Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Published 2/23/2013
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Biology
 

Summary

Wir entwickelten und validierten ein small-footprint Reihe von Miniatur Chemostate aus leicht verfügbaren Teile für niedrigen Kosten gebaut. Physiologische und experimenteller Evolution Ergebnisse waren ähnlich größeres Volumen Chemostate. Die ministat Array bietet eine kompakte, kostengünstige und leicht zugängliche Plattform für traditionelle Chemostatexperimenten, funktionaler Genomik und chemische Screening-Anwendungen.

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Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

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Abstract

Chemostate sind kontinuierlichen Kultur, bei denen Zellen in einer streng kontrollierten, chemisch konstanten Umgebung, in der Kultur Dichte durch Begrenzung spezifische Nährstoffe gezwungen wird angebaut werden. 1,2 Daten aus Chemostate sind hochgradig reproduzierbare zur Messung der quantitativen Phänotypen wie sie eine konstante Wachstumsrate bereitzustellen und Umwelt in einem stabilen Zustand. Aus diesen Gründen, Chemostate geworden nützliche Werkzeuge für feinskaligen Charakterisierung der Physiologie durch die Analyse der Genexpression 3-6 und andere Merkmale der Kulturen im Steady-State-Gleichgewicht. 7 Langfristige Experimente in Chemostate hervorheben können bestimmte Flugbahnen, dass mikrobiellen Populationen treffen während adaptive evolution in einer kontrollierten Umgebung. In der Tat haben Chemostate für experimentelle Entwicklung seit ihrer Erfindung verwendet. 8 Ein gemeinsames Ergebnis in Evolutionsexperimenten wird für jeden biologischen replizieren, um eine einzigartige Repertoire von Mutationen erwerben. 9-13 Diese Vielfalt lässt vermuten, dass dort viel zu, indem Sie die Evolution Experimenten mit weit höheren Durchsatz entdeckt zu werden.

Wir stellen Ihnen hier das Design und den Betrieb von einer relativ einfachen, kostengünstigen Reihe von Miniatur Chemostate-oder Ministate-und validieren ihre Verwendung bei der Bestimmung der Physiologie und in der Evolution Experimenten mit Hefe. Dieser Ansatz bringt Wachstum von zehn Chemostate off einen einzigen Multiplex peristaltische Pumpe. Die Kulturen werden bei einem 20 ml Arbeitsvolumen, das praktisch für eine Reihe von Anwendungen ist aufrechterhalten. Es ist unsere Hoffnung, dass der Durchsatz erhöht, sinkende Kosten und die detaillierte Bau-und Betriebsanweisungen können auch motivieren, Forschung und industrieller Anwendung dieses Design als allgemeine Plattform für funktionelle Charakterisierung einer großen Anzahl von Stämmen, Arten und Wachstumsparameter, sowie genetische oder Drogen-Bibliotheken.

Introduction

Die Dynamik der mikrobiellen Wachstum und Entwicklung sind grundlegend für Mikrobiologie, Ökologie, Genetik und Biotechnologie. Die gängigste Methode zur Kultivierung von Mikroorganismen ist in Batch, wo Zellen bei niedriger Dichte in nährstoffreichen Brühe inokuliert und bis zur Sättigung. Obwohl einfach zu führen mit Standard-Laborgeräte, erleben Batch-Kulturen einen schwankenden chemischen Umgebung und entsprechend verändert Zellphysiologie. Diese heterogene Wachstum Umwelt in sekundären Wachstum und Stress-Wirkung, die subtile physiologische Unterschiede maskieren können die Folge sein. Experimentelle Evolution durch serielle Batch-Übertragung für komplexe Mischungen Wachstumsphase spezifischen Untergruppen wählen, erschwert Versuche, Anpassungen an die selektiven Bedingungen zu verbinden. Messung der quantitativen Phänotypen kann schwierig sein, durch Lärm aus unpräzisen Abtastzeitsteuerungsgenerator und Variation in Merkmalen wie Zeitverzögerung. Kontinuierliche Kulturen bieten eine AlternativeWachstum Regime, wo Zellen reproduzierbar in einem chemisch homogenen Umgebung werden in einem definierten Wachstumsrate kultiviert, um eine physiologische stationären Zustand zu erreichen. Aufgrund dieser Vorteile, Studium der Evolution und experimentellen Charakterisierung von zellulären Zustand verwenden oft die kontrollierte Umgebung kontinuierlicher Kulturen wie dem Chemostat. 14

Gesamtwertung dieser Vorteile hat zu einem Wiederaufleben des Interesses an Chemostatkulturen geführt. 15 Seit ihrer Einführung im Jahr 1950 haben 1,2 Chemostat Systeme Funktion auf einer Vielzahl von Skalen von Liter auf Mikroliter und für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt. 16 -19 Diese verschiedenen Designs, die von kommerziell hergestellten Bioreaktoren glasbläserischer Schiffe, um benutzerdefinierte Mikrofluidik-Plattformen, Aktien allgemeinen Design-Prinzipien reichen. Eine Kultur Kammer gerührt und belüftet (in der Regel durch Einblasen von Luft durch sie) und die Mikroben darin enthaltenen homogen gehaltenly verstreut in der Kulturkammer zu allen Zeiten. Frisches Medium mit definierter Zusammensetzung wird kontinuierlich hinzugefügt und die Geschwindigkeit der Zugabe steuert Wachstumsrate und beeinflusst die chemische Umgebung von der Kultur erfahren. Ein Überlauf setzt den Kulturvolumen im Wachstum Rohr und durch diesen Überlauf wird die Kultur mit der gleichen Rate, mit der frisches Medium eintritt beproben. Auf diese Weise Kulturen schnell eine physiologische eingeschwungenen Zustand bei dem viele biologische Parameter konstant bleiben. Trotz der Vorteile der Chemostate und Berichte über diese verschiedenen Plattformen in der Literatur, hat weit verbreitete Annahme durch Schwierigkeiten beim Aufbau und Betrieb dieser Systeme und hohe Kosten mit kommerziellen Optionen verbundenen beschränkt. Darüber Beschreibungen, wie zu machen und diese Geräte können undurchsichtig.

Wir präsentieren Entwürfe und Anweisungen für die Verwendung eines small-footprint Reihe von Miniatur Chemostate aus leicht zugänglichen Teilen zu niedrigen Kosten gebaut. Wir obsErve sehr konsistent experimentellen Parameter und reproduzierbare Ergebnisse beim Vergleich unserem Gerät an den gemeldeten Daten für die Hefe in größeren Volumen kommerziellen Bioreaktoren kultiviert. Dies schließt Reproduzierbarkeit Zellphysiologie wie durch den stationären Zustand der Gleichgewichtszustand innerhalb von 10-15 Generationen und Erhalten ähnliche Kultur Dichten im Gleichgewicht gesehen. Zusätzlich sind Genexpressionsmuster konsistent zwischen Ministate und einem kommerziellen größerem Volumen Plattform. Stabilität der Verdünnung, optische Dichte und Reproduzierbarkeit der Genexpression zwischen drei wiederholten Kulturen demonstrieren die Robustheit unserer Plattform. Wir zeigen auch, dass die gleichen adaptiven Mutationen gegenüber ähnlichen experimenteller Evolution Zeitskalen entstehen als mit größerem Volumen Chemostate.

Protocol

Verwenden Sie geeignete sterile Technik während des Protokolls.

Ein. Montage Teile für und Vorbereiten des Ministat Array

  1. Bestellen Sie alle Teile.
  2. Reinigen Glasröhren. Markieren Röhrchen bei 20 ml Volumen.
  3. Machen Kork Baugruppen mit Luft-, Medien-und Abwasser-Anschlüsse und legen Sie sie an der Spitze der gereinigten Glas Kulturröhrchen.
  4. Bereiten Befeuchtung Kammern und organisieren alle nicht autoklaviert Teile.
  5. Machen Luft, Abwässer und Medien Schlauch mit ausreichender Schlauchlängen und kompatible Kupplungen.
  6. Schließen Sie jede Art von Schlauch (Luft-, Medien-und Abwasser) für die Kork-Baugruppen und Folie Filter und den Medien schnell eine Verbindung mit ihnen für den Autoklaven vorzubereiten.
  7. Bereiten Sie einen Glasballon für die Herstellung von sterilen Chemostat Medium.
  8. Bereiten Sie die Kultur Probenflaschen durch Einfügen eines zwei durchbohrten Gummistopfen mit dazugehörigen Armaturen. Folie jeden Filter, um sie für den Autoklaven vorzubereiten.
  9. Fit die versammelte array fein säuberlich in einem oder mehreren Autoklaven Trays und autoklavieren alle Teile.
  10. Stellen und filtern Chemostat Medien in autoklavierten Ballons.

