Optogenetic Aktivering av zebrafisk somatosensoriska nervceller med kock-tdTomato

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Optogenetic tekniker har gjort det möjligt att studera bidrag specifika nervceller till beteende. Vi beskriver en metod i larver zebrafisk för att aktivera enskilda somatosensoriska neuroner som uttrycker en channelrhodopsin variant (Chef) med en diod-pumpad solid state (DPSS) laser och registrering av framkallade beteenden med en snabb videokamera.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (71), e50184, doi:10.3791/50184 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Larv zebrafisk framträder som en modell för att beskriva utvecklingen och funktionen av enkla neurala kretsar. På grund av deras yttre befruktning, snabb utveckling, och genomskinlighet är zebrafisk särskilt väl lämpade för optogenetic metoder för att undersöka neurala kretsen funktion. I detta tillvägagångssätt, är ljuskänsliga jonkanaler uttryckt i specifika neuroner, gör det möjligt för försöksledaren att aktivera eller inhibera dem efter behag och på så sätt bedöma deras bidrag till specifika beteenden. Tillämpa dessa metoder larver zebrafisk är konceptuellt enkel men kräver optimering av tekniska detaljer. Här visar vi ett förfarande för att uttrycka en channelrhodopsin variant i larver zebrafisk somatosensoriska nervceller, foto-aktiverande enstaka celler och spela de resulterande beteenden. Genom att införa några ändringar i tidigare etablerade metoder, skulle detta tillvägagångssätt kunna användas för att framkalla beteendemässiga svar från enskilda nervceller aktiveras upptill minst 4 dagar efter befruktning (DPF). Specifikt skapade vi en transgen med en somatosensoriska neuron förstärkare, CREST3 att driva uttrycket av den märkta channelrhodopsin varianten, kock-tdTomato. Injicerar detta transgen i 1-cellstadiet embryon resulterar i mosaik expression i somatosensoriska neuroner, som kan avbildas med konfokalmikroskopi. Lysande identifierade celler i dessa djur med ljus från en 473 nm DPSS laser, styrs via en fiberoptisk kabel, framkallar beteenden som kan spelas in med en snabb videokamera och analyseras kvantitativt. Denna teknik skulle kunna anpassas för att studera beteenden som framkallas genom att aktivera någon zebrafisk neuron. Kombinera detta tillvägagångssätt med genetiska eller farmakologiska störningar kommer att bli ett effektivt sätt att undersöka kretsen bildning och funktion.

Introduction

Utvecklingen av optogenetic metoder för att främja eller hämma neuronal retbarhet med definierade våglängder av ljus har gjort det möjligt att studera funktionen av olika populationer av nervceller i nervbanor kontrollerande beteende 1, 19, 21. Denna teknik används ofta för att aktivera grupper av neuroner, men den kan också användas för att aktivera enskilda neuroner. Zebrafisk larver är särskilt mottagliga för dessa metoder eftersom de är genomskinliga, utvecklar deras nervsystem snabbt och skapa transgena djur är snabb och rutin. Måste emellertid stora tekniska hinder övervinnas för att tillförlitligt uppnå enda neuron aktivering.

För att optimera ett förfarande för optogenetic aktivering av enstaka zebrafisk nervceller har vi fokuserat på somatosensoriska nervceller. Zebrafisk larver upptäcka en mängd somatosensoriska stimuli med två populationer av nervceller: trigeminala neuroner, som innerverar huvudet och Rohon-Beard (RB) neuroner, som innerverar resten av kroppen. Varje trigeminus och RB neuron projicerar en perifer axonet som filialer mycket i huden för att upptäcka stimuli och en central axon som ansluter till nedströms nervbanor. Djur reagerar röra så tidigt som 21 timmar efter befruktning (HPF), vilket tyder på att sammanhängande somatosensoriska kretsar har bildat 5, 18. Under larvutveckling åtminstone några trigeminus och RB nervceller synaps på Mauthner cellen att aktivera klassiska fly svar, men ackumulera tyder på att det finns flera klasser av somatosensoriska nervceller med olika mönster av anslutning som kan framkalla variationer på flykt beteende 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vår motivation för att utveckla denna metod var att karakterisera beteende funktionen hos olika klasser av somatosensoriska nervceller, men detta tillvägagångssätt kan i princip användas för att studera funktionen av nästan alla neuron eller population av nervceller i larval zebrafisk.

