Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.

Cite this Article

Copy Citation

Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Deze technologie heeft laten zien potentieel in het aanpakken van eerder uitdagende toepassingen, met inbegrip van, levering aan primaire immune cellen, cellen herprogrammeren, koolstof nanobuis, en quantum dot levering. Deze vector vrij microfluidic platform gebaseerd op mechanische verbreking van de celmembraan cytosolische levering van het doelmateriaal te vergemakkelijken. Hierin beschrijven we de gedetailleerde methode voor het gebruik van deze microfluïdische apparaten, waaronder, inrichtingsamenstel, cel voorbereiding en werking van het systeem. Deze aflevering aanpak vereist een korte optimalisatie van het type apparaat en voorwaarden voor u onaangekondigd toepassingen. De verstrekte instructies zijn generaliseerbaar naar de meeste celtypes en levering materialen als dit systeem niet gespecialiseerde buffers of chemische modificatie / vervoeging stappen vereisen. Deze werkzaamheden bieden ooks aanbevelingen over hoe de prestaties van het apparaat te verbeteren en trouble-shoot mogelijke problemen in verband met verstopping, lage levering efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen.

Introduction

Levering van macromoleculen aan het cytoplasma is een cruciale stap in therapeutische en wetenschappelijke toepassingen. Nanodeeltjes gemedieerde aflevering, bijvoorbeeld, is potentieel getoond gentherapie 1,2, terwijl eiwitlevering is een veelbelovende manier beïnvloeden celfunctie in zowel klinische en laboratorium 3 4 instellingen. Andere materialen, zoals kleine moleculen, quantum dots, of goud nanodeeltjes, van belang zijn in toepassingen variërend van kankertherapieën 5,6 intracellulaire etikettering 7,8 en single molecule volgen 9.

Het celmembraan is grotendeels ondoorlaatbaar voor macromoleculen. Veel bestaande technieken gebruiken polymere nanodeeltjes 10,11, liposomen 12 of chemische modificaties 13 tot membraan verstoring of endocytotische levering te vergemakkelijken. In deze werkwijzen, de levering efficiëntie en cel levensvatbaarheid vaak afhankelijk zijn van de structuur van ee doel molecuul en het celtype. Deze methoden kunnen in werking treden bij de levering van structureel uniform materiaal, zoals nucleïnezuren, maar zijn vaak niet geschikt voor de levering van structureel diverse materialen, zoals eiwitten en 14,15 nanomaterialen 7. Bovendien is de endosoomdisruptie mechanisme dat de meeste van deze werkwijzen afhankelijk is vaak inefficiënt, dus waardoor veel materiaal opgesloten in vesikel structuren 16. Tot slot, methoden die vaak ontwikkeld voor gebruik met gevestigde cellijnen niet goed vertalen naar primaire cellen.

Membraan perforeren methoden, zoals elektroporatie 17,18 en sonoporatie 19, zijn een aantrekkelijk alternatief in sommige toepassingen, maar zijn ze bekend om lage levensvatbaarheid van de cellen veroorzaken en kan worden beperkt door de lading van de doelgroep levering materiaal.

Rapid mechanische vervorming van de cellen, een microfluïdische benadering van de levering, heeft onlangs demonstrated zijn voordelen ten opzichte stroom in de context van de cel herprogrammering 20 en nanomateriaal levering 21. Deze methode berust op mechanische verbreking o de celmembraan cytosolische levering van materialen aanwezig in de omringende buffer vergemakkelijken. Het systeem heeft aangetoond waardoor potentieel in eerder uitdagende celtypen (bijv. primaire immune cellen en stamcellen) en materialen (bijvoorbeeld antilichamen en koolstof nanotubes). Hierin wordt de algemene procedure voor deze apparaten voor intracellulaire afgifte van target macromoleculen beschreven. De procedure is generaliseerbaar voor de meeste celtypes en levering materialen, maar het wordt aanbevolen dat men voeren een kort optimalisatie van de voorwaarden, zoals omschreven in onze eerder gemelde ontwerprichtlijnen 20, voor alle eerder aangegeven toepassingen. Tot op heden is het systeem met succes gebruikt voor de levering van RNA, DNA, goud nanodeeltjes, quantum dots, koolstof nanobuisjes, eiwits en dextran polymeren 20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opslagruimte

  1. Bewaar de reservoirs, houders, O-ringen en microfluïdische apparaten in 70% ethanol. Gebruik een container (bijv. een potje of beker) die een deksel om verdamping en besmetting te voorkomen door stof of buiten deeltjes heeft. Plaats de apparaten in een houder (1), reservoirs en O-ringen in een tweede houder (2), en houders in de derde (3).