2. Einrichten eines Tests

  1. Füllen Sie jede Flüssigkeitszufuhr Kolben mit 700 ml ddH 2 O.
  2. Platzieren Sie die autoklavierten Ministate in den Heizblock Satz auf der gewünschten Temperatur.
  3. Legen Sie die Fluggesellschaften in der 4-fach-Verteiler und schalten Sie die Luftpumpe.
  4. Schließen Sie die Abwasserleitungen an die 100 ml-Sammlung Flaschen.
  5. Entfernen Sie die Folie aus dem Ende des Medien-Schlauch und Medien carboy und verbinden die beiden schnellen verbindet. Führen Sie jede Länge der Pumpe den Schlauch durch eine Schlauchpumpe Patrone und einrasten lassen. Schalten Sie den Media Pumpe.
  6. Lassen Sie die Kammern zu füllen. Schalten Sie das Media Pumpe.
  7. Sprühen Sie die Kork-Baugruppen mit 70% Ethanol und impfen die Kulturen mit einer Spritze. Speichern Sie eine Probe des Inokulums als gefrorene Glycerin Lagerfalls gewünscht. Lassen Kulturen für 30 Stunden wachsen.
  8. Stellen Sie die Höhe des Abflusses Nadel, bis die Kultur Volumen auf 20 ml eingestellt wird mit dem Luftstrom ausgeschaltet. Dies kann einige Anpassungen im Laufe einer Stunde dauern. Wenn Sie fertig sind schalten Sie den Luftstrom wieder auf.
  9. Drehen Sie die Medien Pumpe.
  10. Leeren Sie die Abwasserproben Flaschen, die Medien gesammelt, während Sie die Arbeitskultur Volumen und notieren Sie die Zeit enthalten.
  11. Um eine Zeit-Null-Messung stattfinden die Abwasserleitungen in sterile Sammelröhrchen für 15 min-2 h (je nachdem, was gewünschten Lautstärke Probe für DNA-Analyse). Auch eine Glycerin gefrorenen Vorrat für jede Kultur zu diesem Zeitpunkt, wenn gewünscht.

3. Tägliche Messungen

  1. Wie bei Zeit-Nullmessung Probe auf Eis für 15 min-2 h (wie für das Experiment erforderlich) auf Eis und Aufzeichnung der Zeit für DNA und Gefriergutbehälter Proben abgetastet.
  2. Für die RNA-Proben entweder sammeln eine kleine volUme mit einer Spritze und 22G 5 "Nadel aus der Kultur oder entkorken jeder ministat die gesamte Kultur zu ernten. Proben schnell getroffen werden müssen, durch Filtration gesammelt und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren.
  3. Messen Sie den Ablauf seit der letzten Probenahme für jeden ministat zur Verdünnung quantifiziert gesammelt. Passen Verdünnungsraten, wenn durch Verstellung der Pumpe Einstellung erforderlich ist oder Tuning der Geldbuße einzelnen Pumpleitungen einzustellen.
  4. Ersetzen Abwasserleitungen in leere Auflistung Flaschen.
  5. Quantifizierung Zellen / ml sowie andere Endpunkte von Interesse und einen Glycerin gefrorenen Lager.

