NADH fluorescensimagografi af Isoleret Biventricular Arbejde kaninhjerter

Medicine
 

Summary

Målet er at overvåge den mitokondrielle redoxtilstanden af ​​isolerede hjerter i forbindelse med fysiologiske forbelastning og afterload tryk. En biventrikulær arbejder kaninhjerte model præsenteres. Høj spatiotemporal opløsning fluorescensimagografi af NADH anvendes til at overvåge den mitokondrielle redoxtilstanden af ​​epikardiale væv.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Siden starten af Langendorff 1, forbliver isolerede perfunderede hjertet et fremtrædende værktøj til at studere hjertets fysiologi 2. Det er imidlertid ikke velegnet til studier af hjerte metabolisme, som kræver hjertet for at udføre arbejde inden for rammerne af fysiologisk forbelastning og afterload tryk. Neely indført ændringer af Langendorff teknik til at etablere passende venstre ventrikel (LV) preload og afterload pres 3. Modellen er kendt som den isolerede LV arbejds hjerte model og er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere LV ydeevne og metabolisme 4-6. Denne model er imidlertid ikke en korrekt indlæst højre ventrikel (RV). Demmy et al. første rapporterede en biventrikulær model som en modifikation af LV bearbejdning hjertet model 7, 8. De fandt, at slagvolumen, minutvolumen, og tryk udvikling forbedret i hjerter konverteret fra arbejde LV mode til biventrikulær arbejde tilstand 8 8.

Når man undersøger de metaboliske virkninger af myocardial skade, såsom iskæmi, er det ofte nødvendigt at identificere placeringen af ​​det påvirkede væv. Dette kan gøres ved billeddannelse fluorescensen af NADH (reduceret form af nicotinamid-adenin-dinucleotid) 9-11 fundet et coenzym i store mængder i mitokondrierne. NADH fluorescens (fNADH) viser et næsten lineært omvendt forhold til lokale iltkoncentration 12 og giver et mål af mitokondriel redoxtrin 13. fNADH billeddannelse under hypoxiske og iskæmiske tilstande er blevet anvendt som et farvestof-fri metode til at identificere hypoksiske områder 14, 15 og til at overvåge udviklingen afhypoxiske betingelser over tid 10.

Formålet med fremgangsmåden er at overvåge den mitokondrielle redoxtilstanden af ​​biventrikulær arbejder hjerter i protokoller, som ændrer hastigheden af ​​myocyt metabolisme eller inducere hypoxi eller skabe en kombination af de to. Hjerter fra New Zealand hvide kaniner blev forbundet til en biventrikulær arbejder hjerte-system (Hugo Sachs Elektronik) og perfunderet med modificeret Krebs-Henseleit-opløsning 16 ved 37 ° C. Aorta, LV, pulmonal arterie, og venstre og højre atrium tryk blev registreret. Elektriske aktivitet blev målt under anvendelse af en monofasisk virkningspotentiale elektrode. At afbilde fNADH, blev lys fra en kviksølvlampe filtreret (350 ± 25 nm) og anvendt til at belyse epicardiet. Emitterede lys blev filtreret (460 ± 20 nm) og afbildes ved hjælp af en CCD-kamera. Ændringer i epikardial fNADH af biventrikulær arbejder hjerter i forskellige pacinghastigheder præsenteres. Kombinationen af ​​hjertet model fNADH billeddannelsetilvejebringer en ny og værdifuld eksperimentelle redskab til at studere akutte kardiale sygdomme inden for rammerne af realistiske fysiologiske betingelser.

Protocol

1. Opsætning for Studiet

  1. Fremstille fire liter modificeret Krebs-Henseleit-opløsning 16 (i mM: 118 NaCl, 3,30 KCI, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSO4, 24,0 NaHCO3, 1,20 KH 2PO 4, 10,0 glucose, 2,00 NaPyruvate og 20,0 mg / L albumin ). Opløsningen bør være fremstillet så tæt til starten af ​​eksperimentet som muligt. PH skal justeres til 7,4 efter sterile filter (porestørrelse: 22 um, Corning). Opløsningen osmolalitet bør være mellem 275 og 295 mOsm / kg.
  2. Skyl alle rør og gemakker arbejderklassens hjertet system med renset vand. Løber pumper, indtil alt vandet er blevet fjernet fra systemet.
  3. Tilføj cellulose membranfiltre (porestørrelse: 5 um, Advantec) i overensstemmelse med hver af de perfusion pumper (Langendorff perfusion, venstre hjerte perfusion pumpe, og til højre hjerte perfusion pumpe).
  4. Udføre en to-punkts (0 og 60 mmHg) for hver tryksensor.
  5. Tænd vandbade. En opvarmet cirkulerende vandbad (Cole Palmer) anvendes til at opvarme vand-kappebeklædte rør og varmevekslere. Perfusatet forvarmes i en separat vandbad (Oakton Instruments). Begge bade er indstillet til at opretholde en opløsningstemperatur på 37 ° C.
  6. Tænde pumperne at cirkulere perfusatet i en lukket sløjfe. Perfusatet passerer gennem mikrofiber oxygenatorer (hemofilters) begasset med 95% O2 og 5% CO2 ved 80 kPa. Oxygenerede perfusatet strømmer derefter igennem varmevekslere for at opretholde den ved en temperatur på 37 ° C, inden den tilføres hjertet kanyler.

2. Heart Excision

  1. Begynd med at indstille arbejdet hjertet systemet til at fungere i et konstant pres Langendorff mode. Indstille trykket i aorta blokken inden for området fra 50 til 60 mmHg.
  2. Bedøve kanin med en intramuskulær injektion af ketamin (44 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Efter kanin er sederet, pentobarbital (50 mg / Kg) og heparin (2000 U) injiceres intravenøst ​​via den marginale ørevene eller den laterale vena saphena på indersiden af ​​bagbenet.
  3. Når kanin er fuldstændigt ikke-responsive, som bestemt ved manglende smerte refleks er brysthulen hurtigt åbnes, pericardium skåret, er aorta fastspændt, og hjertet og lungerne udskæres. På dette tidspunkt lunger skal efterlades i hjertet at hjælpe med at isolere de pulmonale vener.
  4. Isolere og kanyle i aorta med en diameter på 5 mm kanyle, der er fastgjort til en sprøjte fyldt med 60 ml perfusat, og 200 enheder heparin. Fastgør aorta til kanylen med størrelsen nul silke sutur og langsomt trykke sprøjte til at skylle i hjertet af blod.

3. Biventrikulær kanylering

  1. Forbinde hjertet til aorta blok af den arbejdende hjerte-systemet. Forhindre luft i at trænge ind i aorta, som kan forårsage koronar emboli. Det er bedst at fastgøre kanylen til aorta blOck ved at nærme aorta konnektoren i en skrå vinkel og så perfusatet for at forsigtigt dryppe fra konnektoren i kanylen, mens den er fastgjort.
  2. Mens hjertet er perfunderet i konstant tryk Langendorff-mode, fjerne fedt og bindevæv og find følgende blodårer: inferior og vena cava superior, azygos vene, pulmonal arterie, pulmonale vener.
  3. Ligere den øvre hulvene. Skære lungepulsåren lige nedenfor, hvor den forgrener til højre og venstre pulmonale arterier.
  4. Gruppe alle de øvrige fartøjer (de pulmonale vener) mellem hjerte og lunger og ligere dem alle ved hjælp af en sutur. Fjerne lungerne.
  5. Skær et lille hul i hjørnet af den venstre atriale vedhæng. Sørg for, at LA er fyldt med perfusatet. Kanyle LA samtidig sikre, at kanylen er helt fyldt med perfusatet, medens det er indsat. Suturere kanylen til LA vedhæng.
  6. Tænder på den venstre side pumpen (pumpe # 2) for at tilvejebringe strømning til than forlod atrium. Indstilles forbelastning tryk mellem 2 - 6 mmHg og justere ± 2 mmHg, som bestemt ved atrial dilatation.
  7. Skift hjertet til at arbejde hjertet tilstand ved at slukke for Langendorff pumpe (pumpe # 1).
  8. Momentant sænke aorta tryk til 10 mmHg og derefter langsomt at øge det inden for området fra 80 til 100 mmHg. Dette vil gøre det muligt aortaklappen til at åbne og fungere som det ville under normale fysiologiske betingelser. Den endelige afterload tryk vil afhænge af kontraktilitet af LV. Det bør indstilles til en værdi, der er cirka 20 mm Hg på mindre end maksimale LV tryk.
  9. LV minutvolumen kan bestemmes ved at måle strømningshastigheden af ​​perfusat forlader aorta blok (ml / min). Normal hjerteydelse er mellem 14,77 og 16,43 ml / min per 100 g legemsvægt 17 og gennemsnit 340 ml / min i en 2,2 kg kanin. Aorta tryk bør ligne tryksignalet i figur 1 viste.
  10. Kanyle RA gennem inferior vena cava. Sikre, at både RA og kanylen er fuldstændig fyldt med perfusatet og indsætte kanylen og samtidig forhindre dannelsen af ​​luftbobler. Suturere kanylen til venen.
  11. Tænder på højre side pumpen (pumpe # 3) for at tilvejebringe strømning til det højre atrium. Indstille trykket til ca 3 mmHg.
  12. Sørg for, at RV er fyldt med perfusat og kanyle i lungepulsåren. Sikre, at kanylen er helt fyldt med perfusatet, medens den indsættes for at forhindre luftbobler. Suturere kanylen til det pulmonale arterie.

4. Signal Acquisition: pres, monofasiske aktionspotentialer, og fNADH

  1. Når biventrikulær kanylering er fuldført, forsigtigt indsætte tryktransducer kateter (Millar) ind i aorta via aorta kanyle. Forsigtigt navigere forbi aortaklappen og ind i LV. Overvåge LV tryksignalet for at sikre korrekt positionering af kateterspidsen. Et eksempel på LV-tryk er visti figur 1.
  2. Tryk forsigtigt monofasiske aktionspotentialet elektroden mod ventrikulær epicardium. Overvåg signalet for at opnå passende handling potentielle målinger. Let bevægelsesartifakt i signal er normalt.
  3. Placer en bipolar stimulus elektrode på højre forkammer til tempoet i hjertet. I vores protokol var hjerter pacet ved cykluslængder mellem 300 og 150 msek, hvilket svarer til 200 og 400 bpm hhv.
  4. Måle temperaturen af ​​LV epikardiale overflade. Hvis undersøgelsen kræver, at temperaturen holdes på 37 ° C og derefter placere hjertet i en vandkappe hjertekammeret eller nedsænke hjertet i en opvarmet superfusate bad for at opretholde en konstant temperatur gennem hele hjertet.
  5. Placer CCD kamera (Andor iXon DV860, 128x128 pixels), og fokusere linsen sådan, at en passende synsfelt overholdes. Kameraet er forbundet til en arbejdsstation og billeder er erhvervet på 2 fps ved hjælp af Andor Solis software.
  6. Tænde kviksølvlampe lys forud for starten af ​​billeddannelse. Lys rettes gennem et excitationsfilter (350 ± 25 nm, Chroma Technology) og ind i en fiberoptisk lysleder (Horiba Jobin Yvon model 1950-1M) til at belyse overfladen af ​​hjertet. Dæmpningen af ​​UV-lys gennem lysleder er lille. UV-belysning kan også være forsynet med en høj effekt LED-system bestående af LED spotlights (Mightex PLS-0365 til 030-S) og en styreenhed (Mightex SLC-SA04-US).
  7. Sluk for rummets lys og minimere omgivende lys. Ret ferulerne af lysleder (eller LED projektører) i hjertet at opnå ensartet epikardial belysning. Emitteret NADH fluorescens (fNADH) passerer gennem en emissionsfilter (460 ± 20 nm Chroma Technology), og afbildes af CCD-kameraet.
  8. Overvåg fNADH ændringer over tid ved at vælge et område af interesse ved hjælp af imaging software. Vælge levende opdatere tilstand til at overvåge den gennemsnitlige pixelintensitet i regionen of interesse.
  9. Hjertet skal fungere i biventrikulær arbejder tilstand at generere passende tryk. fNADH niveauer bør være lav og stabil over epikardial overfladen for at bekræfte tilstrækkelig koronar perfusion. På dette tidspunkt i undersøgelsen en bestemt forsøgsprotokol bør gennemføres for at teste en hypotese.
  10. Når undersøgelsen er afsluttet, skal du fjerne hjertet fra systemet og tømme alt perfusatet. Skylle systemet røret og kamre med renset vand. Rutinemæssig vedligeholdelse, skal systemet periodisk skylles med Mucasol opløsning eller en fortyndet hydrogenperoxid-opløsning efter behov.

5. Off-line behandling af fNADH billeder

  1. En måde at sammenligne NADH datasæt (fNADH (i, j, t)) mellem forsøg er at normalisere hver fluorescens billedet med et referencebillede (fNADH (i, j, t 0)) fra datasættet 9, som vist i ligningen nedenfor . Anden måde at normalisere NADH fluorescens er place et lille stykke uranylacetat glas i synsfeltet før forsøget 9, 18, ​​19. Uranylacetat glas vil fluorescens (450 - 550 nm), når det belyses med UV-lys for at tilvejebringe et signal, der kan anvendes som en stabil reference.

Ligning 1

6. Repræsentative resultater

Forreste og basal afbildninger af en biventrikulær arbejder kaninhjerte præparat er vist i figur 1. Venstre ventrikulære tryk blev målt ved at navigere en tryktransducer kateter (Millar SPR-407) forbi aorta ventil og ind i den venstre ventrikel. Aorta, lungearterie og venstre ventrikulære tryk (LVP) er vist i figur 1C. Diastoliske LVP er sædvanligvis mellem 0 og 10 mmHg. Den minimale diastoliske aorta tryk er ca 60 mm Hg. Maksimale systoliske LVP afhænger fyldningstryk (forspændingen eller LA tryk) og kontraktilitetog, optimalt, skal være mellem 80 og 100 mm Hg. Den maksimale aorta tryk og maksimal LVP skal nøje passer sammen, som vist i figur 1C.

Monofasiske aktionspotentialer (MAP'er) med en hurtig depolarisering fase og en repolarisering fase, der er typiske for kaninhjerter er vist i figur 1D. MAP'er kan optages relativt let fra en ordregivende hjertet, men vil sædvanligvis have ringe bevægelsesartifakt under diastole, som vist i figur 1D. Kort er nyttige til bekræftelse vellykket medrivning af hjertet (capture) under pacing og kan også anvendes til at måle lokale elektrofysiologiske ændringer på grund af iskæmi eller andre akutte forstyrrelser. EKG kan også måles ved at nedsænke hjertet i et bad af varmt superfusate og placere en elektrode i badet på venstre og højre side af hjertet. En tredje indifferente elektrode er enten anbringes i badet, væk fra hjertet, eller er fastgjort til aorta.EKG, vil give oplysninger om det globale excitations-og repolarisering proces, som er nyttig til evaluering af den samlede elektriske funktion og for at afsløre tilstedeværelsen af ​​iskæmi.

fNADH billeddannelse afslører ændringer i den mitokondriske redoxtilstanden af ​​hjertet, som kan anvendes til at måle spatiotemporal progression af iskæmiske eller hypoxiske områder. Til denne undersøgelse blev epikardiale fNADH målt til at overvåge ændringer i redoxtilstanden i tre pacinghastigheder ved cykluslængder (CLS) af 300, 200 og 150 msek. Gennemsnitlige fNADH værdier fra et område af interesse (rød boks, figur 2) viser, at baseline fNADH niveauerne stige i takt med cykluslængden forkortes. Når pacinghastighed er tæt på sinusrytme (CL = 300 ms) baseline fNADH niveau er relativt konstant. Som cykluslængde forkortes under 300 msek, baseline fNADH niveauet stiger, med den største stigning på den korteste CL (150 ms). Høj opløsning fNADH billeddannelse af fuld forreste overfladeved 200 og 400 bpm er vist i figur 3. fNADH niveauer på 200 bpm var konstant og rumligt ensartet. Ved 400 bpm, fNADH niveauer steg væsentligt i den epicardiet. Signifikant rumlige heterogenitet blev observeret med de største stigninger inden for de septumdefekter regioner i RV og LV.

Den fNADH signal oscillerer med sammentrækning (bevægelsesartifakt) og svingningsfrekvens svarer til hjertefrekvensen (figur 2). I biventrikulær kanylering er bunden af ​​hjertet holdt ved 4 kanyler, som hjælper til at forhindre kernen i at svinge under kontraktion. Derfor svingningsamplitude er altid mindre end længere tidsrum (5-10 sekunder) tendenser i fNADH der er forårsaget af iskæmi eller hypoxi.

Figur 1
Figur 1. Typiske tryk og monofasiske aktionspotentialer fra en isoleret biventrikulær arbejder rabbit hjertet. A. Basal afbildning af hjertet, der viser de fire kanyler: 1, aorta, 2, pulmonal, 3, venstre atrielle og 4, højre atrium B. Anterior afbildning af hjertet, der viser den venstre ventrikel (LV) og den højre ventrikel. (RV). C. Repræsentative pres. Top: tryk i venstre ventrikel (optrukket linje) og den aortiske tryk (stiplet linje). Nederst:. Pulmonal tryk D. Repræsentative monofasiske aktionspotentialer. Signalet er på linje med det pres, der er vist i panelet C. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. fNADH billeder af en isoleret biventrikulær arbejder kanin hjerte. Top: En tegneserie af synsfelt (venstre) og tre fNADH billeder vises. Den tilsvarende pacing cykluslængde (CL) er angivet på hvert billede.Området af interesse for fNADH signal i bundpanelet er angivet ved det røde felt. Spidsen af ​​monofasisk virkningspotentiale elektrode ses til højre i regionen af ​​interesse. Epicardiet blev belyst ved hjælp af kviksølvlampe og lysleder, som vist i figur 5. Kun den epikardiale overflade, der omgiver det område af interesse blev belyst Bund. Gennemsnitlig fNADH for regionen af interesse, er den røde felt i toppanelet. Gennemsnitlige fNADH stiger med reduceret cyklus længde.

Figur 3
Figur 3. fNADH billeder af fuld forreste overflade af en isoleret biventrikulær arbejder kaninhjerte. Hjertet blev pacet fra RA ved 200 bpm og 400 slag pr. fNADH blev afbildet (2 fps, 128x128 pixels med en opløsning på 0,4 mm), mens belyse hele forreste epicardiet med to high power lysdioder (Mightex PLS 0365 til 030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW maks.).

Discussion

Det isolerede Langendorff perfuseret hjerte er et fremtrædende værktøj til at studere kardial fysiologi 2. Det er især nyttigt ved undersøgelser af hjertearytmier, især dem som bruger fluorescensimagografi af transmembrane potentiale 20. En fordel er, at hele epicardiet af det isolerede hjerte kan observeres 21, 22. En anden fordel er, at i modsætning til blodet, er perfusion med en klar krystalloide pufferopløsning ikke interfererer med fluorescenssignaler. En begrænsning er, at Langendorff teknik ikke er velegnet til studier af hjerte metabolisme, hvilket ofte kræver hjertet for at udføre arbejde inden for rammerne af fysiologisk forbelastning og afterload tryk.

At højne relevansen af isolerede hjerte forberedelserne til metaboliske undersøgelser, Neely indført ændringer af Langendorff teknik til at etablere passende venstre ventrikel (LV) preload og afterload pres 3.Modellen er kendt som den isolerede LV arbejds hjerte model og er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere LV ydeevne og metabolisme 4-6. LV arbejde Hjertet model er overlegen i forhold til Langendorff model for funktionelle evalueringer, men det giver ikke en korrekt indlæst højre hjertekammer (RV). Demmy et al. første rapporterede en biventrikulær model (LV og RV) som en modifikation af LV bearbejdning hjertet model 7, 8. De fandt, at slagvolumen, minutvolumen, og tryk udvikling forbedret i hjerter konverteret fra arbejde LV mode til biventrikulær arbejde tilstand 8. En korrekt indlæst RV forbedrer også septal funktion ved at formindske unormale trykgradienter over septum. Biventrikulær arbejder hjerter har vist sig at opretholde aorta output, pulmonal flow, betyder aorta tryk betyder pulmonært blodtryk, hjertefrekvens og myocardial ATP og creatinphosphat niveauer op til 3 timer 8. Biventrikulær arbejder hjerte undersøgelser typisk bruge hjerter frabout små dyr, såsom rotter og kaniner, fordi minutvolumen og det påkrævede volumen af ​​perfusat er meget mindre end for hjertet i større dyr. Imidlertid har biventrikulær arbejder hjerte undersøgelser er udført med hjerter fra svin, hjørnetand, og endda mennesker 23, 24.

Den metaboliske efterspørgsel af isolerede hjerter i biventrikulær arbejde tilstand er betydeligt højere end Langendorff perfusion. Det er vigtigt, at perfusatet opløsningen giver tilstrækkelig oxygen og metabolisk substrat støtte biventricular hjertefunktion. Standard krystalloide pufferopløsninger, såsom Krebs-Henseleit 16, 17, 25 eller Tyrodes 26, 27, har oxygen opløseligheder så høj som 5,6 mg / L. Når disse opløsninger beluftet med carbogen (en gasblanding af 95% O2 og 5% CO 2) og indeholder passende metabolisk substrat (glucose, dextrose og / eller natriumpyruvat), de er egnede til biventrikulær arbejder hjerter slå på normal sinus satser (ca. 180 bpm for en kanin).

Metaboliske efterspørgslen stiger for hurtige rytmer og mængden af ​​ilt opløst i standard perfusates måske ikke være nok til fuldt ud at støtte en biventrikulær arbejder hjerte, der er ordregivende ved høje hastigheder. Krystalloide pufferopløsninger indeholdende erythrocytter eller blandede med helblod er blevet anvendt i arbejder hjerte præparater for at sikre tilstrækkelig oxygen til rådighed. Tidligere undersøgelser har vist, at tilsætning af erytrocytter med en Krebs-Henseleit-opløsning forbedret arbejdsmiljø hjertefunktion under stringente pacing protokoller og reducerede også forekomsten af ventrikulær fibrillering 16. En begrænsning ved hjælp af erythrocytter eller blandinger af helblod er, at hæmoglobin interfererer med bølgelængder, der anvendes til fluorescensimagografi 13. Andre substrater, såsom albumin, kan også tilsættes til perfusatet opløsninger at forlænge hjerte levedygtighed og reducere ødem 28.

Under fluorescensimagografi intensiteten af ​​excitationslyset skal være høj, og lysfordeling skal være ensartet. At opnå ensartet belysning er ikke altid let på grund af krumningen af ​​den epikardiale overflade. I vore undersøgelser. Vi billede fNADH ved filtrering lys (350 ± 25 nm) fra en kviksølvlampe En togrenet fiberoptisk lysleder anvendes til at dirigere det ultraviolette lys på epikardiale overflade. Ensartet belysning kan opnås ved passende positionering af de to output rørringe. UV LED lyskilder kan også anvendes, som vi har vist i figur 3. LED-kilder er relativt billig, så multiple kilder kunne inkorporeres i et billeddannende system. Lysdioder kan også tændes og slukkes ved høje hastigheder for at synkronisere excitationslyset med billede købet.

Fotoblegning af NADH bør minimeres 29 ved at reducere den tid væv belysning. Dette kan gøres ved at cykle belysningen til og fra med en elektronIC lukker og en lampe eller med en LED-belysning og en controller. Hvis belysning er synkroniseret med den cardiale cyklus, derefter fNADH billedoptagelse kan være begrænset til diastole, som ville reducere bevægelsesartifakt i fluorescenssignaler. Trigning belysning og billedoptagelse med et tryksignal, som LV-tryk, ville være en måde at gøre dette.

I vores undersøgelser har vi observeret, at ændringer i fNADH per tidsenhed kan være mere end 5x højere i 400 bpm end på 200 bpm. Dette indikerer, at hurtige rytmer hæve redoxtilstanden af ​​hjertet. Hvorvidt dette er forårsaget af hypoxia eller manglende evne af myocytter at oxidere NADH til NAD + hurtigt nok til at undgå akkumulering af NADH er stadig et ubesvarede spørgsmål.

Udførelsen af ​​en biventrikulær arbejde hjerte forberedelse er betinget af flere faktorer. En af de vigtigste er at fastsætte passende preload og afterload pres for at efterligne den fysiologiskevilkår, der er under efterforskning. Især skal LV afterload (aorta tryk) justeres til at repræsentere systemisk tryk. Hvis den er for høj, vil LV ikke være i stand til at overvinde trykket, hvilket resulterer i regurgitation. Trykket, der er for lav, vil påvirke koronar perfusion. LV forbelastning tryk (venstre atrielt tryk) bør også justeres for at tilvejebringe en ende diastoliske slutvolumen, der er passende for den eksperimentelle protokol.

fNADH billeddannelse af levende væv er en etableret måde fluorescensimagografi 13. Dets anvendelse til hjertevæv blev illustreret af Barlow og chance, når de rapporterede markante stigninger i fNADH inden for regionalt iskæmisk væv efter ligering af en koronarkar 14. Deres fNADH billeder blev optaget på film ved hjælp af en Fairchild oscilloskop kamera og UV flashfotografering. Coremans et al. uddybes dette koncept ved hjælp af NADH fluorescens / UV reflektans forhold til målee den metaboliske tilstand epicardiet af Langendorff blod-perfusionerede rottehjerter 30. En videofluorimeter blev brugt til billedbehandling og data blev optaget med en videooptager. Senere, Scholz et al. anvendes en spektrograf og fotodiodesæt at måle gennemsnitlige fNADH fra et stort område af LV. Denne fremgangsmåde reducerede virkningerne af epikardielle fluorescens heterogeniteter og lokale variationer i omløb samtidig med at afsløre makroskopiske arbejdsrelaterede variationer af fNADH 31. Denne fremgangsmåde svarer til computerressourcer gennemsnitlige fNADH niveauer for en region af interesse på tværs af alle rammer af en fNADH billeddannende datasæt, som illustreret i figur 2. Som vi har præsenteret i denne artikel, nutidens teknologi giver high-speed CCD-kameraer og digitalt styret high-power UV spotlights. Disse teknologier gør det muligt for spatiotemporal dynamik fNADH og hjerte-metabolisme, der skal undersøges fra mange nye perspektiver. Den relativt lave omkostninger af optik og lyskilde gør fNADH billeddannelse en nyttig tilbehør til konventionelle kardiale optiske kortlægningssystemer. 9, 32

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01-HL095828 til MW Kay).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S-3014
KCl Sigma-Aldrich P3911-500G
CaCl2 Fisher Scientific C77-500
MgSO4 Sigma-Aldrich M-7506
NaHCO3 Fisher Scientific S-233
KH2PO4 Fisher Scientific 423-316
Glucose Sigma-Aldrich 158968-500G
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart]. Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 Forthcoming.
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  3. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).
  4. Feng, H. Z., Jin, J. P. Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).
  5. Clemens, M. G., Forrester, T. Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia. J. Physiol. 312, 143-158 (1981).
  6. Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res. Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).
  7. Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart. J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).
  8. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).
  9. Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).
  10. Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations. Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).
  11. High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. 30th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, 1-4 (2008).
  12. Chance, B. Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria. Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).
  13. Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).
  14. Barlow, C. H., Chance, B. Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography. Science. 193, 909-910 (1976).
  15. Mayevsky, A., Chance, B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).
  16. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  17. Ôta, K., Peaker, M. Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output. Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).
  18. Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts. Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).
  19. Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH. Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).
  20. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ. Res. 95, 21-33 (2004).
  21. Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart. Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).
  22. Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J. Biomed. Opt. 12, 044019 (2007).
  23. Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. Isolated four-chamber working swine heart model. Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).
  24. Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. In vitro studies of human hearts. Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).
  25. Schenkman, K. A. Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).
  26. Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia. J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).
  27. Khatib, S. Y., Boyett, M. R. Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes. Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).
  28. Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts. J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).
  29. Combs, C. A., Balaban, R. S. Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP). Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).
  30. Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. (Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart. Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).
  31. Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts. Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).
  32. Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism. Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).

Comments

1 Comment

  1. This is an amazing video and resource! Thank you!

    Reply
    Posted by: stacy b.
    July 26, 2012 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics