Alta resolución todo el montaje de
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar mediante

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

Este artículo se centra en todo el montaje hibridación in situ (deseo) de embriones de pez cebra. La tecnología DESEO facilita la evaluación de la expresión génica tanto en términos de distribución en los tejidos y la etapa de desarrollo. Los protocolos se describen para el uso de la voluntad de embriones de pez cebra utilizando sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina. Las sondas se generan mediante la incorporación de nucleótidos unidos a digoxigenina mediante transcripción in vitro de plantillas de genes que han sido clonados y linealizado. Los chorions de embriones cosechados en etapas de desarrollo definidas se eliminan antes de la incubación con sondas específicas. Siguiendo un procedimiento de lavado para eliminar el exceso de sonda, los embriones se incuban con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina. Mediante el empleo de un sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina, la expresión de genes específicos puede ser evaluada. Dependiendo del nivel de la expresión génica todo el procedimiento puede ser completado dentro de 2-3 días.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de desarrollo de los vertebrados, la enfermedad, el comportamiento, y en la detección de drogas 1-3. Embriones de pez cebra se pueden obtener en grandes cantidades a partir de un solo cruce. La fertilización y el desarrollo se produce fuera del útero y los embriones ópticamente transparentes se desarrollan rápidamente. Eventos de desarrollo críticos se producen durante las primeras 48 horas después de la fecundación (HPF). Esto incluye la aparición de primordios de órganos y la iniciación de citodiferenciación. Desmontables o sobre-expresión de proteínas se puede lograr a través de la microinyección de embriones con antisentido morfolino (MO) oligonucleótidos o ARNm, respectivamente, a la una o dos etapas de células (0,75 HPF).

El deseo de los embriones de pez cebra facilita el estudio de la expresión espacio-temporal de los genes de interés. Aplicación de la técnica DESEO después de la microinyección de embriones con ARNm o MO a la sobre-exprESS o los niveles de proteína específicos desmontables revela regulación diferencial de otros genes.

Los cambios en los patrones de expresión de genes pueden ser correlacionados con los cambios fenotípicos y revelan la función de los genes diana durante la embriogénesis temprana. Dado que las sondas pueden prepararse y almacenarse de antemano, la técnica ISH se puede aplicar para revelar los patrones de expresión de genes por lo menos 20 genes a la vez el uso de placas de seis pocillos y las cestas hechas a medida.

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Protocol

1. Todo el montaje hibridación in situ de embriones de pez cebra

1.1 Preparación de embriones

  1. Recoger los embriones en las etapas de desarrollo requeridos. Por favor, vea. Kimmel et al 5 para la descripción fase embrionaria.
  2. Retire chorions manualmente utilizando fórceps (pinzas de relojero Dumont no. 5).
  3. Fijar embriones en una solución al 4% de paraformaldehído (PFA), preparada en PBS (tampón fosfato salino) durante la noche a 4 ° C.
  4. Lavar embriones con PBS, al menos 3 veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
  5. Embriones en tienda a 100% de metanol (MeOH) a -20 º C hasta su uso para la futura aplicación de técnicas que incluyen todo el montaje hibridación in situ.
  6. Freeze en escena embriones en nitrógeno líquido para la extracción de RNA y se almacenan a -80 ° C.
  7. Extraer el ARN a partir de embriones por etapas y sintetizar cDNA de amplificación por PCR y posterior clonación.
  8. 1.2 Síntesis de sondas de ARN marcadas con digoxigenina

    1. Amplificación por PCR y la clonación de genes para la plantilla de la sonda. Configuración de reacción de PCR con un volumen total de 50 l tal como se muestra en la Tabla 1. Usar más ADN genómico o ADNc menos en la reacción de PCR como plantilla. Incluir 10 min de tiempo de extensión a 72 ° C después del último ciclo para asegurarse de que los productos de reacción de PCR son de longitud completa y 3 'adenylated con el fin de facilitar la clonación TOPO.
    Reactivo Volumen
    Plantilla de ADN 100 ng
    Tampón de PCR (10x) 5 l
    dNTPs (10 mM) 2 l
    Los cebadores (10 mM) 1 M cada uno
    Añadir agua hasta un volumen final de 49,7 l
    Taq polimerasa (5 unidad / & #956; l) 0,3 l
    Volumen de reacción 50 l

    Tabla 1. Reacción de amplificación por PCR.

    1. Verificar el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. El tamaño estimado del producto de PCR para la síntesis de la sonda es cerca de 1 kb.
    2. Tenga especial cuidado para evitar la contaminación con nucleasa llevando a cabo el experimento en condiciones estériles y el uso de agua libre de nucleasa. En el caso de que se observan productos múltiples, gel de-purificar el producto de PCR de tamaño apropiado antes de proceder con la clonación usando el kit de clonación TOPO TA. Optimización de la reacción de PCR para eliminar la aparición de manchas y múltiples bandas.
    3. Realizar la reacción de clonación TOPO como se indica en la Tabla 2. Combinar TOPO vector y del producto de PCR y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
    Reactivo Las células químicamente competentes Las células competentes Electro Producto de la reacción de PCR fresco 1-4 l 1-4 l Solución Salina 1 l Solución salina diluida 1 l Agua Hasta un total de volumen de 5 l Hasta un total de volumen de 5 l TOPO vector 1 l 1 l Volumen final 6 l 6 l

    Reacción de clonación TOPO Tabla 2..

    1. Incorporar / introducir el producto de clonación TOPO en una células competentes tiro. Tsu proceso se denomina transformación.
    2. Se incuban las células transformadas a 37 ° C durante al menos 1 hora a 260 rpm para asegurar la expresión de los genes de resistencia a antibióticos. Placa de la mezcla de transformación (50-100 l) en precalentado Luria Bertani (LB) placas de agar que contienen 50 mg / ml de ampicilina y X-gal Incubar a 37 ° C durante la noche.
    3. Determinar la presencia de la inserción sobre la base de la apariencia de las colonias azules claros o blancos. El vector TOPO contiene gen lacZ que codifica β-galactosidasa. En presencia de X-gal, la producción de β-galactosidasa forma de color azul. ADN se ligó en el plásmido interrumpe la formación de β-galactosidasa y blanco colonias funcionales se producen. Las colonias blancas o colonias de color azul claro confirman la presencia de la inserción.
    4. Elige las colonias de color blanco de la placa de agar utilizando puntas de pipeta estériles y colocarlos en el tubo estéril de 10 ml que contenía 4 ml de medio LB y de cultivo a 37 ° C en la incubadora agitandoTor durante la noche a 200 rpm.
    5. Purificar el ADN plasmídico usando el kit de ADN plásmido de acuerdo con la instrucciones del fabricante.
    6. Alineado de ADNc después de la purificación del plásmido por digestión de 5 g de ADNc para cada sonda con la enzima de restricción apropiada que tiene un sitio único situado 3 '(para las sondas de sentido) o 5' (para las sondas antisentido) para el inserto.
    7. Se purifica el ADN linealizado utilizando el método de extracción con fenol / cloroformo. Añadir un volumen igual de giro fenol / cloroformo, vértice vigorosamente durante 30 segundos, durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior en el tubo limpio y añadir un volumen igual de cloroformo. Haga girar durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior en el tubo limpio. Añadir acetato de sodio 10% (3 M) y el volumen de 2,5 veces de etanol al 100% para precipitar el ADN y se almacena a -20 ° C durante toda la noche. Haga girar durante 15 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el etanol y lavar el precipitado con etanol al 75%. El protocolo se puede detener y el ADN se puede STORED a -20 ° C y se reanuda al día siguiente. Haga girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y secar el precipitado durante 2 min a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en 10 l de agua tratada con DEPC y se incuba a 55 ° C durante 20 min. Cuantificar la concentración de ADN utilizando el espectrofotómetro de UV.
    8. Evaluación de la pureza por electroforesis en gel de agarosa usando 1 l de ADN en gel de agarosa al 1% y funcionando durante aproximadamente 30 min.
    9. Configurar reacción de marcaje de ARN. El uso de un vial de reacción libre de RNasa, añadir 1-5 g de ADN de plantilla purificada estéril a, libre de RNasa, agua destilada tratada con DEPC, doble a un volumen de 13 l. Enfríe el vial de reacción en hielo y añadir los siguientes reactivos (véase la Tabla 3):
    Reactivo Volumen
    NTP mezcla de marcaje (10x) 2 l
    Buff Transcripcióner (10x) 2 l
    Protector de inhibidor de RNasa 1 l
    ARN polimerasa SP6 o
    ARN polimerasa T7 2 l
    Volumen final 20 l

    Tabla 3. Reacción de marcaje de ARN.

    1. Mezclar suavemente el reactivo a continuación, recoger en la parte inferior mediante una breve centrifugación a 2000 rpm durante 30 segundos a temperatura ambiente y se incuba la mezcla de reacción durante 2 horas a 37 ° C.
    2. Retirar la plantilla de ADN mediante la adición de 2 l de RNasa libre de DNasa I. Se incuba durante 30 min a 37 ° C y detener la reacción mediante la adición de 2 l de EDTA 0,2 M (pH 8,0).
    3. Precipitar los productos de reacción mediante la adición de 2,5 l de LiCl 4 M y 75 l de etanol 100%. Mezclar la solución y mantener a -20 ° C durante 45 minutos or se almacenó a -20 ° C durante la noche y el protocolo reanudó al día siguiente.
    4. Se centrifuga la suspensión durante 30 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C, a continuación, lavar el precipitado con 500 l de etanol al 70% se almacenó a -20 ° C, se centrifuga durante 10 min adicionales, seco durante 2 minutos, y volver a suspender en 50 l y se incuba a 30 min a 37 ° C.
    5. Verificar la calidad y la integridad de la sonda mediante la ejecución de 1-2 ml en gel de agarosa al 1% durante aproximadamente 30 min. Esto se confirma por la presencia de un solo producto se ejecuta en el tamaño esperado en el gel.
    6. Cuantificar la concentración de la sonda mediante la medición de la cantidad de ARN utilizando espectrofotómetro. El rendimiento de esta reacción es de aproximadamente 10 g de ARN (100-200 ng / l).

    1.3 Todo el montaje hibridación in situ

    1. DÍA 1
      1. Rehidratación
        1. Preparar cestas utilizando tubos Eppendorf de malla de nylon (menos de 1 mm de tamaño de poro) y. Construir las cestas por cutting tubos Eppendorf (1,5 ml) para eliminar los extremos cónicos. Identificar canastas individuales utilizan diferentes tubos de colores y quitar la parte superior bordes de la mitad de ellos.
        2. Cortar pequeños trozos de malla de nylon para cubrir los extremos cortados de los tubos Eppendorf. Pegue los extremos cortados de los tubos a la malla de nylon por calentamiento en una placa caliente eléctrica (situada entre medio y alto) en una campana de humos. Una vez enfriado eliminar el exceso de malla de nylon de las cestas y almacenarlos en 100% de metanol a temperatura ambiente.
        3. Preparar diluciones sucesivas de metanol en PBS (75% [vol / vol [metanol, 50% [vol / vol] de metanol y 25% [vol / vol] de metanol) usando los tres primeros pocillos de las placas de seis pocillos seguido de 100% PBST (tampón fosfato salino que contenía 0,1% de Tween-20) en los próximos tres pozos.
        4. A reserva de embriones in situ el procedimiento de hibridación con las cestas a medida que se muestran en Figurea 1a y b. Utilice soluciones de RNasa libre hasta la hibridaciónpaso ción en placas de 6 pocillos (4 ml / pocillo). Para ello, colocar hasta 6 canastas en el primer pozo. Lugar cesta con reborde primero seguido de canastas sin bordes en diferentes colores dispuestos consecutivamente. Usando esta disposición hasta 6 patrones de expresión génica se puede determinar simultáneamente.
        5. Coloque embriones deshidratados de la misma etapa de desarrollo a la misma cesta (véase la Figura 1).
        6. Rehidrate embriones moviendo cestas de un pocillo en la placa de seis pocillos a la siguiente (5 minutos para cada paso). Usar seis pozos llenos de tampón apropiado. Los embriones se someten a cada dilución de una vez. De esta manera, los embriones se lavan 6 veces, 5 minutos / lavado. La rehidratación de los embriones deshidratados se logra mediante la sustitución de metanol con PBS y luego por lavado 3 veces con 100% PBST.
      2. Resumen permeabilización los embriones rehidratadas con proteinasa K (10 mg / ml) a temperatura ambiente para hacerlas permeables como se muestra en la Tabla 4 Etapa embrionaria (horas después de la fertilización) Período de digestión (proteinasa K) Hasta 6 15 seg 6-12 30 seg 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min

        Tabla 4. Reacción permeabilización.

      3. Postfixation PBST y lavados
        1. Fijar mediante la incubación de embriones en paraformaldehído al 4% (peso / volumen) en 1x PBS durante 20 min.
        2. Retire paraformaldehído residual lavando embriones 3x, 5 min / lavado, en PBST 1x.
        </ Li>
      4. La acetilación Prepare la mezcla de acetilación (125 l de trietanolamina y 27 l de anhídrido acético en 10 ml de ddH 2 O) y los embriones se incuban dos veces durante 10 minutos cada uno. Para minimizar la actividad fosfatasa endógena, preparar la mezcla de acetilación fresco cuando sea necesario. Para eliminar el exceso de reactivos, lavar los embriones dos veces en PBST (10 min / lavado)
      5. La prehibridación Prehybridize embriones mediante la transferencia de embriones a partir de cestas a tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml e incubando con 200 l de mezcla de hibridación 2-4 horas en un ° C baño de agua 70.
      6. Preadsorción del anticuerpo eliminar aproximadamente 50 embriones de las cestas y transferirlos a un tubos de 1,5 ml Eppendorf estériles. Se incuba con anti-DIG-AP (1:500) anticuerpo utilizando tampón de bloqueo (1x PBST, 2% de suero de ternera [vol / vol], 2 Suero Bovino mg / ml de albúmina [BSA]) a temperatura ambiente durante 2-4 horas, y almacenar a 4 ° C durante la noche. Sacar de la incubadora de la mañana und permiten embriones estén a temperatura ambiente.
      7. La hibridación Añadir 100-200 ng de sonda para los embriones prehibridados y se incuba durante la noche a 70 ° C en baño de agua.
    2. DÍA 2
      1. SSC (citrato salino-sódico) Lava
        1. Coloque los tubos de 50 ml de la mezcla de hibridación (HM), 2x SSC y 0,2 x SSC en un vaso de precipitados con agua en un ° C baño de agua 70 y precalentar ellos durante al menos 20 min. Retirar la mezcla de reacción de hibridación que contiene la sonda, añadir 1 ml de mezcla de hibridación precalentada a los tubos y se incuba durante 15 min a 70 ° C. Llenar placas de seis pocillos con diversas diluciones de HM precalentado en 2x SSC mediante la sustitución de 100% HM a través de 50% a 25% HM para eliminar el exceso de reactivos.
        2. Mientras espera, llene placas de seis pocillos con 2x SSC para el lavado y mantenerlos a 70 ° C.
        3. Después de 15 min lugar los embriones del tubo a las cestas mantienen en la placa de seis pocillos lleno de la dilucións de HM con 2x SSC y lavar los embriones híbridas moviendo la canasta de un pozo a otro (15 min cada uno en un baño de agua a 70 ° C). Lave embriones 2x, 15 min / lavado, en el 100% 2x SSC a 70 ° C.
        4. Establecer otro baño de agua a 65 ° C. Rellene seis platos así con 0,2 x SSC de alta rigurosidad se lava para evitar la hibridación no específica de la transcripción con la sonda.
        5. Después de que los embriones se lavan dos veces con 2 x SSC a 70 ° C, siga otros dos lavados de 30 min en 0,2 x SSC a 65 ° C.
      2. Los lavados con PBST Preparar placas de seis pocillos con diluciones sucesivas de 0,2 x SSC en PBST de la siguiente manera: 75% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0,2 x SSC, y los restantes dos pozos con 100% PBST. Lavar los embriones hibridadas moviendo la cesta de un pozo a la siguiente (5 minutos para cada paso a temperatura ambiente usando un eje de balancín).
      3. Embriones preincubar preincubación durante 3-4 horas a temperatura ambiente en blocking tampón (1x PBST, 2% de suero de ternera [vol / vol], 2 mg / ml de BSA).
      4. La incubación con anti-DIG anticuerpos embriones Incubar con una solución de anticuerpo anti-DIG-AP (1:5.000) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
    3. DÍA 3
      1. Lava PBST Preparar las placas de seis pocillos con 4 ml / pocillo PBST. Lave embriones incubados moviendo las canastas en la placa de seis pocillos PBST que contiene 6x por períodos de 15 min. Los embriones se pueden almacenar a 4 ° C y el protocolo reanudaron el día siguiente.
      2. Pretinción Prestain los embriones por lavado 2x durante 15 minutos con pretinción tampón a temperatura ambiente con agitación suave antes de la incubación en presencia de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) y NBT (nitroazul de tetrazolio). BCIP y NBT son los sustratos utilizados para el desarrollo de color de la actividad de la fosfatasa alcalina. Dado que las sondas están unidas con th fosfatasa alcalinael desarrollo de color de púrpura e indica la expresión del gen diana. Los embriones se pueden almacenar a 4 ° C y el protocolo reanudaron el día siguiente.
      3. Coloración
        1. Incubar los embriones a temperatura ambiente en la oscuridad con BCIP y NBT durante 30 min.
        2. Monitorear la reacción de tinción cada 30 min utilizando un estereomicroscopio. Los tiempos de reacción varían de 15 minutos-16 horas, dependiendo del nivel de la expresión génica. Los tiempos de reacción son más cortos para los genes altamente expresados ​​y más larga para los genes expresados ​​débilmente. Sondas de detección detectará las señales de si el gen de interés expresa antisentido complementario (AS) transcripciones.
      4. Se alcanza Detención de la Reacción Después de la intensidad de la tinción deseada, detener la reacción mediante la transferencia de cestas que contienen los embriones a los pocillos que contienen la solución de parada (1x PBS, pH 5,5, 1 mM de EDTA, 0,1% de Tween). Esto evitará un mayor desarrollo del color. Enjuague los embriones durante 10 minutos 2 veces en una mecedora con un suave aglitación a temperatura ambiente.
      5. Postfixation
        1. Incubar los embriones en paraformaldehído al 4% (p / v) en PBS durante 20 min.
        2. Lavar los embriones (5 min / lavado) tres veces con PBST con el fin de eliminar el paraformaldehído residual. Guarde los embriones fijos en la solución de parada en la oscuridad a 4 ° C.
      6. Montaje, Observación y adquisición de imágenes
        1. La transferencia de los embriones a una placa de seis pocillos que contiene 100% de glicerol con el posible volumen mínimo de PBS. Coloque la placa de seis pocillos en un agitador y agitar suavemente durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
        2. Coloque embriones en 100% de glicerol y luego observar la señal bajo un estereomicroscopio.
        3. Adquirir imágenes y guardarlo en formato Tiff o cualquier otro tipo que permite la producción de imágenes de alta calidad mediante el uso de software de imágenes como Photoshop (figuras 3-6).

    I n hibridación in situ

    1. Para alcanzar el doble etiquetado el método descrito anteriormente a partir de 1,1 - 1.3.1.7 se utiliza, sino que incluye la incubación simultánea de ambos digoxigenina y fluoresceína sondas marcadas durante la hibridación.
    2. Siga el mismo procedimiento para el post hibridación se lava saber SSC y lavado PBST (pasos 1.3.2.1 y 1.3.2.2) e incubaciones de bloqueo (paso 1.3.2.3). Realizar reacciones de anticuerpos y la tinción de forma secuencial tal como se describe a continuación.
    3. Incubar los embriones con el anticuerpo acoplado a AP-anti-digoxigenina (1:5.000) a 4 ° C con agitación suave.
    4. Lavar e incubar con BCIP-NBT (pasos 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
    5. Después de la detección, lavar los embriones dos veces con PBST a temperatura ambiente durante 20 min.
    6. Incubar los embriones a 65 º C en PBST con 1 mM de EDTA durante 30 minutos para inactivar el anticuerpo anti-digoxigenina.
    7. Incubar los embriones en 100% de metanol seguido de rehidratación en 75%, 50%, y 25% metanol ingenioh PBST y de nuevo a PBST durante 1 hora.
    8. Incubar los embriones durante la noche con la AP-acoplado a fluoresceína (1:2000) en tampón de bloqueo a 4 º C con agitación suave.
    9. Lavar embriones con PBST (etapa 1.3.3.1) y embriones de pre-tinción de 2 veces durante 15 minutos con tampón de pre-tinción (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) a temperatura ambiente con agitación suave antes de la incubación en presencia de rojo rápido . Protocolo puede ser detenido y los embriones se puede almacenar a 4 ° C con agitación suave y se reanuda el día siguiente.
    10. Se disuelve una tableta Fast Red en 2 ml de tampón de tinción inmediatamente antes de su uso.
    11. Iniciar la reacción de tinción mediante la colocación de los embriones en el tampón de tinción con reactivo Fast Red.
    12. Detener la reacción de tinción cuando se alcanza la intensidad de la tinción deseada. Se puede tomar desde unas pocas horas a temperatura ambiente para uno o dos días durante la noche cuando la tinción a 4 ° C. Detenga la reacción inmediatamente si la intensidad de la tinción no se desarrolla más o comienza a mostrar no específicadad en comparación con el control de los sentidos.
    13. Siga los procedimientos descritos anteriormente para el resto de los pasos a saber, la fijación de correos, de montaje, de observación y captación de imágenes (steps1.3.3.5 y 1.3.3.6).

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Representative Results

Utilizando el protocolo con 50 embriones por canasta (por gen / por condición experimental) el patrón de expresión de ese gen se puede lograr en un solo experimento. Casi todos los embriones muestran patrones similares de expresión para un gen particular. Los ejemplos representativos de la tinción en hibridación in situ se muestran en las Figuras 3-6.

Tanto el sentido y anti-sentido ribosondas se sintetizan a partir de los ADNc correspondientes a PC5.1 PC5.2, 6, 7, SCL/tal-1 gata-1, 8,9 flk / kdrl 10, shh 11, 12, DLX2 fkd7 / FoxA1 13, la insulina 14,15, tripsina y 16 se han construido mediante la amplificación de un segmento del ARNm de longitud completa utilizando Taq ADN polimerasa, y se clonó en pCRII-TOPO (Invitrogen). La autenticidad de los amplicones individuales se confirmó mediante secuenciación. Tras la verificación de la orientación de la copia, se sintetizaron ribosondas antisentido correspondientesutilizando los protocolos 17 con modificaciones 18,19 como se describe aquí usando ya sea el SP6 o T7 RNA polimerasas. Los pasos involucrados en todo el montaje hibridación in situ se ilustran brevemente en la Figura 2. Coloración púrpura observado después de la hibridación con ribosonda de interés representa tanto la abundancia y los sitios de expresión de genes en particular. Por ejemplo PC5.1 muestra expresión muy discreta en la parte anterior y posterior de la vesícula ótica y el primordio de la línea lateral en 24hpf y está fuertemente localizados dentro de los neuromasts línea lateral anterior y posterior al 72 HPF (Figura 3). Por el contrario PC5.2 espectáculos expresión ubicua dentro del SNC con la regionalización distinto dentro de los somitas, vesícula ótica y el conducto pronephric y es altamente expresado en el hígado y el intestino en 96 HPF (Figura 4). La ausencia de la expresión génica utilizando las respectivas ribosondas sentido sirve como un control negativo. ( 4b). Los análisis de expresión de marcadores de la sangre mostraron tinción de SCL/tal-1 dentro de las células craneales bilaterales y en la masa celular intermedia (ICM). Aunque la tinción de gata-1 también se observa dentro de la ICM el patrón de expresión es diferente. Se observó la expresión de flk / kdrl dentro de la parte posterior del cerebro, entre segmentos principales y los vasos y en el ICM (Figura 5). Se observó la tinción para Shh en la notocorda (Figura 5). La expresión de DLX2 en 34 HPF se localiza en el telencéfalo, diencéfalo, el hipotálamo y arcos ectomesenchymal craneales y la expresión fkd7/foxa1 a las 24 HPF se observa principalmente en la placa de piso y hypochord. Los patrones de expresión de los marcadores pancreáticos mostraron tinción de insulina en el páncreas endocrino y tripsina en el páncreas exocrino (Figura 6). Estos resultados muestran patrón de expresión con alta resolución representa el éxito del protocolo descritopara la detección de la expresión de ambos genes de alta y baja abundantes. Para mayor claridad de las imágenes pueden ser tomadas mediante microscopía confocal después de montar los embriones en un portaobjetos de microscopio 20. Algunos de los ejemplos de los resultados obtenidos en el experimento se llevó a cabo en condiciones sub-óptimas durante la optimización del protocolo se muestran en la Figura 7. Alta señal de fondo con una mala expresión de shh se observó bajo permeabilización inadecuada y la hibridación entre 55-60 º C.

Figura 1
Figura 1. Cestas de malla de preparación y uso de Eppendorf-nylon para sujetar protagonizaron embriones. Un pozo puede contener seis cestas de malla de nylon-Eppendorf. La imagen muestra las placas estériles de 6 pocillos que contienen seis cestas de malla de nylon-Eppendorfutilizado para diluciones sucesivas de metanol en PBS.

La figura 2
Figura 2. Diagrama que muestra los pasos a seguir en el conjunto de montaje en la técnica de hibridación in situ. Después de la fijación por etapas embriones pueden ser almacenados en metanol a -20 ° C hasta su uso. Las sondas pueden ser sintetizados por adelantado y se mantuvieron a -80 ° C. Sondas Almacenamiento en pequeñas alícuotas es aconsejable si se quiere que se utiliza durante largos periodos de tiempo. En general todo el montaje en experimentos de hibridación in situ se puede completar en 3 o 4 días. La reacción de tinción de genes débilmente expresado tendrá un máximo de 16 horas a temperatura ambiente o más en la reacción de tinción se lleva a cabo a 4 ° C Pulse aquí para ampliar la fIGURA.

Figura 3
Figura 3. La expresión de PC5.1 por todo el montaje en los análisis de hibridación in situ se llevó a cabo utilizando 24 HPF y 72 hpf embriones por etapas. (A) vista lateral de 24 hpf embriones muestran una expresión muy discreto de PC5.1 dentro de la anterior y parte posterior de la vesícula ótica y el primordio de la línea lateral con PC5.1 ribosonda antisentido. A los 72 se observó tinción específica HPF dentro de los neuromasts línea lateral anterior y posterior. (B) La ausencia de la expresión génica mediante PC5.1 sentido ribosonda sirve como control negativo. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

gether.within-page = "always"> Figura 4
Figura 4. En 24 HPF y 96 HPF todo el montaje en los análisis de hibridación in situ de PC5.2 se llevó a cabo utilizando PC5.2 anti-sentido y ribosondas sentido. (A) vista lateral de 24 HPF embriones muestran expresión ubicua dentro del SNC, somitas vesícula ótica y el conducto pronephric. Tinción específica en el hígado y el intestino se ve en 96 HPF con PC5.2 ribosonda antisentido. (B) La ausencia de la expresión génica mediante PC5.2 sentido ribosonda sirve como control negativo. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. Figura 5 Todo el montaje en los análisis de hibridación in situ a las 24 HPF usando SCL/tal-1 ribosonda mostró tinción dentro de las células craneales bilaterales y en la masa celular intermedia (ICM); gata-1 ribosonda tinción se ve en la ICM; la flk expresión / kdrl dentro de la parte posterior del cerebro, principal, y los vasos intersegmentales y en el ICM. Se observó la tinción para Shh en la notocorda.

La figura 6
. Figura 6 Todo el montaje en los análisis de hibridación in situ en 34 HPF con DLX2 ribosonda reveló expresión de DLX2 en el telencéfalo, diencéfalo, el hipotálamo y arcos ectomesenchymal craneales, la expresión fkd7/foxa1 a las 24 HPF se observa principalmente en el suelo ptarde y hypochord; tinción de insulina se observa en el páncreas endocrino y la expresión de tripsina en el páncreas exocrino.

La figura 7
Figura 7. Permeabilización adecuada y temperatura de hibridación adecuada son fundamentales para borrar las señales de hibridación in situ. Todo el montaje en los análisis de hibridación in situ a las 24 HPF y 48 HPF utilizando una ribosonda shh reveló expresión dentro de la notocorda y la placa del piso sin señal de fondo cuando los embriones se permeabilized por digestión con proteinasa K durante 12-15 min y se hibridaron a 70 ° C. Se observaron patrones de expresión incompletas y las señales de fondo altas cuando los embriones fueron sometidos a digestión insuficiente (5 min proteinasa K tratamiento) o hibridado a baja temperatura (60 ° C). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

Hemos desarrollado métodos mejorados para visualizar ARN con alta resolución. La hibridación in situ en los procedimientos se llevan a cabo utilizando simples cestos hechos a medida con fondos porosos (Figura 1). Los embriones se procesaron utilizando soluciones libres de RNasa en placas de 6 pocillos a temperatura ambiente en condiciones estériles.

Para segregar embriones cestas están hechas de diferentes tubos Eppendorf de colores. Cestas con o sin un borde se utilizan para facilitar la orientación y para identificar los embriones dentro de la canasta, como corresponde a una investigación particular.

La prehibridación a 65 º C y la hibridación a 70 ° C con 50% de formamida desionizada se encontró que era particularmente importante para obtener señales de alta resolución. Además la incubación de embriones dos veces con tampón Tris alcalina durante 15 min después de PBST se lava después de la incubación con anticuerpo anti-DIG y antes de la incubación en presencia de BCIP yNBT facilita la aparición de señales claras de alta calidad. En nuestras manos hemos experimentado que la permeabilización y fijación de los embriones para el tiempo óptimo e hibridación a 70 ° C fueron muy crítico en la obtención de señales claras. Permeabilización inadecuada produce señales de alta de fondo. Permeabilización extendida o de fijación inadecuada como resultado la degradación de los embriones, mientras que una fijación prolongada inhibida detección de la señal. Hibridación entre 55-60 º C también produce señales de alta de fondo (Figura 7).

La sonda sentido detectará una señal para la transcripción COMO si el gen de interés codifica antisentido (AS) transcripciones. Después de que se detuvo la reacción de tinción colocar los embriones en metanol durante 30 minutos o más convierte la señal a un cierto color de púrpura, y elimina la tinción no específica. Fija los embriones se pueden almacenar en la oscuridad en una solución de parada a 4 º C durante varios meses.

Las ventajas y disadvantages de DESEO

Deseo es una técnica eficaz para caracterizar tanto la expresión temporal y espacial de los genes diana durante la embriogénesis y estadios larvarios. Este protocolo también permite la visualización de la expresión del ARN de dos genes o co-localización de ARN y la expresión de proteínas al mismo tiempo, utilizando las modificaciones apropiadas, dependiendo de los objetivos experimentales. Este protocolo de alta resolución se puede utilizar para detectar la expresión de ARN en muchos tejidos y tipos de células. Se puede utilizar para la detección de especies muy bajos abundantes de ARN con las señales de un mínimo de fondo. Sin embargo, para visualizar la expresión exacta de los genes dentro de compartimientos interiores de los tejidos requiere la hibridación in situ utilizando secciones de tejido.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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