Author Produced

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, og Vaginal Cytologisk Evaluation for Mouse estrale periode Staging Identifikation

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Her beskriver vi, hvordan man identificerer den fase af murine reproduktive (proestrus brunst, metestrus eller diestrus) ved simpel, ikke-invasiv indsamling og cytologisk vurdering af vaginal udstrygningsprøver. Vi beskriver endvidere, hvordan vaginal cytologi afspejler cirkulerende hormonelle niveauer underliggende overgang gennem den murine reproduktive cyklus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En hurtig måde at vurdere reproduktiv status hos gnavere er ikke kun nyttig i studiet af reproduktive dysfunktion, men er også nødvendigt for produktionen af ​​nye musemodeller for sygdommen og undersøgelser i den hormonale regulering af væv degeneration (eller regenerering) efter patologisk udfordring. Den murine reproduktiv (eller østrus) cyklus er opdelt i 4 faser: proestrus oestrus, metestrus og diestrus. Definerede udsving i cirkulerende niveauer af ovariesteroider 17-β-østradiol og progesteron, gonadotropinerne luteiniserende og follikelstimulerende hormoner, og luteotropic hormonet prolaktin signalovergang gennem disse reproduktive stadier. Ændringer i celle typologi i den murine skeden afspejler disse underliggende endokrine begivenheder. Daglig vurdering af det relative forhold mellem kerneholdige epitelceller, forhornede skæl-epitelceller og leukocytter forekommer i vaginale udstrygninger kan anvendes til at identificere muse østrustrin. Graden af ​​invasiv imidlertid anvendes til indsamling af disse prøver kan ændre reproduktionsstatus og fremkalder en inflammatorisk reaktion, kan forvirre cytologisk evaluering af udstrygninger. Her beskriver vi en enkel, ikke-invasiv protokol, som kan anvendes til at bestemme fase af estrale periode af en hun-mus uden at ændre sin reproduktive cyklus. Vi detaljer, hvordan at skelne mellem de fire faser af estrale cyklus ved indsamling og analyse af dominerende celle typologi i vaginale udstrygninger og vi viser hvordan disse ændringer kan fortolkes med hensyn til endokrin status.

Protocol

1. Klargøring Reagenser

  1. For steril vaginal lavage, autoklaver dobbelt destilleret vand (ddH 2 O) og opbevares i en tæt lukket beholder ved stuetemperatur indtil brug.
  2. For cytologisk evaluering, tilsættes 0,1 g krystalviolet pulver til 100 ml af DDH 2 O. Bland godt. Krystalviolet farvning (0,1%) kan opbevares i en tæt lukket beholder ved stuetemperatur indtil brug.

2. Indsamling vaginale celler (Vaginal Lavage)

  1. Placer en latex pære på enden af en steril 200 ul spids og udarbejde cirka 100 ul sterilt ddH 2 O ved hjælp af overgange på spidsen som en volumen retningslinje.
  2. Løft musen ud af sit bur og placere hende på buret tragt (låg) med hendes hind / bagende mod dig.
  3. Tag godt fat om halen og ophøje den bageste ende. Musen har nu kun hendes forpoter gribende tragten. På dette tidspunkt musen kan lade vandet. Hvis ja, Vente, indtil vandladning stopper. Skulle der være urin tilbage ved indgangen til skeden, kan du ønsker at skylle åbningen med overskud ddH 2 O ved hjælp af en separat spids (dvs. ikke din prøve samling tip).
  4. Anbring enden af ddH 2 O fyldt spids ved åbningen i vaginalkanalen idet man ikke trænge ind i åbningen som vaginal (og cervikal) stimulation kan inducere pseudodrægtighed i rotter 1,2. De seneste rapporter tyder på mus er mindre modtagelige for denne effekt ikke desto mindre skal sørges for at minimere graden af invasivitet i gentagne analyser 3.
  5. Tryk let pæren at udvise en fjerdedel til halvdelen af ​​den mængde vand (~ 25-50 pl) ved åbningen af ​​skeden. Væsken vil spontant aspireres ind i kanalen uden spids insertion. Slip langsomt presset på pæren. Væsken vil trække tilbage i spidsen. Undgå frigivelse af trykket for hurtigt at forebygge aspiration af væsketil pæren. En filtreret spids kan være nyttigt til dette formål.
  6. Gentag det foregående trin 4-5 gange med samme spids, pære, og fluidum til opnåelse af et tilstrækkeligt antal celler i en enkelt prøve.
  7. Placer væske på objektglas, og lade smøre helt tørre ved stuetemperatur. Når tør, kan disse østrus smears farves straks eller opbevares og farvet på et senere tidspunkt.

3. Cytologisk farvning med krystalviolet * 4

  1. Anbring den tørre objektglas i en Coplin krukke (eller tilsvarende farvning beholder) indeholdende krystalviolet farvning for 1 min.
  2. Flyt til en anden Coplin krukke indeholdende ddH 2 O. Vask objektglasset med Hedeselskabet 2 O i 1 min. Gentag.
  3. Fjern den overskydende ddH 2 O fra kanten af objektglasset med en lys-duty væv vinduesvisker, undgå kontakt med den farvede smear.
  4. Pipette cirka 15 pi af glycerol oven på smear og dæksletglide. Alternativt kan andre histologiske montering reagenser anvendes til opnåelse af en mere permanent, ikke-diffunderende farve.

* Farvningen her beskrevne fremgangsmåde er den enkleste fremgangsmåde, kan udføres på alle laboratorier. Andre metoder kan give yderligere oplysninger. For eksempel ved anvendelse af Papanicolaou-farvning kan løbetiden for kerneholdige epitelceller skelnes med mindre modne celler farves turkis og mere modne celler pink-eller orange-farvede. Disse forskelle kan anvendes til at afvikle tidlige og sene proøstrus. Fire

4. Vaginal cytologi

  1. Undersøg smøre under lysmikroskopi at bestemme celletyper til stede. Mikroskopisk undersøgelse bør ske umiddelbart efter farvning som krystalviolet vil diffundere fra cellerne over tid, når du bruger glycerol til dækglas. Mikrofotografier skal tages på tidspunktet for analysen at dokumentere cytologi.
  2. Start med at undersøge entire udstrygning ved en lavere forstørrelse. Vælg et repræsentativt område og flytte til en større forstørrelse. Man vil se forhornede skæl-epitelceller, leukocytter, og / eller kerneholdige epitelceller (repræsentative resultater, Figur 1A-C). Forholdet af celler til stede, vil give dig mulighed for at bestemme den østrus fase af musen på tidspunktet for prøvetagning (repræsentative resultater, figur 1D-G) og hendes umiddelbare hormonel status (diskussion, figur 2).

5. Repræsentative resultater

Cytologi: Tre primære celletyper kan detekteres i vaginale udstrygningsprøver: (1) kerneholdige epitelceller (figur 1A), (2) forhornede skæl-epitelceller (figur 1B), og (3) leukocytter (figur 1C). Kerneholdige epitelceller har en let farvet cytoplasma, mørkere farvede plasmamembran, og en oval kerne ( (Figur 1 B). Polymorfonukleære leukocytter kan skelnes fra epitelceller ved deres uregelmæssige form, mørktfarvede polymorfe kerner, og den lille størrelse (figur 1C, sorte pile). Bør urinen kontaminering være til stede i smear, er urinsyre krystaller lettere at bestemme ved deres krystallinske strukturer uens til enhver forventet celletyper (figur 3). Skulle dette ske, og obskure påvisning af dominerende celletype, skal smøre kasseres og ikke anvendes til mellemstationer formål.

Staging: Den relative forhold mellem celletyper observeret i udstrygningspræparater kan anvendes til at identificere det stadium af estrale periode på musen på dagen for prøveopsamling (figur 1D-G). Under proøstrus, er celler næsten udelukkendeklynger af runde, velformede nukleeret epithelceller (figur 1D, repræsentant celle angivet med hvid pil). Under brunst, celler overvejende forhornede pladeepitelceller, som findes i tætpakkede klynger (fig. 1E, repræsentant celle angivet med pilespids). Under metestrus, dominerer små mørktfarvede leukocytter (figur 1F, repræsentativ celle angivet med sort pil). Forhornede pladeepitelceller kan observeres, ofte i fragmenter (figur 1F, repræsentativ celle angivet med sort pil). Under diestrus, kan sjældne forhornede pladeepitelceller stadig være til stede (figur 1G, repræsentativ celle angivet med sort pil), men leukocytter stadig fremherskende (fig. 1G, repræsentativ celle angivet med sort pil). Metestrus kan skelnes fra diestrus ved fremkomsten af ​​kerneholdige epitelceller i diestrus ( g> Figur 1G, repræsentant celle angivet med hvid pil).

Figur 1
Figur 1. Cytologisk evaluering af vaginale udstrygninger kan anvendes til at identificere østrus fase tre hovedtyper af celler, påvises i vaginale udstrygningsprøver:. (A) kerneholdige epitelceller, (B) forhornede skæl-epitelceller, og (C) leukocytter. Forholdet mellem disse celletyper, der findes i smear kan anvendes til at identificere mus i (D) proøstrus, (E) oestrus, (F) metestrus, eller (g) diestrus som beskrevet i repræsentative resultater. Sorte pile i E, F og G peger på repræsentative forhornede skæl-epitelceller. Sorte pile i C, F og G peger på repræsentative leykocytes. Hvide pile i D og G highlight repræsentant nukleeret epitelceller.

. Jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Vaginal smøre cytologi afspejler underliggende endokrine begivenheder. Detaljer findes også i diskussionen. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Urinsyre krystaller kan være til stede efter krystalviolet farvning af urin-forurenede prøver. (A) Krystaller er gennemsigtige og kan være af forskellige størrelser (pile og boxed region forstørres i (B)). Ingen celler er til stede i dette område. Bør urinsyre krystal forurening i områder, der anvendes til cytologisk farvning være til stede, kan det være vanskeligt præcist at identificere celletyper stede og smøre skal kasseres. Scale bar = 50 | jm.

Discussion

Disse ændringer i celle typologi er tegn på underliggende endokrine begivenheder. Den proøstrus fase af estrale periode svarer til den humane follikulære fase af menstruationscyklen 5 og er afgrænset af en præ-ovulatoriske stigning i cirkulerende 17-β-østradiol 6, og en lille stigning i prolactin 7 (figur 2, proøstrus, venstre panel). Stigningen i 17-β-estradiol indirekte stimulerer gonadotropin-frigivende hormon neuroner i hypothalamus og septum, der på sin side aktiverer responsive celler i hypofyseforlappen at frigive luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon i kredsløbet 8,9 (figur 2 , proøstrus, venstre panel). I vaginale udstrygninger fra dyrene i proøstrus, er celler næsten udelukkende ovale kerneholdige epitelceller (figur 1D, figur 2, proøstrus, højre panel). Toppen i follikelstimulerende Hormen niveauer signaler ægløsning og trådt i brunst 10,11. Under oestrus, niveauer 17-β-østradiol falde, og prolactin-niveauer peak 6,7 (fig. 2, oestrus, venstre panel). Vaginale udstrygninger er karakteriseret ved næsten udelukkende påvisning af uregelmæssigt formede forhornede skæl-epitelceller ofte i klumper (figur 1E, figur 2, oestrus, højre panel). Træder i metestrus falder sammen med en fortsat stigning i progesteron hormon niveauer 6 og svarer til begyndelsen af human luteale fase 12 (fig. 2, Metestrus, venstre panel). Da progesteron niveauer begynde at stige, og der er en lille stigning i 17-β-østradiol som reaktion på corpus luteum aktivering 6,13,14 (fig. 2, Metestrus, venstre panel). De celletyper stede i vaginale udstrygninger i denne fase er fragmenterede, forhornede epithelceller og mindre mørkere farvede leukocytter (Figure 1F, figur 2, Metestrus, højre panel). Endelig træder i diestrus i mus forekommer og cirkulerende progesteron niveauer peak 6, svarende til den humane sen luteal fase 12. Regression af corpus luteum fører til en efterfølgende kraftigt fald i progesteronniveauer 15,16 (fig. 2, Diestrus, venstre panel). Leukocytter dominerer i udstrygningspræparater under diestrus. Frekvensen af forhornede epitelceller reduceres og kerneholdige epitelceller begynder at blive detekteret umiddelbart før overgangen til proestrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, højre panel).

Sammenfattende kan denne enkle, rutine protokol bruges til at vurdere daglige hormonelle svingninger og etablere østrus etape i forsøgsmus uden at ændre reproduktive status, hvis følgende forholdsregler er taget. Prøverne udtages højst en gang dagligt under anvendelse af ikke-invasive protokol described her sammenlignet med gentagen indtrængning i vaginalkanalen, aspiration, og omrøring. Dette kan forårsage vaginal irritation resulterer i en inflammatorisk respons 17 resulterer i leukocyter og andre celletyper til stede i udstrygningspræparater, som kan forvirre cytologisk evaluering. Selv i koloni opstaldede hunner, er det normalt at se udvidede diestrus og østrus stadier i forskellige mus samt induktion af anestrous 18 og denne identifikation er nyttig i fortolkningen af hormonal virkning i reproduktiv, køn og sygdom studier. Variation i cyklus længde er også indført med alderen og ved boliger forskelle i kolonier (individuel eller gruppe-kabinet) af hunner 7,19-21. Hunner huse i kvindedominerede kun kolonier kan ophøre cykling og indtaste en tilstand af langvarig diestrus 18,22,23 selvom cykling kan genindsættes ved udsættelse for bure forbehandlet med mandlig urin for at fremkalde cykling 24,25. Således, at etablere individual cykluslængder for en given mus, anbefales det, at de ikke-invasive vurderinger er beskrevet her udføres dagligt, med forsigtighed, indtil to fuldstændige cyklusser overholdes.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt. Alle forsøg på dyr blev udført i nøje overensstemmelse med de retningslinjer og regler, der er fastsat af universitetet i Ottawa Animal Care Udvalg og canadiske Råd om Animal Care.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Marc Leonard fra Carleton Overvældende Media Studio for sagkyndig teknisk bistand i videoproduktion og redigering og Dr. Martin Bertrand fra Carleton Overvældende Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium for visuel model assistance. Forfatterne takker eksperternes råd fra Dr. Marilyn Keaney og alle hendes engagerede personale ved University of Ottawa Animal Care og Veterinary Services. Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institute of Health Research (CIHR, MOP 62.826) til SALB, den CIHR Institute of Aging og Strategic Training Initiative i Health Research / CIHR Training Program i Neurodegenerative Lipidomics (TGF 96.121) til SALB og SF, Canadian Foundation for Innovation til SF, Ontario Innovation Trust til SF, og Autodesk Research til SF. ACM modtager en CIHR Banting og Best ph.d. pris. NV modtager en post-professionel stipendium fra Institut for Aging og CIHR Training Program i Neurodegenerative Lipidomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
  2. Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
  3. Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
  4. Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
  5. Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
  6. Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
  7. Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
  8. Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
  9. Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
  10. Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
  11. Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
  12. Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. 124-229 (2011).
  13. Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
  14. Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
  15. Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
  16. Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
  17. Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
  18. Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
  19. Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
  20. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
  21. Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
  22. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
  23. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
  24. Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
  25. Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics