MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina. Células estaminais embrionárias humanas são artefatos da cultura celular, e tendem a adquirir anormalidades cariotípicas com duplicações populacional. Passaging adequada é essencial para manter uma alimentação saudável, indiferenciado, tons karyotypically normais embrionárias humanas de cultura de células-tronco. Primeiro, uma cultura em expansão é lavado em PBS para remover a mídia residuais e restos celulares, em seguida, as células são cobertas com um volume mínimo de 0,05% quente Tripsina-EDTA. Tripsina é deixado sobre as células por até cinco minutos, e depois as células são delicadamente desalojado com uma pipeta 2 mL sorológicos. A suspensão de células é coletada e misturada com um grande volume de mídia matizes, em seguida, as células são coletadas por centrifugação suave. A mistura de tripsina inativada mídia é removido e as células ressuspendidas em meio pré-aquecido matizes. Uma razão de separação adequada é calculada (geralmente 1:10 - 1:20), e células re-banhado em uma placa 1-2 dia de idade contendo uma monocamada de células irradiadas do mouse alimentador embrionárias fibroblastos. A placa de cultura recém-semeado matizes é deixado em repouso por 48 horas, então a mídia é trocada a cada dia depois disso. É importante não trpsinize para baixo a uma suspensão de células individuais, pois isso aumenta o risco de introdução de anormalidades cariotípicas.

Protocol

Geral

Recomendamos descongelamento não mais do que uma amostra em um determinado momento para garantir uma fácil manipulação. O manipulador deve tomar cuidado para não deixar culturas à temperatura ambiente e baixas emissões de CO2 por longos períodos de tempo. Todos os centrifugação de células vivas é feito em 500-600 xg por 5 min à temperatura ambiente.

MEFs (células embrionárias de camundongos Feeder)

  1. Pré-aquecer media MEF a 37 ° C. Remover o frasco MEF de -80 ° C e imediatamente mergulhe a metade inferior do tubo em banho-maria a 37 ° C. Deve ter cerca de 30-45 segundos antes de as células são descongeladas 80% (porção pequena congelados esquerda).
  2. Rapidamente trazer o tubo para a capela de fluxo laminar, lavar com álcool a 70%, e de transferência de células pré-aquecido mídia.
  3. Aspirar a solução de gelatina a partir de chapas preparado anteriormente.
  4. Alíquota de 2 ml de solução de MEF em uma queda de maneira sábia em cada um dos seis poços. Certifique-se de distribuir o MEFs uniformemente sobre o bem. Data da placa MEF, e coloque em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para permitir MEFs para anexar ao prato.
  5. Após 6 horas MEFs será anexado ao prato. É melhor usar placas MEF 24-48 horas após o plaqueamento. NÃO use uma placa MEF que tem mais de 4 dias de idade.
  6. Pré-aquecer meios tons e 0,05% Tripsina / EDTA a 37 ° C Sob o capô, prelabel um tubo estéril 50 ml.
  7. Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação tonalidades da cultura a ser dividida. Delicadamente, lave os poços com 2ml de solução de 1X tampão fosfato (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 0,75 ml 0,05% Tripsina / EDTA para o bem.
  8. Substituir a tampa, e observar as células sob a ampliação de 4x. O MEFs redor das colônias MATIZ deve começar a retrair. Quando o MEFs são suficientemente arredondadas e as fronteiras das colônias tons são ásperas, devolver o prato para o capô. Este processo deve levar cerca de 5 minutos, absolutamente não mais que 10 minutos ou suas células não vai voltar a crescer.
  9. Pipeta suavemente para cima e para baixo, lavando o fundo do poço, até que a monocamada MEF foi completamente isolada (monocamada é pegajoso e podem permanecer em uma única peça).
  10. Transferir a suspensão celular a um tubo de 50 ml contendo mídia adicional matizes. Girar o tubo de células 500xg por 5 minutos, Aspirar fora da mídia, tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
  11. A placa em um novo prato de MEFs, adicionar o volume adequado de células para determinada mídia adicional matizes, e pipetar a solução 5-7 vezes com uma pipeta automática.
  12. Remova a mídia MEF de uma placa fresca de MEFs.
  13. Alíquota a queda solução MATIZ sábio para cada poço, certificando-se de distribuir as gotas uniformemente sobre o bem. Sem agitar o prato, cuidadosamente as células voltem ao a 37 ° C durante a noite para deixar incubadora MATIZ semente colônias.
  14. MATIZ células saindo de uma separação deve se comportar de forma semelhante aos saindo de um degelo.

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Discussion

Neste vídeo demonstramos como nós MATIZ rotineiramente passagem humana linhas de células-tronco embrionárias em nosso laboratório. Divisão eficiente e regular e passaging é essencial para manter uma saudável linha de células estaminais embrionárias humanas. Tripsina passagem mediada é uma vantagem significativa de linhas de células MATIZ, no entanto, é importante não para mais de trypsinize culturas ou ter uma grande proporção de células isoladas durante a re-tecendo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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