Opmerking: het gebruik van 70% ethanol gedurende opslag is om steriliteit te handhaven. Als de enige componenten van de oplossing zijn ethanol en water (dus geen denaturering agenten), moeten alle onderdelen van het systeem volledig compatibel en zal niet na verloop van tijd.

  1. Wijzig ethanol-oplossing in containers (2) en (3) voor elk gebruik om kruisbesmetting over experimenten te voorkomen en de aanwezigheid van ongewenste deeltjes die verstopping kunnen veroorzaken minimaliseren.

2. Experiment Voorbereiding

  1. Plaats containers (2) en (3) in een ultrasoon bad for 5-10 min voor elk gebruik. Dit helpt verwijder alle vervuilende deeltjes uit eerdere experimenten.
  2. Schone werkplek in bioveiligheid kast met 70% ethanol-oplossing.
  3. Spuit alle materialen (3 containers, en pincet) met een 70% ethanol-oplossing alvorens ze in de bioveiligheid kast.

3. Montage

  1. Vastgelegd 2-3 pluisarme doekjes in het werkgebied.
  2. Verwijder de plastic reservoirs uit hun container met een pincet en leg ze op de doekjes om verdamping van ethanol-oplossing van inwendige oppervlakken te vergemakkelijken. Tik voorzichtig de reservoirs op het oppervlak of blaas lucht door hen om de verwijdering van de ethanol-oplossing te vergemakkelijken.
  3. Plaats de O-ringen in hun juiste sleuf van de reservoirs.
  4. Verwijder de houder en chips van respectievelijke houders en laat ethanol verdampen (~ 1-2 min).
  5. Gebruik een pincet om de gewenste chip face-up (dwz toegang gaten up) in de houder te plaatsen. Til de houdermet de chip naar ooghoogte te zorgen dat de chip wordt plat in de houder en corrigeer zo nodig met de pincet. BELANGRIJK: Als het apparaat niet goed past in de houder, is er een risico dat het tijdens de volgende stappen zal breken.
  6. Vervolgens, plaats voorzichtig de reservoirs op de houder en lijn ze met de clips. Zorg ervoor dat de O-ringen niet uit hun sleuven vallen tijdens dit proces.
  7. Druk licht op de reservoirs tot ze op hun plaats. Zorg ervoor dat beide zijden van de reservoirs veilig zijn en dat de chip lijkt in de juiste positie.

4. Celpreparaat

  1. Voor hechtende cellen (primaire of gevestigde lijnen): Plaat cellen 1-2 dagen voorafgaand aan het experiment zodanig dat zij niet meer dan 80% samenvloeiing op de dag van het experiment.
  2. Plaats cellen in suspensie (in PBS of relevante media) en streven naar een operationele concentratie van 1,0 x 10 6 cellen / ml tot 1,0 x 10 7 cells / ml. LET OP: Wij hebben geen significante veranderingen in de levering prestaties waargenomen als gevolg van cel concentratie.
  3. Meng cellen en de gewenste levering materiaal in een aparte buis naar de gewenste materiaal concentratie te verkrijgen voor het experiment. BELANGRIJK: Omdat de beschreven levering methode is gebaseerd op de diffusie om de levering te vergemakkelijken, zal een hogere materiaal concentratie hoger levering opleveren. Indien mogelijk, is het raadzaam om een ​​1 uM oplossing van het gewenste materiaal voor eerste proeven gebruikt. Deze concentratie kan dan in de toekomst experimenten worden getitreerd zoals nodig. De laagst gerapporteerde concentratie gebruikt met dit apparaat is 10 nM 21.

5. Operatie

  1. Pipet mengsel van cellen en levering materiaal in een reservoir (huidige ontwerp heeft een maximale capaciteit van 150 pi). OPMERKING: Bij apparaat ontwerpen zijn volledig omkeerbaar dus stromingsrichting door de kanalen doet er niet toe. Monsters kunnen in een van de twee reservoirs geladen. Bevestig druk slang aan de gevulde reservoir en draai de moer om een ​​goede afdichting (handvast is vaak voldoende) te waarborgen.
  2. Stel druk om het gewenste niveau van de regelaar. Dit bepaalt de snelheid waarmee cellen reizen door de inrichting. Merk op dat de mobiele stroom niet starten totdat de knop wordt ingedrukt.

OPMERKING: In eerdere werk, zijn stikstof of perslucht even goed werkte als het dragergas.

  1. Til het apparaat op ooghoogte en oriënteren het zo dat de vloeistof in het reservoir is goed zichtbaar. OPMERKING: Volg de vloeistof kolom af te sluiten van het systeem voordat het reservoir leeg is.
  2. Druk op de knop om het reservoir onder druk en beginnen cel flow.
  3. Wanneer het vloeistofniveau ongeveer 2 mm van de bodem van het reservoir snel het verdraaien naar 0 psi tot flowstop. Belangrijk Als een faalt om de stroom te stoppen voordat het reservoir geleegd, een risico uitwerpen het monster uit de collection reservoir. Merk ook op dat als de vloeistofkolom stilstaat op een aanzienlijke tempo of aanzienlijk vertraagd ten opzichte om haar initiële stroomsnelheid (bijvoorbeeld 3x langzamer), de gemonteerde apparaat waarschijnlijk verstopt en moet worden uitgewisseld. Het bedienen van een verstopte apparaat kan leiden tot hogere celdood.
  4. Verzamel de behandelde cellen uit de betreffende reservoir en plaats ze in de gewenste verzamelbuis / plaat. BELANGRIJK: de verzamelde cellen in elke buffers niet verwateren in dit stadium als de nomen cellen zal blijven materiaal opname voor maximaal 10 min. 20. Nadat het venster is verstreken Verdun de cellen in het gewenste medium / buffer.
  5. Om meer behandelde cellen te verzamelen of probeer alternatieve experimentele omstandigheden, herhaalt u de stappen 5,1-5,7 als nodig is. Bedenk dat de chips zijn omkeerbaar, kan dus monsters in beide reservoir worden gemonteerd. Zorg ervoor dat chips wisselen zo nodig als ze verstoppen. Gooi verstopt apparaten.

6. Demontage

  1. Plaats elk deel in de daarvoor bestemde opslagcontainer (in paragraaf 1).
  2. Plaats gebruikt chips in een aparte container voor verwijdering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 betreft een beschrijvend schema van het microfluïdische afgiftesysteem. Figuren 2a-b tonen typische resultaten van behandeling HeLa cellen met verschillende ontwerpen inrichting aanwezigheid van fluorescent geconjugeerde 3 kDa dextran 20. Als de procedure correct wordt nageleefd, zal de systeemprestaties gevoelig voor het type apparaat en operationele snelheid. Daarom moet men deze te optimaliseren voor een bepaalde toepassing alvorens complexere experimenten. In het bereik van werkomstandigheden in de figuur, cellevensvatbaarheid blijft boven 80%, maar moet men rekening mee dat suboptimale productietijd parameters (type bijv. ongepast chip) leiden tot de levensvatbaarheid beneden 30%. Zo levensvatbaarheid en levering efficiëntie moeten tegelijkertijd worden geoptimaliseerd voor elke eerder gemeld celtype. Als een apparaat ontwerp is geschikt was voor het doel cel, zal men de resultaten, variërend van geen levering aan hoge c zienell dood (de levensvatbaarheid is bijvoorbeeld 10%). Indien de experimentele omstandigheden waren ongeschikt, bijvoorbeeld doelmateriaal gebonden aan het celoppervlak, kan men niet in staat om de levering nauwkeurig het oppervlak bindende signaal de cytoplasmatische signaal maskeren.

Figuren 2c-d illustreren onze voorkeur voor het meten van levering efficiëntie binnen het live-celpopulatie. De regelkast in figuur 2c is bedoeld om alle oppervlakte binding en endocytotische effecten weerspiegelen de cellen worden blootgesteld aan de levering materiaal ten minste zolang de behandelde gevallen. De geleverde celpopulatie wordt gedefinieerd als het gearceerde gebied zodat slechts 1-5% van de controlepopulatie binnen dat gebied valt. Merk op dat eerdere werk heeft vastgesteld dat de levering in deze benadering niet wordt gemedieerd door endocytose 20. De dubbele piek verdeling waargenomen in de geleverde voorbeeld niet noodzakelijk kenmerk van het systeem zoals we have waargenomen meer en minder uniforme verdelingen voor verschillende experimentele omstandigheden.

Figuur 1
Figuur 1. S Chematic van het volledige systeem en de interface naar de microfluïdische apparaten. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten met HeLa-cellen 20. A) Delivery efficiëntie en b) cellevensvatbaarheid van HeLa cellen behandeld met 3 verschillende ontwerpen inrichting aanwezigheid cascade blue geconjugeerde 3 kDa dextran (0,2 mg / ml). In deze experimenten, de cel solution was bij een concentratie van 10 6 cellen per ml in PBS dat 3% foetaal runderserum en 1% F68 pluronics. Levensvatbaarheid werd gemeten door propidium jodide kleuring van dode cellen en productietijd resultaten worden alleen levende cellen. Alle gegevenspunten werden uitgevoerd in drievoud en foutbalken vertegenwoordigen 2 SD's. C) Een vertegenwoordiger histogram voor experimentele controle waarbij HeLa cellen werden blootgesteld aan blauw geconjugeerde 3 kDa dextran cascade ten minste even lang als een apparaat behandeld case. d) De overeenkomstige wanneer de cellen werden door het apparaat levering faciliteren. De fractie van de levende cellen bevolking die in de beschaduwde gedeelte van het histogram wordt gedefinieerd als de 'afgeleverd' bevolking. Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bepaalde aspecten van de beschreven experimentele procedure (dan chip ontwerp en werkingssnelheid factoren) moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het celtype en levering materiaal het systeem wordt toegepast. De discussie die adressen volgt een aantal van de meest voorkomende factoren te overwegen bij het ontwerpen van experimenten.

Om de levering signaal voor fluorescent gelabelde verbindingen te verbeteren, moet men bronnen van achtergrond fluorescentie te pakken. Oppervlakte binding en endocytose, bijvoorbeeld, kan worden aangepakt door wassen cellen 5-10 minuten na levering om overtollig materiaal te verwijderen voordat cultuur of verdere verwerking. Indien kiezen om een ​​wasstap afzien, zou het het beste om de behandelde cellen verdund met 5-10x in de gewenste media om de concentratie van doelmateriaal lager in de omringende oplossing en dus endocytotische verlagen. In sommige gevallen, bijvoorbeeld eiwitlevering kan men het nodig om actief de celeigenschappen surface (bijv. met niet-gemerkt runderserumalbumine) om niet-specifieke binding van de levering materiaal te minimaliseren. In een bepaalde toepassing, indien de fluorescentie-intensiteit van de onbehandelde zaak, zoals gemeten door flow cytometrie, is dan tien jaar hoger dan de endocytose controle dan oppervlaktebindingseigenschappen / endocytose kan een probleem zijn. Merk op dat problemen met de achtergrond signaal zijn alleen relevant voor de directe fluorescerende detectie van de levering materiaal, functionele testen (bijv. cel herprogrammering) zijn meestal niet beïnvloed als endocytosed of aan de oppervlakte gebonden materiaal zijn vaak inactief.

Om de levensvatbaarheid van cellen na behandeling te verbeteren, moet men de hoeveelheid van de verwerking na de oplevering te minimaliseren. Het wordt aanbevolen dat men het vermijden van buitensporige centrifugeren en wassen stappen en overdracht cellen in hun gewenste media in een couveuse 5-10 minuten na de bevalling is voltooid. In aanhangend lijnen, worden de cellen vaak volledig verkleefd en te delen binnen de 24 uur na de behandeling. Zoals besproken vorigeiously 20, er is geen lange-termijn bijwerkingen van het gebruik van deze techniek waargenomen.

De microfluïdische apparaten die worden gebruikt in deze aflevering systeem zijn gevoelig voor verstoppingen in de tijd. Klompen vormen vaak de vernauwing omdat het de smalste functie op het apparaat. Verstopping kan worden veroorzaakt door beschadigde cellen of door milieuverontreinigende stoffen. Effect van deze laatste kan worden geminimaliseerd door te zorgen voor een schone, stofvrije omgeving voor het bedienen van de apparaten (bijv. een goed onderhouden bioveiligheid kast). Voor cellijnen aanbevolen passages cellen 1-2 dagen voor levering teneinde de aanwezigheid van celresten in de verkregen suspensie minimaliseren. Bij het bedienen van het apparaat, moet men zich bewust van de volumestroom van de vloeistof in het reservoir. Als het debiet daalt tot minder dan een derde van zijn aanvankelijke snelheid, kan het apparaat excessief celdood en moet worden uitgewisseld, of de stroomrichting omgekeerd. Potentiële verstopping problemen kunnen ook worden mitigated door het passeren van de celsuspensie door een 40 um cel zeef mesh. Dit proces zorgt voor een enkele cel suspensie waardoor potentiële klompen voorkomen van de vorming in de ruimere, lage stroomsnelheid delen van de chip.

Bij het ontwerpen van experimenten ander afleveradres materialen, moet men rekening houden met de grootte van het doelmateriaal en de concentratie. Aangezien deze technologie berust op de passieve diffusie van materiaal over de verstoorde celmembraan, de molaire concentratie gradiënt en de hydrodynamische straal van levering materiaal de snelheid van diffusie geregeld - uitgaande membraan verstoringen zijn groot genoeg om het materiaal tegemoet. Het is dus raadzaam om hoge molaire concentraties (bijv. 1 uM) van grote doelmaterialen opzichte van hun kleinere tegenhangers gebruiken. De techniek heeft aan een doeltreffende bij concentraties zo laag als 10 nM bij quantum dot levering 21 aangetoond. Bovendien is de techniek not gedacht te worden beperkt door de aard van het doelgegevensdrager stoffen dan in het kader van materiaal shape and diffusie (bijv. een lage diffusiviteit materialen krijgen lagere productietijd efficiëntie en materiaal groter dan de grootte van de verstoringen waarschijnlijk kan niet in het cytoplasma).

Studies in cel herprogrammering en quantum dot levering zijn de sterke punten van de cel knijpen benadering ten opzichte van elektroporatie geïllustreerd. Op basis van de huidige kennis van het membraan verstoring mechanismen deze twee technieken, lijkt het erop dat cel knijpen een significant voordeel in toepassingen waarbij eiwitten, kleine moleculen en nanomaterialen 20,21. Het contrast tussen de twee methoden in toepassingen waarbij nucleïnezuren (die sterk betalen vergeleken met de eerder genoemde materialen) is onduidelijk.

Deze microfluïdische benadering productietijd berust op mechanische verbreking van de celmembraanpassieve diffusie van materiaal te vergemakkelijken in de cel en is aangetoond voor diverse celtypes 20 zijn. Het systeem is derhalve in principe geschikt voor de cytosolische levering van bijna elk materiaal op bijna elk celtype. Wij geloven dat de voordelen van het systeem het meest uitgesproken in geval van traditioneel moeilijk primaire cellen te transfecteren (bijvoorbeeld immuun-en stamcellen) en conventioneel uitdagende materialen (bv. eiwitten, quantum dots, koolstof nanobuisjes en RNA). De bovengenoemde mogelijkheden in immune en stamceltoepassingen wordt benadrukt door de tekortkomingen van traditionele leveringsmethodes aanpakken van deze celtypen. Echter, kan het systeem verder verbeterd eisen genafgifte vergemakkelijken door plasmidevectoren zoals deze toepassingen vereisen aflevering aan de kern. Kortom, we geloven dat de microfluïdische vervorming benadering van de levering kan in potentie pakken vele bestaande uitdagingen voor intracellulaire levering. De system onafhankelijkheid van chemische vectoren of elektrische velden maakt zijn robuuste toepassing op een reeks van studies. De instructies hierin voorzien moet elke geïnteresseerde onderzoekers in staat om een ​​dergelijk systeem onafhankelijk te werken en aan te passen voor hun onderzoek doeleinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs Armon Sharei, Robert Langer, en Klavs F. Jensen zijn aandeelhouders van SQZ Biotechnologie Bedrijf dat de microfluïdische apparaten die worden gebruikt in dit artikel oplevert.

Acknowledgements

Wij danken T. Shatova voor nuttige discussie over experimenteel ontwerp en data analyse. De hulp en expertise van G. Paradis, worden de personeelsleden van de flowcytometrie kern bij de Koch Instituut, en het personeel van de Microsystems Technology Laboratory van het Massachusetts Institute of Technology dankbaar erkend. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, en gedeeltelijk door de National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Subsidies P30-CA14051 en MPP-09Call-Langer-60.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27, (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats