeningsmethoden 5,6. Echter, aangezien QFA culturen zijn sterk verdund alvorens te worden ingeënt op agar, kan QFA vastleggen completer groeicurves, met inbegrip van exponentiële en verzadiging fase 3. Bijvoorbeeld groeicurve waarnemingen kunnen cultuur verdubbelingstijden rechtstreeks worden bepaald met hoge precisie, zoals eerder besproken 1.

Hier presenteren wij eenspecifieke QFA protocol toegepast op duizenden S. cerevisiae culturen die automatisch door robots behandeld tijdens de inoculatie, incubatie en beeldvorming. Elk van deze automatische stappen kunnen worden vervangen door een equivalente, handmatig procedure met een bijbehorende afname van de doorvoer en ook een geringer throughput hand protocol. Dezelfde QFA software tools kunnen worden toegepast op beelden die zijn vastgelegd in een van beide workflow.

We hebben uitgebreide ervaring toe te passen QFA aan culturen van de gist S. cerevisiae, maar we verwachten dat QFA zal blijken ook nuttig voor de behandeling van culturen van de kernsplijting gist S. pombe en bacteriële culturen.

Protocol

Handmatig QFA Protocol (voor S. cerevisiae-stammen)

1. Het kweken van giststammen

  1. Tot 96 onafhankelijke giststammen gekweekt in 200 pi rijke vloeibare media in een 96-wells kweekschaal. De stammen zijn uitgegroeid tot verzadiging in een temperatuur gecontroleerde incubator.
  2. A 96 pen, 1/8 "diameter hand replica Uitplater (Sigma R-2508) gesteriliseerd door eerst dompelen replica Uitplater in 100% ethanol, brandende en laten afkoelen.
  3. 200 ul steriel water wordt bekleed met een 96-wells petrischaal. De verzadigde culturen vortex (Eppendorf MixMate, 30 sec, 750 rpm) en verdund door dompelen van de gesteriliseerde pin gereedschap in de verzadigde stammen drie keer dan in de plaat met het water een keer.
  4. De pen gereedschap wordt opnieuw gesteriliseerd per 1.2.
  5. De gesteriliseerde pen gereedschap wordt gebruikt om de verdunde cultuur zien op agarplaten verkocht door dompelen in de plaat met de verdunde cultuur driemaaln de overdracht van de pin gereedschap om een ​​rechthoekig solide agarplaat.
  6. De rechthoekige vaste agarplaten worden geïncubeerd bij een geschikte temperatuur alvorens te worden afgebeeld handmatig met behulp van een S & P Robotics spImager. Alternatieve foto's maken methoden worden ook gebruikt worden, zoals een FujiFilm LAS4000, of een goedkopere digitale SLR camera als zorg wordt besteed aan een gelijkmatige verlichting en consistente plaat positionering ten opzichte van de beeldvorming camera te verzekeren.
  7. De methode is aangepast om kleinere aantallen parallelle culturen, zoals 48, die kunnen worden aangebracht op door Petrischalen als zorg besteed aan dezelfde hoek met de beeldcamera waarborgen tijdens elke foto.

Volledig geautomatiseerd QFA Protocol (voor S. cerevisiae-stammen)

2. Het kweken van giststammen

  1. Begin met een rechthoekige reeks van onafhankelijke giststammen groeien op vaste agar. In dit voorbeeld het begin stammen resultaat van het kruisen een temperatuurgevoelige vraag mutatie met de gist verwijdering Collection (YDC) door synthetische Genetische Array (SGA). Final SGA platen in 1536 formaat. Dit is 16 rijen met 24 kolommen van koloniën / culturen die vier herhalingen van 384 onafhankelijke giststammen. Zie figuur 1 voor bord lay-outs.
  2. 384 stammen uit 1536 zijn robot overgebracht met behulp van een S & P Robotics Inc BM3-SC robot met een 96 pin, 1-mm pin met een diameter steriele pintool in vier 96-putjes met 200 ul van selectieve media (figuur 1). Pintool reinheid en steriliteit verkregen door achtereenvolgens te wassen met steriel water tweemaal (eenmaal met een roterende borstel om vuil), 70% ethanol (met sonicatie) en tenslotte 100% ethanol.
  3. De culturen gekweekt tot verzadiging (drie dagen bij 20 ° C in dit voorbeeld, zie figuur 1).

3. Spotting gistculturen

  1. Een Beckman Biomek FX verzadigde culturen eenopnieuw geresuspendeerd door vortexen op een Variomag Teleshake (tegen de klok bij 1000 tpm gedurende 20 seconden) en verdund ongeveer 1:70 door de pinnen in 200 ul steriel water met behulp van een steriele 96 pin robotachtige pin tool (V & P Wetenschappelijk magnetische bevestiging pintool, 2 mm pin diameter). Pin gereedschap reinheid en steriliteit door wassen in steriel water, wassen in 70% ethanol (met een borstel om vuil) en tenslotte dompelen in 70% ethanol gevolgd door drogen.
  2. De verwaterde culturen worden gespot op vaste agarplaten in 384 formaat met behulp van dezelfde robot pin tool (zie figuur 1) na reiniging en sterilisatie.
  3. Na pinning, worden de platen overgebracht naar een Cytomat temperatuur gecontroleerde, bevochtigde incubator met automatische carrousel en toegangsluik.

4. Image Capture

  1. Een S & P Robotics geautomatiseerde imager verwijdert herhaaldelijk op de platen van de Cytomat incubator, verwijdert de plaat deksel, plaatst ze precies onder een omsluitend, gelijkmatig verlichte ruimte onder een Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR, vangt een beeld op 5184 x 3456 px resolutie, vervangt de plaat deksel, en retourneert deze naar de couveuse carrousel. Een afbeelding is direct vastgelegd na de eerste overdracht naar de incubator om tot een nulpunt tijdstip groei meting (achtergrond). Robot handling en fotografie duurt ongeveer 2 minuten per plaat.
  2. Met een volledig geladen carrousel, de maximaal haalbare plaat vastleggen van beelden frequentie is een foto van elke zes uur. Worden geïncubeerd gedurende zes dagen (tot kolonie groei verzadiging. Figuur 1 toont drie typische beelden van een tijdsverloop bij 20 ° C.
  3. Voor opsporingsdoeleinden, worden de platen genoemd naar incubator naam, temperatuur, unieke sequentiële batch aantal en de positie in de incubator. Image namen zijn een aaneenschakeling van plaat naam en timestamp en worden automatisch uitgevoerd op beeld vast te leggen (bijv. K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Type Bestand FT1, tabel 1).

5. Met het afvangen van Experimentele Metadata

De metadata-bestanden in deze paragraaf beschreven zijn door tabs gescheiden tekstbestanden die handmatig worden gegenereerd (bijvoorbeeld met behulp van spreadsheet software). De experimentele Beschrijving bestand (FT2, tabel 1) is uniek voor elk experiment, maar de bibliotheek Beschrijving (F3, tabel 1) kan worden hergebruikt uitgebreid keer geconstrueerd.

  1. Het experiment wordt beschreven in de Experimentele Description-bestand (FT2, Tabel 1) met kolommen voor de barcode (of automatisch gegenereerde plaat naam), experiment te beginnen tijdstempel, plaat behandeling, de inhoud van vaste agar medium, schermnaam, bibliotheek, nummerplaat (voor bibliotheken meerdere platen) en een herhaling-kwadrant nummer (zie figuur 1) voor het schalen van beneden uit 1536-formaat tot 384 formaat.
  2. De giststam bibliotheek wordt beschreven met een bibliotheek Beschrijving bestand (F3,
  3. Een optionele Standaard Gene Naam bestand (FT4, tabel 1) het beschrijven van de standaard gen naam (bijv. RAD9) die bij elke systematische ORF y-nummer (bv YDR217C) het identificeren van stammen worden gescreend kan worden. Dit bestand bevat twee kolommen: ORF & Gene naam.

6. Data-analyse

De QFA computationele workflow vereist toegang tot een redelijk krachtige multicore computer werkstation (bijvoorbeeld een Dell Precision T3500 met Xeon quad-core 2,67 GHz processor en 12 GB RAM) met daarop geïnstalleerd de Colonyzer beeldanalyse software tool 3,4 en de QFA R pakket 7 , die beide worden online gedocumenteerd, zijn vrij beschikbaar en uit te voeren op een reeks van besturingssystemen.

  1. Run Colonyzer met elk van de opgenomen plaat beelden als ingang genereren van een Colonyzer Uitvoerbestand (FT5 tabel 1) voor elk beeld opgenomen. Colonyzer Output bestanden op te geven cultuur dichtheid schattingen, cultuur gebied, vorm en kleur voor elk van de 384 locaties op de belichte plaat. Output bestandsnaam wordt automatisch gekopieerd van de bronafbeelding bestandsnaam (bijvoorbeeld de plaat foto K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, tabel 1) komt overeen met de Colonyzer output file K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat ( FT5, tabel 1)).
  2. Met behulp van de QFA R-pakket, laadt experimentele metadata (FT2, tabel 1) en Colonyzer output-bestanden (FT5 tabel 1). Deze gegevens worden samengevoegd in R data frames (die kan worden geëxporteerd als QFA Raw Data tekstbestanden (FT6, tabel 1)) voor verdere analyse.
  3. De QFA R-pakket bevat functies om celdichtheid timecourses te verzamelen voor elke cultuur, gegeneraliseerde Lo passengistic bevolking modellen om observaties en te plotten beide (zie figuren 2 en 3 voor voorbeelden). Ingerichte parameterwaarden worden geschreven om QFA Logistieke Parameter bestanden (FT7 tabel 1). Zie QFA R pakket documentatie voor meer informatie.
  4. De QFA R pakket bevat ook functies voor kwaliteitscontrole: edge kolonies worden als gevolg van de grotere beschikbaarheid van voedingsstoffen weg te gooien aan de plaatranden en moeite met beeldanalyse buurt plaat muren, culturen die de SGA en genotypen het weergeven van de koppeling met screen-specifieke marker-genen niet worden ontdaan van analyse.
  5. Verschillende kwantitatieve fitness maatregelen zijn afgeleid van logistieke populatie model parameters voor elke cultuur. Deze omvatten maximale populatieverdubbelingstijd tarieven (MDR) en het aantal divisies van inoculatie tot verzadiging (MDP). Voor elke set van duplo-culturen (van unieke genotype bijvoorbeeld) en voor elk fitness-definitie, een aantal samenvattende statistieken van fitness schattingen zijn compdeeld: gemiddelde en mediaan fitness, fitness standaardafwijking en aantal herhalingen waargenomen. Samenvatting statistieken worden uitgevoerd naar QFA Fitness Samenvatting bestanden (FT8, tabel 1) voor verdere analyse, zoals de berekening van genetische interactie score (FT9 tabel 1).

7. Representatieve resultaten

Figuur 2 toont een typische groeicurve van 384 QFA culturen groeien bij 20 ° C in een vaste agar zoals gekwantificeerd door Colonyzer, met een toename in celdichtheid eerst hebben detecteerbaar na ongeveer 2 dagen. Deze vertraging is waarschijnlijk een gecombineerd effect van een cultuur lag fase na inoculatie op vast medium en een ondergrens van detectie voor celdichtheid. Figuur 3 toont 308 soortgelijke groeicurven opgevangen uit een enkele plaat. Figuur 4 toont de vergelijking van twee genome-wide QFA schermen af ​​te leiden genetischeinteractie sterke punten (aangepast van 1). De QFA R-pakket 7 bevat ook functies voor het figuur 3 te produceren en om gerangschikte lijsten van de onderzochte genotypen en schattingen van de genetische interactie sterkte (GIS) uit te voeren, samen met een q-waarde (False Discovery Rate (FDR) gecorrigeerde p-waarde) voor de betekenis van de waargenomen GIS.

Figuur 1
Figuur 1. Schema voor robot inoculatie van giststammen in de 384-spot-formaat. Deze procedure begint met 1536 onafhankelijke culturen per plaat (links). In dit voorbeeld, kolonies op posities 1,1, 1,2, 2,1 en 2,2 (rood) zijn vier replicaten van hetzelfde genotype his3 :: KANMX culturen geel groeien op de rand van de plaat. , hebben een groei voordeel te wijten aan gebrek aan concurrentie en zijn daarom niet onderzocht door QFA. Een van deze replica (bijvoorbeeld 1,1) is geënt in vloeibare kweekmedia in 96-wells plaat s met behulp van een 96-pins tool die 96 inent uit van 1536 kolonies per keer. Met het oog op een duplo voor elk van 384 gendeleties, vier verschillende "kwadranten" (aangeduid als rood, blauw, groen en paars) inoculeren geënt in vier verschillende 96-wells platen met de groei media. Na een groei van verzadiging (bijvoorbeeld 3 dagen bij 20 ° C), culturen zijn opgelost in water, dan de vier kwadranten van de ene herhaling zijn gespot in 384-formaat op een vaste agar plaat (rechts) in hetzelfde patroon als de oorspronkelijke SGA plaat (zoals aangegeven door kleur). Het proces kan worden herhaald om te testen andere duplo: 1,2, 2,1 en 2,2. Voorbeeld time-lapse beelden op de juiste werden gevangen 0,5, 2 en 3,5 dagen na de inenting. Aangepast van aanvullende Figuur 1 2. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

018/4018fig2.jpg "/>
Figuur 2. Een robot-gevangen QFA groeicurve. A) QFA groeicurve van een giststam steeds op agar met galactose bij 20 ° C. Beelden werden robot gevangen ongeveer om de 2 uur. Exponentiële fase bij deze temperatuur werd waarneembaar ongeveer 1,5 dagen, kweekdichtheid toename eerst hebben ontdekt ongeveer 2 dagen na de inoculatie. Een gegeneraliseerde logistische model is geschikt om de waargenomen gegevens (grijze curve). Model parameters automatisch gemonteerd door de QFA R-pakket worden gepresenteerd: K (draagkracht (AU)), r (groei (d -1)), g (inoculum dichtheid (AU)), v (groei van symmetrie). B) Wat panel A, uitgezet met celdichtheid op een log schaal. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. Automatisch gen nominale groei curves gevangen in parallel uit een 384-formaat plaat. Elk paneel toont celdichtheid schattingen (rode kruisjes) en model fit (zwarte curve) voor onafhankelijke culturen gelabeld door gen naam of ORF y-nummer gekweekt in een QFA procedure. Dit voorbeeld plaat werd afgebeeld door robot en gekweekt in een geautomatiseerde incubator bij 20 ° C. Experimentele metadata worden automatisch opgenomen in de figuur titel: plaat naam, plaatje behandeling, agar medium en een bibliotheek nummerplaat. Aangepaste model parameter waarden worden ook automatisch afgedrukt op elk paneel (zie figuur 2). Edge culturen werden ontdaan van QFA analyse, het verlaten van de 308 culturen in deze grafiek (zie QFA Protocol 5.4). Aangezien de rand culturen niet geanalyseerd in QFA, worden deze cultuur locaties meestal gevuld met een neutrale controle stammen (pGAL-HIS3 in dit geval). De originele versie van dit cijfer, uitgevoerd door de QFA R-pakket, is in. Pdf-formaat en is dus oneindig inzoombare en doorzoekbaar door tekst queries.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.

Figuur 4
Figuur 4. Vergelijken fitnesses van twee QFA schermen tot genetische interactie af te leiden. Deze plot geeft grafisch vergelijking van de geschiktheid van gist deleties (yfgΔ) in combinatie met de neutrale ura3Δ mutatie of de temperatuur gevoelige cdc13-1 mutatie en gegroeid bij de semi-permissieve temperatuur voor cdc13- 1 (27 ° C). Fitness is berekend als het product van de maximale verdubbeling percentage en het maximumbedrag verdubbeling potentiële 1. De deletiestammen groeien goed in combinatie met de neutrale ura3Δ mutatie, zoals verwacht, een hoge conditie, maar in combinatie met deleties cdc13-1 hebben een breed scala van fitnesses. Het licht blauwe lijnen over te steken aan de THe plaats van de neutrale his3Δ mutatie, de vaste lijn is een lineaire regressie model van genetische onafhankelijkheid (verwachte geschiktheid van cdc13-1 yfgΔ mutanten gegeven geschiktheid van ura3Δ yfgΔ mutanten) en de gestippelde lijn is de lijn van gelijke geschiktheid. Verwijderingen groen aanzienlijke vergroting van de fitness defect van cdc13-1-stammen. Verwijderingen rood gekleurd aanzienlijk te onderdrukken hetzelfde gebrek. Verticale afstand van een mutatie cdc13-1 yfgΔ van de vaste lijn geeft de sterkte van de interactie tussen genetische cdc13-1 en yfgΔ onder de plaat omstandigheden. Merk op dat sommige van de sterkste onderdrukkers van cdc13-1 eerder zijn checkpoint genen, RAD17, DDC1 en RAD24 en de nuclease EXO1 geïdentificeerd buurt van de top naar rechts. Genen waarvan de verwijdering vermindert de fitness zijn YKU80 (dat codeert voor het DNA-herstel en de telomeren aftopping eiwit Yku80) bij de rechtsonder. Merk ook op dat sommige groepen van genen die samen functioneren worden vaak op dezelfde locatie geplaatst op dit perceel. Drie bijvoorbeeld clusters zijn blauw gekleurd SPE1, SPE2 en SPE3: spermidine synthese genen, RAD17, DDC1 en RAD24: codering onderdelen van de checkpoint glijdende klem en checkpoint klem lader, Mre11, RAD50 en XRS2: de MRX complex, die betrokken zijn bij DDR en EST1 & EST3: genen die betrokken zijn in de lengte van telomeren regelgeving. Aangepast van aanvullende figuur 1B 1, de ruwe gegevens waaruit dit perceel is gegenereerd kan worden gedownload van hier: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

"> Bestand ID File Type Handmatig Gebouwd Werk Frequentie Eerste vereiste FT1 Plaat foto Geen Per plaat & tijdpunt Ja FT2 Experimentele Beschrijving Ja Per experiment Ja FT3 Bibliotheek Beschrijving Ja Per bibliotheek Ja FT4 Standaard Gene Namen Ja Per bibliotheek Geen FT5 Colonyzer Ouput Geen Per meetpunt per plaat Ja FT6 QFA Raw Data Geen Per experiment - FT7 Geen Per experiment - FT8 QFA Fitness Samenvatting Geen Per experiment - FT9 QFA Genetische Interactie Hitlist Geen Per GIS studie (2 expts.) -

Tabel 1. Elektronische QFA bestanden. Alle genoemde bestanden (met uitzondering van FT1) zijn door tabs gescheiden tekstbestanden en kan worden gebouwd of gelezen met behulp van een tekstverwerker of spreadsheet software. Voor meer informatie over de bouw van QFA metadata bestanden en precieze interpretatie van de QFA uitgang zie de QFA R pakket documentatie 7 en de Colonyzer softwaredocumentatie 3.

Tabel 2
Tabel 2. Methoden voor de beoordeling van cultuur fitness. Een samenvatting van de kenmerken en vereisengen van een aantal methoden voor de beoordeling van microbiële cultuur fitness. Een review door Blomberg 8 bevat meer gedetailleerde vergelijking van een aantal van deze. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

QFA is in vele opzichten een directe afstammeling van drie gevestigde bench-schaal microbiologische technieken: cultuur verdunningsreeks ter plekke testen 9, groeicurve bepaling in beluchte vloeistof, culturen 9 en replica plating 13. Deze drie methoden worden samengevat en vergeleken met QFA en high-throughput technieken in tabel 2. Overwegende dat de verdunningsreeks plek testen van een stam van de fitness te definiëren als het vermogen om kolonies in een reeks van culturen uitgegroeid van een scala aan inoculum verdunningen te vormen, om QFA maatregelen stam fitness door herhaalde waarnemingen van een enkele cultuur de bouw van een groeicurve. Het kwantificeren van fitness van een enkele cultuur kunnen veel meer stammen tegelijk worden onderzocht, onder identieke omstandigheden. Repliceren arrays van culturen maakt herhaalde testen van stam collecties, het meest nuttig bij het testen voor cultuur fitness verschillen in de verschillende omgevingen of genetische achtergronden. De QFA protocol gepresenteerdhier maakt gebruik van dure robot apparatuur te vermenigvuldigen, te enten, incubeer en beeld agar platen, geschikt voor het observeren van de groei van duizenden onafhankelijke culturen (robot QFA, tabel 2). Aangezien QFA gebaseerd op vaste, traditionele laboratoriumtechnieken kan ook worden uitgevoerd veel goedkoper te vervangen door robot bijstand handmatige stappen (handmatige QFA tabel 2). Handmatig QFA gaat replicatie en enten van culturen op agar platen met behulp van een handleiding pin gereedschap en handmatige overdracht van platen van en naar een incubator voor de fotografie. Dezelfde computationele analyse workflow kan worden toegepast om de groei curves van zowel experimenteel ontwerp te genereren.

QFA fitness schattingen lijken relatief precies te zijn. In figuur 4 zijn de gemiddelde fitnesses vier clusters voorbeeld van functioneel verwante gendeleties gemarkeerd. De nabijheid van de leden van elke functioneel verwante gen klasse in twee onafhankelijkENT genetische achtergronden (ura3Δ en cdc13-1) geeft de reproduceerbaarheid van QFA fitness schattingen. Bijvoorbeeld, op slechts 3 gendeleties (op een totaal van 4300) te scheiden van de drie leden van de geconserveerde MRX complex.

High-throughput alternatieven QFA voor het testen groeikarakteristieken van bacteriestammen omvatten SGA 5,6 concurrentie schermen barcode bibliotheken 11,12 en schermen vastleggen extinctie kinetiek spectrofotometrische plaat lezer 10 zijn samengevat in tabel 2 nader beschreven elders 8 . QFA en SGA platen, waar culturen groeien op vaste agar oppervlakken (agar based methoden, tabel 2) kunnen snel en eenvoudig worden verholpen door robot. Solid agar oppervlak culturen zijn goed belucht in de groei en de cellen kunnen groeien in vaste culturen, waardoor gezellige microben om te groeien in een gemeenschap 14. Intact gelaten, microbiële gemeenschappen eenffect eigen micro-omgevingen afscheidende toxinen zoals ethanol, en eventueel signalering tussen cellen. Echter, continu mengen van vloeibare culturen, die nodig zijn om voldoende beluchting te bereiken, kunstmatig verstoort microbiële gemeenschappen en hun micro-omgeving die van invloed kunnen hun manieren van groei. Kruisbesmetting is minder groot probleem in vaste agar methode, omdat er minder kans op spatten de uitvoering cellen tussen culturen. Mocht contaminatie optreden door buitenlandse lucht verspreide micro-organismen in vaste agar testen, kan het vaak worden gedetecteerd door visuele inspectie van vaste agarplaten en verantwoord of verwijderd.

QFA doorvoer aanzienlijk hoger dan parallel vloeistof methoden op twee manieren. In de eerste plaats op de QFA (en SGA) platen, geënt culturen elkaar gepakt dichter, waardoor meer onafhankelijke culturen per plaat. In QFA zijn er doorgaans 308 culturen, niet meegerekend niet-experimentele edge culturen (figuur 1) comVergeleken met vloeibare kweken parallel met 96 of 100 culturen per plaat. Ten tweede kan QFA experimenten worden geschaald met een veel groter aantal platen. Hoewel het aantal platen geanalyseerd in een enkele QFA experiment wordt alleen beperkt door de beschikbare ruimte in een broedstoof of warme kamer, de minimum toegestane beeldregistratie frequentie en de maximaal haalbare vangen frequentie van het aantal platen in een vloeistof groei experiment sterk beperkt de capaciteit de plaatlezer (gewoonlijk een of twee platen) of van de stapelaar aan de plaatlezer (gewoonlijk 25 tot 50 platen). We hebben onlangs een volledig geautomatiseerde QFA experiment op 123 platen, elk met 308 experimentele culturen, het geven van 37.884 gelijktijdige culturen. We schatten dat het maximaal haalbare aantal onafhankelijke culturen groeien in vloeistof is 96 (culturen / plaat) x 50 (platen / stapelaar) = 4800, dat is ongeveer tien keer minder dan onze QFA doorvoer. Een alternatief voor vloeibare cultuur schermen is het gebruik van vele geautomatiseerde growth apparaten parallel (tabel 1 van het onderzoek van Blomberg 8), elk met een capaciteit van een of twee platen. Temperatuurregeling in elk apparaat onafhankelijk is, en dus voorwaarden zijn niet identiek, maar in de veronderstelling dat ze zijn, zouden deze workflow moet ten minste 190 dergelijke apparaten QFA doorvoer (ervan uitgaande dat 200 vloeibare culturen per apparaat) te passen.

Samengevat QFA een hoogwaardige workflow, die kunnen worden toegepast kwantitatieve groei fenotypen verzamelen zowel kleinschalige gericht experimenten en hoog-schermen. Het is flexibel genoeg om effectief te worden toegepast met verschillende eisen voor de robot apparatuur. De computationele component van de QFA workflow is gebaseerd op de vrij beschikbare, open source code.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

We dankbaar erkennen alle leden van ons laboratorium en het Centrum voor Integrated System Biologie van Ageing and Nutrition (CISBAN) voor de ondersteuning en behulpzaam discussies. Deze studie werd ondersteund door biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) en de Wellcome Trust (075.294, 093.088).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7, (4), e1001362 (2011).
  2. Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 180, 2251-2266 (2008).
  3. Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar. BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).
  4. Colonyzer - Image analysis software [Internet]. Newcastle University. Newcastle, UK. Available from: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/ (2012).
  5. Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  6. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  7. qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. University of Vienna. Vienna, Austria. Available from: http://qfa.r-forge.r-project.org/ (2012).
  8. Blomberg, A. Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping. Curr. Opin. Biotechnol. 22, (1), 94-102 (2011).
  9. Maringele, L., Lydall, D. EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants. Genes and Dev. 16, (15), 1919-1933 (2002).
  10. Warringer, J., Blomberg, A. Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20, 53-67 (2003).
  11. Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, (5874), 362-365 (2008).
  12. Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries. J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).
  13. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  14. Queller, C. Behavioural ecology: The social side of wild yeast. Nature. 456, 589-590 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics