Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Published 11/06/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Catadores têm potencial para translocam infecciosas transmissíveis prions encefalopatia espongiforme em suas fezes para áreas livres da doença. Nós métodos de detalhes usados ​​para determinar se prions de scrapie mouse adaptados permanecer infeccioso após a passagem que o trato digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), o consumidor comum de animais mortos.

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Fischer, J. W., Nichols, T. A., Phillips, G. E., VerCauteren, K. C. Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species. J. Vis. Exp. (81), e50853, doi:10.3791/50853 (2013).

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Abstract

Material de príon infeccioso (PrP Res) é provável que a causa da fatal, neurodegenerativa Encefalopatia Espongiforme Transmissível (EET) doenças 1. A transmissão de doenças TSE, tais como a doença debilitante crónica (CWD), presume-se ser de animal para animal de 2,3, bem como a partir de fontes ambientais 4-6. Catadores e carnívoros têm potencial para translocação de material PrP Res através do consumo e excreção de carniça contaminados com CWD. Trabalhos recentes tem documentado passagem de material PrP Res através do sistema digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), um limpador norte-americano comum 7.

Nós descrevemos os procedimentos utilizados para documentar a passagem de material PrP Res através corvos americanos. Crows foram tratadas por gavage com RML-deformação scrapie adaptado do rato e suas fezes foram coletadas 4 post hr gavage. Fezes galinha foram em seguida reunidas e injectadas por via intraperitoneal emC57BL / 6. Ratos foram monitorados diariamente até que eles manifestaram sinais clínicos de rato scrapie e foram, posteriormente, submetidos à eutanásia. Camundongos assintomáticos foram monitoradas durante 365 dias após a inoculação. Análise de Western blot foi realizada para confirmar o estado da doença. Os resultados revelaram que os príons infecciosos permanecer depois de viajar através do sistema digestivo de corvos e estão presentes nas fezes, causando doença em ratos de teste.

Introduction

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são desordens neurodegenerativas fatais infecciosas que afetam a vida selvagem, os animais domésticos e seres humanos. O agente infeccioso de doenças TSE parece ser isoformas deformadas ou patogênicos (PrP Res) de uma proteína príon. EET animal incluem doença debilitante crônica (CWD) em veados (Odocoileus hemionus), veados de cauda branca (Odocoileus), alces (Cervus elaphus) e alce (Alces alces); scrapie em ovinos e caprinos; encefalopatia espongiforme bovina ( BSE) em gado doméstico; encefalopatia mink transmissível em mink viveiro; encefalopatia espongiforme felina em gatos; exótico encefalopatia espongiforme ungulados em exótico jardim zoológico rumina da família dos bovídeos, e encefalopatia espongiforme em primatas não humanos 8. A doença TSE humano único, a doença de Creutzfeldt-Jakob variante, é raro e pensado para ser adquirida através do consumo de PrP Res-contaminalimentos ciado 9. Da mesma forma, a EEB pode infectar os seres humanos se carne contaminada é consumida 10. De todas as doenças TSE, scrapie e CWD são os dois únicos com epidemias auto-sustentáveis ​​e fontes de infecção se presume ser de animal para animal 2,3,11, bem como a partir de fontes ambientais 4-6. A pesquisa sugere que a maioria das doenças TSE exigem períodos de incubação prolongados notáveis ​​de eventos de exposição naturais de PrP Res a manifestação de sinais clínicos 2-4,6,8 e barreiras de espécies aparentes minimizar, mas não eliminar o potencial de, a transmissão entre espécies 12-14 .

Identificar mecanismos para a propagação do príon infeccioso (PrP Res) o material é extremamente importante para responder a perguntas sobre como as doenças TSE mover por toda a paisagem. Estudos experimentais têm sugerido que os insetos 15,16, aves e suínos 17, e os corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos) 7,18 são portadores passivos ou dispersores de material PrP Res. A passagem de material de PrP Res através do sistema digestivo de corvos foi recentemente documentado, demonstrando o papel que podem desempenhar na dispersão de doenças TSE 7. Estes resultados tornam plausível que corvos, um limpador, poderia encontrar, consumir e transportar o material infeccioso via deposição de fezes, para áreas livres da doença.

Os procedimentos que demonstram aqui foram usados ​​para documentar a passagem de material PrP Res através do sistema de digestão de corvos e vai facilitar muito a aplicação destes métodos para outro limpador e modelos específicos de espécies de carnívoros em futuras pesquisas relacionadas. Neste estudo foram utilizados os métodos convencionais para investigar um meio não-convencionais de tráfico de material PrP Res, o que poderia contribuir para a disseminação e carga global de material PrP Res.

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Protocol

Nosso protocolo foi adaptado de um nós publicado anteriormente 7. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA), de animais e plantas Serviço de Inspeção de Saúde (APHIS), Wildlife Services (WS), Centro Nacional de Pesquisa da Vida Selvagem (NWRC) Institutional Animal Care e Use.

1. Corvo Gavaging

  1. Estimar o tempo de passagem do 'material cerebral pseudo' através do trato digestivo de corvos americanos.
    1. Misture 5 ml de cozidos e ovos mexidos inteiro com corante azul e gavage um corvo com um 2 em agulha gavage (Figura 1).
    2. Verifique corvo a cada 30 minutos até que azul / fezes verdes com manchas não estão mais sendo excretado.
  2. Obter RML (Chandler tensão) infectados C57BL / 6 cérebros não infectados e doentes terminais do mouse.
  3. Gerar a 20% peso / volume normal e infectado homogeneizado mouse-cérebro em um homogeneizador de bala liquidificador com 1xsalina tamponada com fosfato (PBS) e esferas de vidro, em seguida, centrifugar a 3.000 g durante 1 min para remover as partículas maiores. Remover o sobrenadante e dilui-se com um volume igual de PBS 1x para gerar a 10% em peso / volume em PBS estéril. Congelar a -80 ° C até ser necessário.
  4. 17 horas antes da gavage remover comida, mas não de água, a partir de penas de galinha.
  5. Aleatoriamente alocar corvos para os grupos de tratamento e por via oral gavage cada corvo com 5 ml de homogeneizado normal ou infectado cérebro do rato usando um 2 em agulha gavage.
  6. Transferência de corvos para gaiolas individuais e coletar e agrupar todas as fezes dentro de cada gaiola para 4 post hr gavage (Figura 2).
  7. Homogeneizar fezes reunidas para cada corvo num homogeneizador bala misturador com esferas de vidro, até uma textura uniforme. * Fezes galinha são na maior parte de líquido e pode ser misturado facilmente.
  8. Para cada corvo, diluir a 500 ul de homogeneizado fecal em 9,5 ml de 1x PBS para um volume total de 10 ml.
  9. Centrifugar a homogena fecalte durante 15 minutos a 1400 xg e extrair o sobrenadante.
  10. Para minimizar o risco de uma infecção microbiana secundária, tratar o sobrenadante com 1 ml de 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (Invitrogen, EUA) por cada 100 mL de homogeneizado, em seguida, colocar sob luz UV a temperatura ambiente durante 20 min para reduzir risco de contaminação viral e bacteriana. Após a exposição à radiação UV, as amostras sonicate em 3000 um Mp sonicador em configuração 70 para 30 segundos para romper a membrana de qualquer micróbio restantes.

2. Rato Inoculação

  1. Aleatoriamente alocar ratos para os seguintes grupos de tratamento (Tabela 1):
    1. Grupo 1 - camundongos positivos do tratamento inoculado por via intraperitoneal (IP) com 1 ml de homogeneizado fecal de corvos oralmente tratadas por gavage com 5ml de camundongo infectado cérebros.
    2. Grupo 2 - Negativo camundongos inoculados tratamento IP com 1 ml de homogeneizado fecal de corvos oralmente tratadas por gavage com 5ml cérebros de camundongos normais.
    3. Diluir infected e normal homogeneizado cérebro do rato para Grupos 3 e 4 a 1:100 w / v em 1x PBS.
    4. Grupo 3 - murganhos de controlo positivo IP inoculados com 1 ml de homogeneizado de rato infectado-cérebro.
    5. Grupo 4 - Negativo ratinhos de controlo inoculados IP com 1 ml de homogeneizado de cérebro de rato normal-.
Grupo de Tratamento Número de animais
Grupo 1 Scrapie + Corvo Fezes 100
Grupo 2 Scrapie - Corvo Fezes 25
Grupo 3 Scrapie + Mouse Cérebro 10
Grupo 4 Scrapie - Rato Cérebro 5

Estatuto Tabela 1 Scrapie de inóculo (+ positivo, negativo -). Eo número de animais utilizados 7.

  1. Intraperitoneal inocular mouse:
    1. Scruff rato por dorsal pele do pescoço com o polegar eo dedo indicador e rode suavemente para expor o lado ventral.
    2. Elevar extremidade posterior do mouse assim que a cabeça é um pouco menor.
    3. Insira 25 G agulha através de um centímetro de pele, um centímetro lateral da linha média, e 1-2 cm anterior à articulação sacro-ilíaca, utilizando uma seringa de agulha de bloqueio.
    4. Injectar 1 ml inocular lentamente rato cavidade do corpo.

3. Rato de Monitoramento

  1. Monitorar os ratos diariamente até que eles expressam sinais clínicos de rato scrapie. Os sinais clínicos podem incluir: cifose, ataxia, rabo duro, falta de higiene, emagrecimento e letargia.
  2. Pontuação ratos para cada um dos seis sinais clínicos, quando os sinais visíveis são evidentes, em que 0 = nenhum visível, 1 = moderado, 2 = e grave.
  3. Eutanásia ratos quando escores totais diárias para cada signo atingir ≥ 8 para 1 dia, ≥ 6 continuamente por 3 dias, ou aos 365 dias após a inoculação (dpi).
  4. Cérebros colheita imediatamente após euthanÁsia e armazenar a -70 ° C.
  5. Para confirmar um diagnóstico de scrapie, digerir as amostras de cérebro com 3 mL de um 50 ug / ml de solução de proteinase K (PK) diluídos como se segue: 3.1. ul PK, 12,5 uL de EDTA 500 mM, pH 8, 109,39 ul de 1x PBS durante 30 min a 45 ° C, em seguida, desactivar o PK adicionando 8 ul de tampão de carga e incubando amostras a 95 ° C durante 5 min. Carregar as amostras num gel de SDS-PAGE a 12%, electroforese e transferência para (PVDF) Immobilon membrana e bloqueio com 5% de leite desnatado em 0,2% de Tween 20 em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida sondar com Bar224 anticorpo monoclonal anti-PRP conjugado com peroxidase de rábano, diluído em Superblock, durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar membrana durante 1 hora com PBS-Tween 20 a 0,2%. Para visualizar, incubar Western blot 5 min com substrato quimioluminescente e imagem em um sistema de documentação de gel G-box.

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Representative Results

Os procedimentos utilizados demonstram que o sistema digestivo do corvos não elimina PrP Res. infecciosidade 4 h após gavagem oral de homogeneizado de cérebro scrapie 7. Todos os vinte corvos que foram tratadas por gavage com material PrP Res posteriormente transmitidos material de PrP Res via fezes de ratos. Ratos doentes foram identificados pela manifestação dos sinais rato-scrapie clínicos e confirmação da doença foi completada por análise de Western blot.

Investigação do tempo de retenção de material ingerido por corvos revelou tempo de passagem através do tracto digestivo de um corvo tratadas por gavage a ser de 4 h, com base na presença de corante nas fezes (Figura 1). Todas as fezes foram coletadas com pipetas descartáveis ​​e agrupados para cada corvo (Figura 2). Toxicidade aguda a partir de fezes de galinha não tratados ocorreu quando sobrenadante fecal-prima foi injetado em ratos IP de teste-piloto. Ao tratar inocular fecal com penicilina e streptomycin, luz UV, e sonificação que aliviou este problema.

Todos os ratinhos inoculados com ou cérebro de ratinho do tremor epizoótico-positivo (9/9) ou a partir de fezes corvos inoculados com scrapie (66 * / 84) desenvolveram sinais clínicos e testaram positivo por análise de Western blot (Figura 3), que ilustra que o tremor epizoótico prontamente passada através do sistema digestivo de corvos e doença causada. * Dezoito ratos morreram no prazo de 3 dias da inoculação, provavelmente devido a toxicidade. Todos, exceto um (1/23) camundongos inoculados scrapie-negativos foram negativos pela análise de Western blot. Nossa hipótese é que este rato foi inadvertidamente inoculadas com fezes de galinha scrapie-positivas em vez de fezes de um corvo scrapie-negativo.

Figura 1
Figura 1. Corvo restringido manualmente e tratadas por gavage oral com 5 ml de ovo inteiro misturadas com corante azul (A) e blue / fezes verde manchada de 4 post hr gavage (B). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2
Figura 2. Coleta de fezes Corvo com pipeta antes da homogeneização. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. . Representante SDS-página Western blot do cérebro do rato a partir de bioensaios homogeneizado NBH normal cérebro do rato, scrapie-negativos, TX gaiola 4 - cérebro de um camundongo inoculados com fezes de um corvo inoculados com scrapie. Com (+) e without (-). PK (proteinase K) digestão Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Discussion

Nós demonstramos um procedimento para documentar a passagem de material de PrP Res através do sistema digestivo de corvos. Usamos métodos convencionais para determinar se os corvos têm a capacidade de translocação de material PrP Res para áreas geográficas livres da doença. Outros avaliaram a resistência de PrP Res para ruminantes 19-21 e roedores 22,23 fluidos digestivos, sendo que ambos não conseguiram eliminá-lo. A futura aplicação destas técnicas devem ser aplicadas a outros carnívoros 24 como eles também poderiam encontrar material PrP Res em carniça e transportar este material em toda a paisagem facilitando a propagação de doenças de príon.

Nós adicionamos corante azul para o nosso ovos mexidos material "pseudo cérebro ', fornecendo uma maneira simples de avaliar o tempo aproximado de passagem cérebro homogeneizado do mouse através do trato digestivo dos corvos. Aconselhamos os outros, considerando que esta técnica primeiros insPect existente cor das fezes dos animais de estudo e, em seguida, usar corante alimentício que é mais contrastantes. Isto irá permitir a fácil identificação de cor alimento material manchado que passou por animais do estudo. Optamos por usar corante alimentar para estimar o tempo de passagem, mas outros autores utilizaram o pigmento fluorescente 25, óxido férrico 26, os marcadores de plástico colorido 27, e flocos metálicos coloridos (ie brilho) 28.

Minimizar a ameaça de uma infecção microbiana secundário a partir de fezes de galinha e inoculando corretamente os ratos são pontos de partida fundamentais para estudos de mouse-prião que requerem longos períodos de incubação. Se qualquer uma dessas considerações são violados, mortalidade precoce do mouse é provável que resulte.

Outra ferramenta possível para a investigação é a proteína de série misfolding amplificação cíclica ou sPMCA para avaliar amostras de fezes de galinha ao longo do tempo para estabelecer quanto tempo depois corvos sonda oral passar material infeccioso, coma necessidade de um bioensaio em ratos. Os recentes avanços na análise fecal PMCA por Pulford, et al. Indicam que a amplificação dos níveis de príons minutos pode ser detectada em mamíferos fezes 29, sugerindo PMCA também pode ser uma ferramenta útil para a avaliação de fezes de aves. O bioensaio e sPMCA abordagem poderia ser utilizado para avaliar a infecciosidade residual nas fezes dos corvos tratadas por gavage com materiais infectados com CWD. Uma linha de camundongo transgênico cervidized seria necessário e intracerebral contra inoculação intraperitoneal daria resultados mais rápidos.

Catadores Avian, como corvos, abutres e águias, poderia desempenhar um papel na propagação de doenças TSE, ou seja, CWD na América do Norte. Estas espécies podem consumir tecido CWD-positivo a partir de carcaças doentes ou vísceras (no caso dos cervídeos matou-caçador) e translocar material infeccioso em suas fezes para áreas livres de CWD ou populações de cervídeos. Como a prática da alimentação de grãos para cervídeos, em natureza ou em cativeirodefinições, atrai corvos que pode defecar sobre a fonte de alimento e ser inadvertidamente consumidas por cervídeos, é, portanto, uma prática de alto risco (Vercauteren observação pessoal). Além disso, embora as chances de animais livres de CWD encontrando material de PrP Res através das fezes deposição aleatória pode ser baixo, áreas onde corvos e, portanto, suas fezes estão concentrados, como abaixo locais roosting comuns, poderia tornar-se de áreas de alto risco para a transmissão da doença desde prions são tão persistentes no ambiente 30,31.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a S. Werner para fornecer os corvos utilizados neste estudo e USDA, APHIS, WS, NWRC equipe de cuidados de animais para cuidar dos animais e monitoramento. Mencione ou utilização de um produto não implica o endosso do USDA. O financiamento para este estudo foi fornecido pelo USDA, APHIS, Serviços Veterinários.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice Hilltop Lab Animals
American crows wild captured
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered Saline Invitrogen 70011-044
Sonicator Misonix
Proteinase-K solution Roche 3115887001
Loading buffer Invitrogen NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel Invitrogen NP0342
Immobilon PVDF membrane Millipore 1SEQ00010
Tween 20 Sigma Aldrich P2287
Bullet blender homogenizer Braintree Scientific BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody Cayman Chemical 10009035
Superblock Thermo Scientific 37517
chemiluminescent substrate Millipore WBKLS0500
G-box gel documentation system Syngene

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References

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