4. Post-Experiment Cleanup

  1. Zeigen alle Schläuche in separaten Fächern und spülen übermäßig mit ddH 2 O. Dry Schlauch mit einem Aquarium-Pumpe.
  2. Reinigen Sie die Kork-Baugruppen mit ddH 2 O und verwenden Nadeleinsatz, um die Nadeln zu reinigen, Aufnehmen und Abgeben Wasser wiederum. Wischen Sie die Außenseite der Nadeln und Kork zu einem entfernenRest-Medien.
  3. Reinigen Sie das Glas Schlauch mit Wasser und Ethanol, und entfernen physikalischen Kontaminanten mit 3 ballte Kimwipes und Pinzette.
  4. Spülen und trocknen Sie alle Teile wieder vor dem Gebrauch.

Representative Results

Die ministat array oben beschrieben und in (Abbildung 1A, B) wurde verwendet, um Kultur eine haploide MATa Laborstamm der Bäckerhefe (S288C) unter Sulfat-einschränkenden Bedingungen wie zuvor beschrieben. 10 Wir testeten die Wirksamkeit für gemeinsame Chemostat Anwendungen einschließlich der Bestimmung der Physiologie und experimentellen Entwicklung. Um die Ministate validieren, wiederholten wir mehreren Experimenten zuvor in industriellen Fermentern durchgeführt für Chemostat Einsatz modifiziert. 10,20,21 ATR Sixfors Fermentern bei einem 300 ml Arbeitsvolumen ausgeführt wurden, mehr als das Zehnfache des Volumens der Ministate und weisen erheblich unterschiedlichen Modi Kultur Belüftung und Rühren. Wir haben versucht, Geräte Stabilität, steady state Physiologie, experimenteller Evolution Ergebnisse und Genexpressionsmuster mit diesen Fermentern erhalten replizieren.

Da Einheitlichkeit der Verdünnung und Belüftung wichtige Aspekte der Chemostat Design sind wir megesicherter die tatsächliche Verdünnungsrate in 32 Ministate nach 15 Generationen Wachstum und gefunden, dass mit einem Soll Verdünnungsrate von 0,17 Vol / hr (4-5 Tropfen / min) wir eine durchschnittliche Verdünnungsrate von 0,17208 erreicht mit einer Standardabweichung von 0,0075 in 32 repliziert. Dieser Bereich war in unserem typischen Toleranz von + / -0,01 vol / h Unterschied zur Zielsetzung, hinter dem großen Veränderungen in der Genexpression beobachtet worden. 22-23 Across 4 Ministate die Strömungsgeschwindigkeit der Luft ermittelt wurde, um 307,5 ​​ml sein / min mit einer Standardabweichung von 9,57 ml / min. Dies legt nahe, dass Luftstrom in den Kammern ist robust und gleichmäßig zwischen den vier Kammern unterteilt ist und einen Wert ähnlich dem für die Belüftung in der industriellen Fermentern beschrieben. 20

Wir zuvor beobachteten wiederkehrenden Amplifikation des hochaffinen Schwefel-Ionen-Transporter SUL1 in 8/8 Sulfat-begrenzten Evolutionsexperimenten in Hefe. 10 Angesichts der Konsistenz der Ergebnisse unter this Zustand, den wir wählten Sulfat-Beschränkung auf unser System die Fähigkeit zu testen. Eine erforderliche Element Chemostatkultur ist die Notwendigkeit, eine konstante chemische Umgebung aufrechtzuerhalten. Schwankungen in der Abundanz eines limitierenden Nährstoff oder andere Veränderungen in der Umgebung der Regel in einer Änderung der Anzahl von Zellen in einer Kultur führen. Wir maßen optische Dichte als Proxy für die Zellzahl (2A) und der gemessenen Reproduzierbarkeit in 16 replizieren Kulturen, mit der eine durchschnittliche A600 von 1,12 (~ 10 9 Zellen) nach ~ 15 Generationen Wachstum mit einer Standardabweichung von 0,057 Einheiten oder 5,1 %. Zum Vergleich, zeigten Messungen von 4 replicate Kulturen in der industriellen Fermentern gezüchtet genommen eine Standardabweichung von 2,5%. Zellen wurden gut gemischt in der Wachstumskammer: Messungen der OD und Zellzahl vom Ausfluss Spur getroffen waren äquivalent zu Proben direkt aus der Kultur Röhre (Daten nicht gezeigt) entnommen. Diese Ergebnisse zeigen die Robustheit der Plattform eined Fähigkeit, eine konstante chemische Umgebung in einem ähnlichen Toleranz als die industrielle Fermenter zu erhalten.

Als sensibler Auslesen der Physiologie, verglichen wir genomweite steady state Genexpression von Kulturen unter Sulfat-Limitierung in den Ministate und im industriellen Fermenter gezüchtet. Genexpression in den Ministate zeigte einen hohen Grad der Ähnlichkeit auf drei biologische repliziert (2B). Wir bereits erwähnt, dass für die RNA von zwei replizieren Sixfors Chemostate abgeleitet und an einen Mikroarray mit-hybridisiert, fiel Expression von 99% der Gene innerhalb einer 1,5-fachen Bereich, was die Verwendung von 1,5 X als empirische Bedeutung Cutoff. 21 Genexpression aus drei replicate Ministate Vergleich paarweise, zeigten 99% der Gene fiel innerhalb einer 1,5-1,7 fachen Bereich, vergleichbar mit den Ergebnissen aus den industriellen Fermentern. Die drei Proben einzelne Arrays und der paarweisen Verhältnisse berechnet danach wurden hybridisiert, so dass diese values beinhalten inter-Array Noise neben biologischen Rauschen, potentiell Überschätzung der Variation zwischen Wiederholungen gemäß den veröffentlichten, Co-hybridisierten Ergebnissen verglichen. 138 Gene wurden unterschiedlich exprimierten> 1,5-fach in allen drei ministat als Wiederholungen zu einer Probe von einem passenden Kultur im industriellen Fermenter gezüchtet gesammelt verglichen. Gene in der Expression in den Ministate zurückgegangen waren stark für den Eisenstoffwechsel bereichert. Diese Signatur kann sowohl den unterschiedlichen Metallzusammensetzung jedes Gerätekonfiguration: die Sixfors Vorrichtung einen Metall Laufrad und Belüftung Anordnung im Kulturmedium eingetaucht ist, und das Medien Ballonflaschen bisher verwendeten Metall auch Hardware erforderlich. Die ministat nutzt Edelstahlnadeln, aber keine anderen metallischen Komponenten. Gene mit erhöhter Expression wurden weitgehend mit Zellmembranen assoziiert, obwohl die biologische Bedeutung dieser Vereinigung ist unklar.

Schließlich testeten wir experimenteller Evolution under diese Bedingungen. Nach 250 Generationen von Sulfat-begrenztes Wachstum, zeigten 4/4 Klone aus 4 unabhängigen entwickelnden Populationen getestet Verstärkung SUL1 von Array Comparative Genomic Hybridization (CGH, 2C) nachgewiesen. Dieses Ergebnis ist konsistent mit den Ergebnissen in größerem Volumen Chemostate gegenüber ähnlichen Zeitabständen. 10

Abbildung 1
Abbildung 1. A. Design und Anordnung der ministat Array. B. Design der Kultur Kammer.

Abbildung 2
Abbildung 2. A. ExperimeDaten, die zeigen, dass NTAL Kulturen Gleichgewicht erreichen innerhalb von zehn Generationen Wachstum (n = 16). B. Expression Daten für drei biologische repliziert S1-3 während des stationären abgetasteten unter Sulfat Einschränkung gegenüber einer gemeinsamen Referenz in einer angepaßten begrenzten Sulfat-Sixfors Chemostat gezüchtet . C. SUL1 Amplifikationen in Ministate nach 250 Generationen von Wachstum in einem Sulfat-begrenzten Umwelt gewonnen. Genomische DNA von jedem Klon wurde entwickelt, um Vorfahren DNA durch CGH verglichen wie beschrieben. 21 Mittlere Kopienzahl für jede amplifizierte Region wurde berechnet und ist neben jeder Amplikon gezeigt. Alle Microarray-Daten werden in der GEO-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE36691 hinterlegt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Discussion

Chemostat Anbau in den Ministate, wie bei jedem Chemostat, erfordert viel Liebe zum Detail und Fehlersuche. Da Verunreinigungen von großer Bedeutung ist in kontinuierlicher Kultur Experimenten haben wir in der Regel über Mikroskop für Bakterien und Pilzbefall nach Impfung und alle 50 Generationen in langfristige Entwicklung Experimenten zu suchen. Bisher haben wir keine Kontamination über 96 Evolutionsexperimenten von größer als 300 Generationen (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Um eine Kreuzkontamination zwischen Ministate und das Potential für die Mikroben Kulturkammer mittels der Ausflussleitung kolonisieren testen wir liefen 16 Ministate derart, dass jedes zweite ministat mit Hefe wie vorstehend und die übrigen wurden mit keiner angeimpft wurde angeimpft. Die Kulturen wurden in einer kommunalen Abfallbehälter, die geleert jeden zweiten Tag wurde abgetastet. So, wenn es möglich wäre, Verunreinigungen durch Abwasser Zeile eingeben, um hätten wir wahrscheinlich bemerkt haben, dass in diesem experimENT. Während drei Wochen und mehr als 100 Generationen Wachstum in diesem Schachbrettmuster von inokuliert und nicht-inokulierten Kulturen nicht beobachten wir haben Wachstum der nicht-inokulierten ministat Kulturröhrchen, was darauf hindeutet, dass eine Kontamination von außen Hefe oder anderen Mikroben kaum in Experimenten auftreten ähnlichen Zeitrahmen.

Obwohl die Ministate wurden entwickelt, um in analoger Weise zu kommerziellen Chemostate arbeiten, ermöglicht der modulare Charakter dieser Anordnung für die Optimierung die Bedürfnisse der Nutzer und Budget passen. Die Schlauchpumpe in diesem Protokoll verwendet erreichen Strömungsgeschwindigkeiten zwischen 0,0186 vol / vol bis 3,6 hr / hr (Daten nicht gezeigt). Erhöhte Kontrolle Verdünnungsraten könnte mit alternativen Pumpenmodelle erreicht werden. Beachten Sie, dass Betrieb bei niedrigeren Verdünnungsraten können Substitution einer höheren Gauge-Nadel erforderlich, um die gleiche Frequenz von Tröpfchen delivery. Populationsgröße ist eine wichtige Überlegung für die ordnungsgemäße Gestaltung der Evolution Experimente.Der Standard Verdünnungsrate und Nährstoffkonzentration welche hier eine relativ große Population Größe (~ 10 9 Zellen) der gleichen Größenordnung wie erschienen Evolution Studien. 11 Größere oder kleinere Populationen, indem die Hubvolumen oder Nährstoff-Konzentration gehalten werden konnte. Erhöhte Mutation Versorgung könnte auch durch die Zusammenarbeit mit Stämmen mit erhöhter Mutationsrate erzielt werden.

Die Ministate könnte auch über unsere aktuellen Design verbessert werden. Zum Beispiel kann sich Kondenswasser auf den Kultur Rohrwänden sammeln und lässt sich durch Verwendung einer tiefen Wasserbad, Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur reduziert werden. Obwohl Verklumpung und Wand Wachstum in Sulfat begrenzten Kulturen scheint relativ selten, die in 5/48 Evolutionsexperimenten um 300 Generationen (Daten nicht gezeigt), eine Vielzahl von Tensiden zur Verfügung, kann in abnehmender oder Verzögern dieses Merkmals zu erleichtern. Im Falle, dass mit ausreichender Verklumpung Kultur interferiertMischen, Rühren erhöhte kann durch Verringern der Anzahl von Wegen jeweils Luftpumpe geteilt ist, oder durch Zugabe einer Rührapparatur erreicht werden. Zusätzliche Sonden zur Konzentration an gelöstem Gas, pH, oder andere Parameter könnte auch enthalten sein, wie in einigen anderen Designs. 17

Trotz möglicher Änderungen, über die Ministate wie in diesem Protokoll beschrieben, beobachteten wir sehr konsistent experimentellen Parameter und reproduzierbare Ergebnisse beim Vergleich unserem Gerät an den gemeldeten Daten für größere Volumenströme kommerziellen Chemostate. Dies beinhaltete Reproduzierbarkeit der zellulären Physiologie wie durch den stationären Zustand der Gleichgewichtszustand innerhalb von 10-15 Generationen (Figur 2A) und Erhalten ähnliche Kultur Dichten im Gleichgewicht gesehen. Genexpressionsmuster wurden über drei biologische repliziert in Ministate und zwischen Ministate und kommerziellen großvolumigen Plattformen (2B) konsistent, mit Ausnahme der Eisen-Metabolismus-Gene. Diese exploss Unterschiede werden wahrscheinlich durch Veränderungen der Metallgehalt der beiden Geräte oder Verbesserungen in der Qualität der Medienbestandteile verursacht. Unsere Daten legen nahe, dass Ministate nützlich sein wird für Physiologie oder Kompetitionsexperimente wo eine konsistente Umgebung erforderlich ist.

Um zu testen, ob die ministat Design ist ausreichend für experimentelle Entwicklung Anwendungen, die wir entwickelten Kulturen unter Sulfat-Begrenzung für 250 Generationen und CGH, um eine Verstärkung an der SUL1 locus charakterisieren -. Ein Markenzeichen der langfristigen Entwicklung unter diesen Bedingungen in größerem Volumen Chemostate 10 Wir haben beobachtet, Verstärkung SUL1 in Klonen von 4/4 unabhängige Evolution Experimente in Sulfat-limited Medien (Abbildung 2C). Als Ganzes genommen legen diese Daten nahe, dass Ministate eine robuste Plattform, die nützlich sein können für eine Vielzahl von traditionellen Chemostat Anwendungen sind. Obwohl wir ihre Verwendung gezeigt, bei der Kultivierung Bäckerhefe, sollten die Ministateauch kompatibel mit anderen Organismen und ähnliche Entwürfe haben in der Tat zur Kultivierung von Bakterien und anderen Hefearten verwendet worden. 16,17,25 Darüber desto kleiner Kulturvolumen und korreliert geringeren Bedarf an Medien können zu Ministate eine attraktive Alternative für Experimente teure oder exotische Reagenzien wie der Fall in chemischen oder genetischen Screens sein.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgements

Creation des Videos wurde durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) und dem National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) von den National Institutes of Health unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch NSF 1120425 unterstützt. MJD ist ein Rita Allen Foundation Scholar. AWM wird teilweise durch NIH T32 HG00035 unterstützt. Wir danken Anna Sonnenschein für die Unterstützung bei der Verbesserung Protokolle. Darüber hinaus erkennen wir Sara DiRienzi, Celia Payen und Amy Sirr als frühe Nutzer der Ministate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

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References

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Comments

3 Comments

  1. Our more detailed lab manual for building and running the ministats is also posted on my lab website:
    http://dunham.gs.washington.edu/protocols.shtml
    We'd love to hear from anyone who builds a set, especially if you improve on our design!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    March 1, 2013 - 4:28 PM
  2. This is great! I was about to email you and ask about small chemostats (I used to run chemostat experiments for F Rosenzweig, so I know about those custom-blown glass babies!). I'll be building a set of these ministats to use in experiments with Chlamydomonas reinhardtii. Have you had any problems with the effluent needle clogging, or with back growth up the needle? Since the vessel is under slight positive pressure, I guess that I could clean the exterior of the needle every so often with EtOH -- this is going to be a very long long experiment!

    Heidi Kuehne, U Edinburgh

    Reply
    Posted by: Heidi K.
    August 26, 2013 - 9:43 AM
  3. Hi Heidi. I'm excited you're building a setup for Chlamydomonas! We have not had backflow problems, as long as the pump head is fastened down. You do need to clamp the media lines if you are loosening the pump heads. However, we have had growth in the needle on occasion (never on the exterior of the needle). One nice thing is that the setup is modular, so if it happens, you can just swab the cork with ethanol and swap in another piece of sterile tubing with a new needle. However, for yeast, line growth is highly correlated with the evolution of clumping/wall growth, so we do get recolonization at some frequency. We have not gotten effluent needle clogging, even with cultures that evolve large clumps, and we have never seen back-contamination via the effluent lines. The air flow seems to be sufficient to empty the line efficiently and keep it cleared. Let me know if you have any other questions, and I'd love to hear how it turns out. Good luck!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    August 26, 2013 - 4:31 PM

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