Douglass et al. Tidigare beskrivits ett förfarande för aktivering Channelrhodopsin-2-uttryckande somatosensoriska neuroner med blått ljus, framkalla flykt beteende 3. Deras metod använde ett förstärkarelement från isl1 genen för att driva expression av ChR2-EYFP i somatosensoriska neuroner. Denna transgen dock rapporterades att visa relativt svag fluorescens, vilket kräver samtidig injektion av en andra reporter, till UAS :: GFP, tillåta visualisering av celler som uttrycker ChR2-EYFP. Detta tillvägagångssätt användes för att framkalla beteende svar mellan 24-48 HPF, men kunde aldrig framkalla en reaktion förbi 72 HPF. Medan denna metod fungerar för att studera neurala kretsar i mycket tidiga larvstadier (24-48 HPF) är det otillräckligt för att karakterisera nervbanor och beteende hos i äldre larver, när olika beteendemässiga svar är uppenbara och nervbanor är mer mogen.

Vi försökteförbättra känsligheten av denna teknik för att karakterisera funktionen hos subpopulationer av larver RB neuroner. För att förbättra uttryck vi använde en somatosensoriska-specifik förstärkare (CREST3) 20 för att driva expression av LexA-VP16 och en sträcka av LexA operatorsekvenser (4xLexAop) 11 för att amplifiera expression av en fluorescent märkt ljusaktiverat kanal. Denna konfiguration förstärkt uttryck av kanalen, vilket eliminerar behovet av att samuttrycka en andra reporter och tillåter oss att direkt bestämma den relativa abundansen av kanalen i varje neuron. Använda LexA / LexAop sekvens hade den extra fördelen av att tillåta oss att införa transgenen i zebrafisk reporter linjer som använder Gal4/UAS systemet. Transient uttryck av denna transgen resulterade i varierande nivåer av expression, men var vanligtvis tillräckligt robust för att visualisera både cellkroppen och axonala projektioner av enskilda neuroner under flera dagar. För att optimera känslighet att tända vi använde ljuset aktiverade kanalen Chef, en channelrhodopsin variant bestående av en chimär av channelopsin-1 (Chop1) och channelopsin-2 (Chop2) med en crossover webbplats på helix loop EF 13. Denna kanal aktiveras vid samma våglängd som ChR2, men kräver lägre ljusintensitet för aktivering, vilket gör den mer känslig än andra vanligen använda kanaler, inklusive ChR2. Kocken proteinet sammansmält med röda fluorescerande proteinet, tdTomato, vilket gör att vi för att screena för proteinuttryck utan att aktivera kanalen. Som en ljuskälla, använde vi en diodpumpade solid-state (DPSS) laser kopplad till en fiberoptisk kabel för att leverera en exakt, kraftfull puls av blått ljus till en specifik region av larverna. Detta tillät oss att fokusera laserljus på enskilda neuroner, vilket eliminerar behovet av att finna sällsynta transgena djur som uttrycker kanalen i en enda neuron. Med hjälp av denna metod, kunde vi aktivera enskilda RB nervceller, spela beteende svars med en snabb videokamera och bild de aktiverade neuroner med hög upplösning med konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Förbered följande i förväg.

1. Förbered Optic Cable

  1. Skapa en lagringsenhet för den optiska kabeln genom smältning av avsmalnande halsen på en glas Pasteur-pipett över en bunsenbrännare för att skapa en ~ 150 ° vinkel.
  2. Med hjälp av en avbitartång eller ett rakblad, försiktigt skära den optiska kabeln i två delar. Varje bit ska ha en ände med en FC / PC-adapter och en exponerad ände. Lagra ett stycke som reserv-kabel.
  3. Skala den optiska kabeln ner till kapseln genom att avlägsna fibern manteln och fibrerna förstärkning (Figur 1A) från 5,0 cm skuren ände av kabeln.
  4. Sätt optisk kabel till förberedda Pasteurpipett. Kontrollera kabel lätt kan röra sig in och ut ur pipettspetsen.
  5. Med optisk kabel sticker ut från toppen av Pasteurpipett försiktigt skära och ta bort fibermantel från runt glasfiber, ~ 2 mm från skurna änden.
  6. Med hjälp av en diamant penna / glas kutter, glasfiber nick och bryta off slutet för att skapa ett rent snitt / yta vid slutet av fibern (Figur 1B).
  7. Dra in optisk kabel till Pasteurpipett för lagring. Upprepa steg (1,6) om spets optisk fiber blir flisas eller raster ojämnt.
  8. Ställning optisk kabel i pasteurpipett med en mikromanipulator (figur 1C).

Förfaranden 2-8 beskriver en metod för att injicera transgener i embryon som allmänt tillämpas på många zebrafisk experiment. Variationer av denna metod, såsom de som beskrivs i andra Jove filmer 6, 7, 8, 9, 22 är lika effektiva.

2. Dra injektionsnålar

  1. Med hjälp av en nål avdragare, dra borosilikatglas rör i två injektionsnålar med en gradvis avsmalnande spets. Puller inställningar varierar. (På en Sutter Instrument nål avdragare använder vi inställningar: P = 500, Värme = 720, Pull = 50, hastighet = 70 och tid = 150). Varje nål avdragare är olika, så optimera puller inställningar empirically. För mer avsmalnande nålar, öka värmen och / eller dra. För mindre koniska nålar, öka Tid och / eller minska Pull.
  2. Förvara nålar i en säker behållare (dvs. en petriskål med rullad tejp, lim sidan ut).

3. Häll sprutformar

  1. Smält 0,5 g agaros i 30 ml embryo / blått vatten, tills agaros har helt upplöst.
  2. Häll in undre halvan av en petriskål.
  3. Placera rektangulär form med montering brunnar (figur 2) i agaros, var noga med att begränsa bubbelbildning runt brunnarna.
  4. Låt agaros stelna.
  5. Ta bort mögel och fyll Petriskål med blå / embryo vatten.
  6. Förvaras upprätt, fylld med rent vatten, vid rumstemperatur under samma dag användning eller vid 4 ° C för framtida användning.

4. Gör Plasmid-DNA Mix för injektionsvätskor

  1. Späd plasmid-DNA till en koncentration av 50 ng / pl med 1:10 fenolrött i DDH 2 O. Förexempel:
    1,0 ml plasmid-DNA (250 ng / ml)
    0,5 ml fenolrött
    3,5 ml DDH 2 O
  2. DNA-blandningen kan förvaras vid rumstemperatur om använder omedelbart eller lagras vid 4 ° C under flera dagar.

5. Ställ in Parning Par

Detta bör göras på kvällen innan du planerar att göra injektioner.

  1. Fyll avel tankar med system vatten och placera manliga och kvinnliga fisk tillsammans. Om injektioner inte kan utföras så snart som tänds i anläggningen, separat manliga och kvinnliga fisk med en avdelare.

6. Förbered för injektioner (Kan göras i väntan på embryon)

  1. Slå på tryck injektor rigg. Kontrollera att systemet är inställt på Puls. Börja med pulslängden satt till 1.
  2. Slå på luftventilen ochjustera trycket injektorn till ~ 20 psi.
  3. Med hjälp av en dissekera omfattning på högsta förstoring, bryta spets nål med pincett eller en poker för att skapa en ~ 2 nm öppning (figur 3, film 1).
  4. Fyll nålar med DNA mix av: 1. Placera nålen, spetsen uppåt, in i DNA-blandningen och låta nålen fylla genom kapillärverkan eller 2. Med hjälp av en lång räckvidd tips till pipettera 1-2 ul av DNA blandas direkt i nålen.
  5. Plats fylld nål på ett säkert ställe tills den ska injicera.

7. Samla Embryon

  1. Efter anläggningen lampor har aktiverat, ta bort avdelare (om tillämpligt). Samla embryon med en sil / liten sil och överföra dem till en petriskål med färsk blå / embryo vatten.

8. Injicera Embryon vid 1-2 cellstadiet

  1. Överför skördade embryon till sprutformar med en plast pipett.
  2. Med hjälp av en dissekera mikroskop, tryck försiktigt embryon ibrunnar med pincett eller en trubbig poker (Figur 4, Film 2).
  3. Placera laddade nålen i en mikromanipulator och position över embryon.
  4. Kalibrera injektionsvolym genom att justera pulslängden i 1-steg steg tills du uppnår önskad volym (~ 1 NL). Detta kan kalibreras med en mikrometer bild, såsom beskrivs i en tidigare Jove filmer 8, 22, men för detta experiment precisionen inte är nödvändig, eftersom ett brett spektrum av injektionsvolymer kommer att resultera i adekvat uttryck.
  5. Injicera ~ 1 nl DNA blandas direkt in i cellen och upprepa för alla embryon. DNA kan också injiceras i äggulan, men detta tenderar att vara mindre effektiva (figur 5, film 3).
  6. Ta injicerade embryon från mögel med en mild ström av blå / embryo vatten.
  7. Lagra injicerade embryon vid 28,5 ° C i mörker.
  8. Ta obefruktade, skadade eller döda embryon med jämna mellanrum.
  9. Behandla embryon wie PTU mellan 18-24 HPF för att förhindra pigmentering.

9. Skärm för transgenexpression

  1. Manuellt dechorionate 24-48 HPF embryon med pincett.
  2. Söva larver användning 0,02% tricaine.
  3. Med hjälp av en fluorescerande dissekeringsmikroskop, identifiera larver med RB eller trigeminal neuron uttryck och överföra dessa till en ny maträtt med färska PTU blå / embryo vatten. Embryon med gles uttryck i lätt identifierbara celler är optimala, men enskilda neuroner riktas för aktivering med en fiberoptisk kabel så att en rad av uttryck densitet är godtagbart.
  4. Lagra embryon vid 28,5 ° C i mörker tills önskat experimentstadiet.

10. Montera Larv för beteende experiment

  1. Gör 1,5% låg smältpunkt agaros i DDH 2 O och förvara i en 42 ° C värmeblock för att hindra den från att stelna.
  2. Med hjälp av ett glas Pasteurpipett, överföring en av pre-skärmad larver i ett badkare av 1,5% låg smältpunkt agaros med så lite blå / embryo vatten som möjligt.
  3. Överför larver i en droppe av agaros till en liten petriskål.
  4. Under ett dissektionsmikroskop, läge larv rygg upp.
  5. När agaros har stelnat, skär bort agarosen med en tunn rakblad (# 11 skalpell), vilket ger en kil av agar runt hela larven.
  6. Gör två diagonala snitt på vardera sidan av äggula, se till att inte nick larven.
  7. Fyll området kring agaros med embryot / blå vatten.
  8. Dra agaros bort från stammen och svans av larven (Figur 6).

11. Förbered höghastighetskamera och bilduppbyggnad

  1. Montera höghastighetskamera på dissekera omfattning.
  2. Anslut kameran till datorn.
  3. Slå på datorn.
  4. Aktivera höghastighetskamera.
  5. Öppna video / bildprogram (Vi använder AOS bildbehandlingsprogram och kommer att beskriva hur man använder det här, men andra avbildningprogramvara är lika acceptabelt).
  6. Justera kamerainställningarna sätt (dvs. 1.000 bilder per sekund (fps), 50% trigger buffert eller andra inställningar).
  7. Starta inspelningen.

12. Aktivera Enstaka neuroner Använda en 473 nm laser

  1. Bifoga stimulatorn, laser och optisk kabel.
  2. Slå på stimulatorn.
  3. Ställ stimulatorn till maximalt 5 volt och en pulsvaraktighet av 5 ms.
  4. Slå på lasern enligt tillverkarens anvisningar.
  5. Använd ett dissektionsmikroskop för att placera spetsen av den optiska kabeln nära cellkroppen av en neuron med kock-tdTomato expressionen (Figur 6).
  6. Leverera puls av blått ljus för att aktivera sensoriska neuron.
  7. Spela in beteende med hjälp av en höghastighetskamera inställd på 500 eller 1.000 bilder per sekund.
  8. Upprepa experiment som önskas, väntar 1 minut mellan varje aktivering för att undvika tillvänjning. (Vi registrerar minst tre svar för varje neuron).
  9. TillRelease larver, bända isär agaros med pincett, noga med att inte skada djuret. Detta djur kan tillåtas att vidareutveckla och proceduren kan upprepas i en äldre stadium att karakterisera utvecklingen av beteendet. Embryot kan också återmonteras för högupplöst konfokal avbildning av den aktiverade cellen att korrelera beteende med cellstruktur, såsom beskrivs nedan.
  10. Överför larv till odlingsplatta med färsk blå / embryo vatten. Vi använder en 24-brunnars platta för att hålla reda på enskilda larver.

13. Bild Neuron (er) med ett konfokalmikroskop

  1. Söva larver med 0,02% tricaine.
  2. Mount larver, ryggsidan uppåt i 1,2% låg smältpunkt agaros eller i en dorsal form.
  3. Bild Chef-tdTomato nervceller med en 543 nm laser och lämpligt filter och mål. Vi använder en 20x objektiv.
  4. Ta larver från agaros och återgå till individ väl med blå / embryo vatten.
  5. Lagra vid 28,5 ° C i mörker för further analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1
Figur 1. Optisk kabel inrättas. (A) Skikt av en fiberoptisk kabel. (B) Stripped fiberoptisk kabel i en Pasteur-pipett. (C) Fiberoptisk kabel i Pasteurpipett placerade med en mikromanipulator.

Figur 2
Figur 2. Sprutform mall.

Figur 3
Figur 3. (Film 1). Breaking nålen.

Figur 4
Figur 4. (Film 2). Placering embryon i sprutformen.

ther.within-page = "alltid"> Figur 5
Figur 5. (Film 3). Injektion 1 nl DNA blanda i 1-cell stadium embryo.

Figur 6
Figur 6. Diagram över en monterade zebrafisk larv och neuroner representativa inblandade i larver anslagskänsligheten. Zebrafisk larver delvis monterade i 1,5% låg smältpunkt agaros (representerad av streckade linjer kring rostral delen av larven). En trigeminal neuron (i huvudet) och en Rohon-Beard neuron (i bagageutrymmet) visas i rött. Mauthner celler beskrivs med streckade linjer i larven. Den optiska kabeln (vit) visas placerad över RB neuron cellkroppen.

oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Bild 7 "FO: content-width =" 5in "FO: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figur 7. (Film 4). Aktivering av en enda RB neuron expressingChEF framkallar en beteendevetenskaplig svar. (A) stillbilder som visar aktivering av en enda RB neuron uttrycker kock-tdTomato. Enstaka neuroner aktiverades genom en 5 ms puls från en 473 nm blå laser via en 200 | im fiberoptisk kabel. Spänning driver blå laser sattes till högst 5 volt. Den resulterande beteendet registrerades vid 1.000 bilder per sekund med en höghastighetskamera. (B) konfokalmikroskopi användes för att bilden av den aktiverade RB neuron. Pilen visar området stimuleras beteende stillbilder. (C) Förstorad bild av RB neuron anges i (B). Skalstock, 100 um. (Film 5 och 6) Samma fisk (Film 5) trigeminal aktivering (Film 6) RB neuron över äggula förlängning.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.

Figur 8
Figur 8. Latens av beteende under varierande förhållanden. För de flesta experimenten vi aktiverade en enda neuron i ~ 35 HPF larver uttrycker kock-tdTomato med 5 ms puls från en 473 nm blå laser som drivs av en 5 V-strömkälla (Figur 6). För att bättre förstå dynamiken i Chef aktivering, varierade vi parametrar för att bestämma deras effekt på beteendet. (A) längd lätta stimulering (5 ms jämfört 10 ms) inte påverkar latency när kvantifieras från början ljuspuls. (B) Vid ~ 35 HPF påverkar spänningen omvänt latens. Lägre spänningar resulterade i en ökning i latens av rörelse. För våra experiment använde vi den maximala spänningen (5 V) permissible för vår laseranordning, som framkallade ett tillförlitligt stereotypa beteenden från de flesta ljust-uttryckande RB neuroner.

Figur 9
Figur 9. (Film 7). Aktivering av kock-tdTomato uttrycker RB nervceller i 60 HPF larver. (A) stillbilder som visar aktivering av RB neuroner som uttrycker kock-tdTomato med 10 msek puls från en 473 nm blå laser via en 200 nm fiberoptisk kabel. Den resulterande beteendet registrerades vid 1.000 bilder per sekund med en höghastighetskamera. (B) Konfokal mikroskopi användes för att avbilda aktiverade RB neuronen (er). Pilen visar området stimuleras beteende stillbilder. Skalstock, 100 um.

Figur 10 o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figur 10. (Film 8). Aktivering av kock-tdTomato uttrycker RB nervceller i 4 dpf larver. Stillbilder som visar aktivering av RB neuroner som uttrycker kock-tdTomato med 20 ms puls från en 473 nm blå laser via en 200 nm fiberoptisk kabel. Den resulterande beteendet registrerades vid 1.000 bilder per sekund med en höghastighetskamera.

Film 1. Klicka här för att se filmen .

Film 2. Klicka här för att se filmen .

Film 3. Klicka här för att se filmen .

Film 4.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.

Film 5. Klicka här för att se filmen .

Film 6. Klicka här för att se filmen .

Film 7. Klicka här för att se filmen .

Film 8. Klicka här för att se filmen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit ett tillvägagångssätt för optogenetic aktivering av enstaka RB nervceller i levande zebrafisk. Vår metod använder övergående transgenes att uttrycka en fluorescerande taggade channelrhodopsin variant, kock-tdTomato 13 i särskilda somatosensoriska nervceller. Denna strategi skulle lätt kunna anpassas för användning i andra larver populationer zebrafisk cell.

Med hjälp av denna metod vi framkallade konsekvent beteende hos 34 till 48 HPF larver uttrycker kock-tdTomato. Med hjälp av en 5 ms puls av blått ljus vid 5 V, kunde vi aktivera enskilda RB nervceller (Figur 7). Genom att placera den optiska fibern vid olika punkter längs djuret, fann vi att det var nödvändigt att sikta det blå ljuset direkt på en cellkropp att framkalla en respons beteende. Ljuspulser inte framkalla ett svar från larver som inte uttrycka kock. Dessutom framkallade ljuspulser längs centrala axonet eller den perifera axonet aldrig ett svar, even i unga larver (data ej visade). Den här egenskapen var fördelaktigt eftersom vi kunde tryggt aktiverar enstaka nervceller hos djur där flera neuroner märkta, även om de centrala axoner av andra nervceller passerade nära riktade neuron cell kropp (film 4-6).

För att testa tillförlitligheten i metoden för att bedöma kinematiska parametrar, bestämd vi latensen av flykt svar (tiden från ljusaktivering till beteendemässiga svar) mellan 40 och 48 HPF, en parameter som är känt för att vara mycket stereotyp. För att bestämma om varaktigheten av ljus stimulans påverkar neuron aktivering upplyst vi riktar neuroner för 5 eller 10 msek (figur 8A). Eftersom den beteendemässiga latensen i båda förhållandena var samma beräknat från början av ljuspulsen, drog vi slutsatsen att varaktigheten av ljuspulsen påverkade inte latens av beteende. Men vi tycker att minska spänningen ökade ee latens av ett beteende (figur 8B). Vid 5 V, dock många svar (9 av 16 fiskar) var 20 ± 5 ms, liknande latens rapporterats för naturliga fly svar. Sålunda, aktiverande neuroner med 5 V närmar maximal aktivering.

Parametrar för effektivt framkalla beteendemässiga responser från att aktivera enskilda RB neuroner varierade i äldre larver. Vi framkallade framgångsrikt beteende hos från djur lika gammal som 4 dpf, väsentligen senare än tidigare rapporterats. Men medan aktivering av enstaka RB nervceller med 5 ms ljuspuls vid 5 V resulterade konsekvent i en beteendevetenskaplig svar före 48 HPF, aktivering av äldre larver (> 60 HPF) var inte lika konsekvent. Längre pulser (10-100 ms) av ljus var ofta nödvändigt att aktivera neuroner i äldre larver (figur 9 och 10, film 7 och 8, respektive). Därför kan aktivering parametrar behöveroptimeras / kalibreras utifrån experimentstadiet.

Det tillvägagångssätt vi beskriver här kan användas för många potentiella tillämpningar. Vi använder denna metod för att definiera de beteendemässiga reaktioner som olika subtyper av nervceller, men det kan också användas för att karakterisera utvecklingen av beteendemässiga responser som djuret mognar, effekterna av droger eller mutanter på beteendet, eller i kombination med fysiologi eller avbildning för att karakterisera nedströms aktiveras genom en identifierad neuron. Omvänt kan hämmande kanaler såsom halorhodopsin, användas för att inhibera specifika neuroner inom ett neuralt nätverk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har något konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Vi tackar Fumi Kubo, Tod Thiele och HerwigBaier (UCSF / Max Planck-institutet) för råd om beteende experiment och DPSS laser inrättats, Heesoo Kim och Chiara Cerri från MBL neurobiologi kurs för att hjälpa till Chef-tdTomato experiment, PetronellaKettunen (Göteborgs universitet ) för första samarbete kring optogenetic experiment, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca och John Milligan (UCLA) för teknisk rådgivning, och Roger Tsien (UCSD) för kock-tdTomato konstruktion. Detta arbete stöddes av en NRSA (5F31NS064817) utmärkelse till AMSP och ett bidrag från NSF (RIG: 0.819.010) till AS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Glass Pasteur pipette Fisher 1367820B or equivalent (10-15 mm diameter)
200 μm optic fiber ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
Adjustable Stripping Tool ThorLabs AFS900 or Three-Hole Stripping Tool (FTS4)
Diamond Wedge scribe ThorLabs S90W
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 or equivalent
Borosilicate glass tubing with filament Sutter Instruments BF-100-78-10
Injection mold n/a n/a Figure 5
1.5 ml centrifuge tubes Any Any
Petri dish (100x15 mm) Any Any
Petri dish (60x15 mm) Any Any
Pressure injector ASI MPPI-3 or equivalent
Micromanipulator and metal stand Narashige M152 or equivalent
Disposable plastic pipettes Fisherbrand 13-711-7 or equivalent
Poker (Pin holder and Insect pin) Fine Science Tools, Inc. 26018-17 and 26000-70 or equivalent
Forceps Fine Science Tools, Inc. 11255-20 or equivalent
Microloader pipette tips Eppendorf 9300001007
28.5 °C incubator any any
42 °C heat block Any Any
Non-Sterile scalpel blades #11 Fine Scientific Tools, Inc. 10011-00 or equivalent
Dissecting scope Zeiss Stemi or equivalent
Fluorescent dissecting scope with standard filter Any any or equivalent
Confocal microscope Zeiss LSM 510 or 710 or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives
High speed camera AOS Technologies, Inc. X-PRI (130025-10) or equivalent
473 nm portable laser Crystal lasers CL-473-050 or higher power, with TTL option
S48 Stimulator Astro-Med, Inc. Grass Instrument division S48K or equivalent
FC/PC to FC/PC mating sleeve ThorLabs ADAFC1 May need for optic cable connection
Laser Safety Glasses ThorLabs LG10 or equivalent
24 culture plates Genesee 25-102 or equivalent
Single depression slides Fisher S175201 Or equivalent
Reagent
Instant ocean Aquatic Ecosystems IS50
Methylene blue Fisher S71325
Phenol red Sigma P4758
Agarose EMD 2125 or equivalent
Low Melt agarose Sigma A9045 or equivalent
PTU Sigma P7629
Tricaine Sigma A5040
blue/embryo water 10 L ddH2O
0.6 g Instant Ocean
6 drops methylene blue
phenol red (5 mg/ml in 0.2 M KCl)
100x PTU 0.150 g PTU
50 ml ddH2O
dissolve at 70 °C, shake often
aliquot and store at -20 °C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml blue/fish water
Tricaine stock solution 400 mg tricaine
97.9 ddH2O
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 adjust pH to ~7.0
store in 4 °C or -20 °C for long term storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, (42), 17968-17973 (2009).
  2. Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8, (5), 500-511 (2009).
  3. Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18, (15), 1133-1137 (2008).
  4. Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66, (5), 437-451 (2006).
  5. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68, (2), 85-111 (2002).
  6. Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
  7. Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
  8. Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
  9. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
  10. Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28, (42), 10641-10653 (2008).
  11. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, (5), 703-709 (2006).
  12. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107, (10), 2615-2623 (2012).
  13. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, (5), 1803-1814 (2009).
  14. Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23, (2), 325-335 (1999).
  15. Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198, (1), 11-24 (2012).
  16. Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. (2012).
  17. Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32, (9), 2976-2987 (2012).
  18. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37, (4), 622-632 (1998).
  19. Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54, (4), 535-545 (2007).
  20. Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278, (2), 587-606 (2005).
  21. Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461, (7262), 407-410 (2009).
  22. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics