A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tremblay, D., Cuerrier, C. M., Andrzejewski, L., O'Brien, E. R., Pelling, A. E. A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology. J. Vis. Exp. (88), e51454, doi:10.3791/51454 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Gereedschappen die het uitoefenen van mechanische krachten om cellen en weefsels of waarmee kan kwantificeren de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel dramatisch bijgedragen tot het begrijpen van fundamentele mechanobiology. Deze technieken zijn uitgebreid gebruikt om aan te tonen hoe het ontstaan ​​en de progressie van verschillende ziekten sterk worden beïnvloed door mechanische signalen. Dit artikel presenteert een multi-functionele biaxiale (BAXS) platform dat mechanisch kunnen stimuleren enkele cellen of kwantificeren van de mechanische stijfheid van weefsels. De BAXS platform bestaat uit vier voice coil motoren die onafhankelijk kunnen worden bestuurd. Enkele cellen kunnen worden gekweekt op een flexibel substraat dat kan worden bevestigd aan de motor zodat men de cellen blootgesteld aan complexe, dynamische en ruimtelijk variërende spanning velden. Omgekeerd, doordat een kracht load cell, kan ook kwantificeren de mechanische eigenschappen van primaire weefsels ze worden blootgesteld aan deformatie cycli.In beide gevallen moet een goede set van klemmen worden ontworpen en gemonteerd aan de BAXS platform motoren om stevig vast te houden het flexibel substraat of het weefsel van belang. De BAXS platform kan op een omgekeerde microscoop worden gemonteerd gelijktijdige doorvallend licht en / of fluorescentie beeldvorming uit te voeren om de structurele of biochemische reactie van het monster tijdens het spannen experimenten onderzoeken. Dit artikel geeft experimentele details van het ontwerp en het gebruik van de BAXS platform en presenteert de resultaten voor enkele cel en hele weefsel studies. De BAXS platform werd gebruikt om de vervorming van kernen in enkele muis myoblast cellen in reactie meten spanning substraat en de stijfheid van geïsoleerde muis aorta meten. De BAXS platform is een veelzijdig instrument dat kan worden gecombineerd met verschillende optische microscopie om nieuwe mechanobiologische inzichten op de sub-cellulair, cellulaire en hele weefsel niveaus bieden.

Introduction

De mechanische micro speelt een belangrijke rol in vele celfuncties zoals proliferatie, migratie en differentiatie, die een grote invloed hebben op de ontwikkeling en homeostase van weefsels en ook ziekten 1-6. In de loop der jaren, hebben een veelheid van experimentele instrumenten gebruikt om mechanisch te stimuleren cellen of weefsels en meet mechanische eigenschappen van biologische weefsels met als doel het vergroten van ons begrip van de fundamentele mechanobiology en het bestuderen van het ontstaan ​​en de progressie van ziekten 6-17. Men moet echter vaak afhankelijk van verschillende experimentele apparatuur om de doelstellingen van een bepaalde studie te bereiken. Dit artikel presenteert een enkele, multi-functionele, biaxiale (BAXS) platform dat zorgt voor studies die de rol te onderzoeken dat de mechanische eigenschappen en de mechanische krachten spelen in de biologie aan de sub-cellulaire om hele weefsel lengteschalen. De BAXS platform biedt niet alleen voor de quantification van de mechanische eigenschappen van geïsoleerde weefsels, maar vergemakkelijkt ook het vermogen om eenvoudige, complexe en dynamische belasting velden aan levende cellen om hun reacties begrijpen strekken dat voorkomt in vivo. De BAXS platform onderhoudt ook de capaciteit om live-cell microscopie voeren tijdens mechanische testen en storingen op cellen en weefsels.

De BAXS platform is een op maat gemaakte inrichting die kan worden gebruikt om het effect van substraat vervorming onderzoeken op cellulair niveau uitvoeren tractie op biologische weefsels (Figuur 1A). Een aluminium verwarming werd vervaardigd op een standaard 10 cm Petrischaal ontvangen en fysiologische oplossingen handhaven op 37 ° C met een temperatuurregelaar en Kapton heaters (Figuur 1B). Deze BAXS platform kan worden geïntegreerd op een omgekeerde fase contrast en / of fluorescentie microscoop en maakt gelijktijdige beeldvorming (figuur 1C).Kortom, de BAXS platform bestaat uit vier lineaire voice coil motoren waarvan de bewegende delen van miniatuur lineaire beweging kogellagers georiënteerd langs twee loodrechte assen (figuur 1D) zijn gemonteerd. Een lineaire positioneertafel is gemonteerd op elk van de vier motoren verticale beweging van het klemsysteem wordt gebruikt (figuur 1E) mogelijk. De positie van elke motor wordt bewaakt door een optische encoder met een resolutie van 500 nm (figuur 1F). Alle vier de motoren worden onafhankelijk geregeld met een motion controller in dienst optische encoder feedback om beweging commando's (figuur 1G) uit te voeren. Een LabVIEW interface biedt volledige controle over de omvang verplaatsing, snelheid en versnelling van elke motor om volledig klantgerichte, statische en dynamische vervorming van de cellen of weefselmonsters genereren.

De gebruikte techniek om vervorming induceren wordt bereikt door eenvoudigweg allowing cellen stevig vasthouden aan een flexibel en transparant substraat en vervolgens stretching dit substraat met behulp van de vier motoren van de BAXS platform. De BAXS platform maakt het monteren van een op maat gemaakte set van klemmen aan het substraat op de voice coil motoren hechten. Hiervoor hebben we een reeks van klemmen waaraan een flexibel en transparant substraat van polydimethylsiloxaan (PDMS), kan worden bevestigd (figuren 2A-C en figuur 3). Als de klemmen worden blootgesteld aan fysiologische oplossingen werden alle onderdelen vervaardigd uit roestvast staal om voor sterilisatie. Deze klemmen zijn zorgvuldig ontworpen om het substraat zo dicht mogelijk bij het ​​microscoopobjectief brengen om de beeldkwaliteit te verbeteren terwijl het minimaliseren van de belasting van het substraat tijdens het spannen (fig. 2D).

Dezelfde BAXS platform kan ook worden gebruikt om de stijfheid van kleine weefselmonsters te kwantificeren, met behulp van een geschikte set van klemmen met ADAPted steunen voor de weefselmonsters en een load cell om de krachten te controleren. Verschillende benaderingen kunnen worden genomen om een ​​weefsel te monteren op het platform BAXS motoren; in dit geval de roestvrijstalen insect minutiens kunnen kan haak door de opening van vaatweefsel om trekproeven (figuren 4A-B) verricht. Als alternatief voor dikke weefsels zonder natuurlijke opening, weefsel randen ofwel plaats gehouden met klemmen aan de spreekspoel motoren of gelijmd kleine glasplaatjes met biologische lijm en aan de motoren met de klemmen. Om treksterkte voeren tests een miniatuur load cell is vereist en kan gemakkelijk worden opgenomen op de BAXS platform motoren en gebruikt om de kracht die op het weefsel tijdens een cyclus strekken (figuur 4C) meten. Aangezien de BAXS platform is samengesteld uit vier motoren, de invoering van een tweede load cell kan men trekproeven uitgevoerd langs twee orthogonale richtingen. Dit vermogen maakt het mogelijk om quantify de mechanische stijfheid van een weefsel langs twee loodrechte richtingen in hetzelfde experiment.

Belangrijk in alle configuraties, de cellen of weefselmonsters plaats altijd gehandhaafd op een temperatuur geregeld bad dat toegankelijk is voor de gebruiker. Dit vermogen maakt de invoering van farmacologische middelen in monster strekken om de temporele respons van het monster te onderzoeken. Bovendien, aangezien de optische as van de omgekeerde microscoop vrij blijft, alle vormen van microscopie nog beschikbaar voor de gebruiker. Ten slotte alle vier motoren van de BAXS platform onafhankelijk is het mogelijk om zeer configureerbare spanning velden toegepast om het monster plaats. In vivo cellen en weefsels worden blootgesteld aan complexe anisotrope strekken die geschikter nagebootst in dit platform, in tegenstelling de traditionele eenassige stretching platform 7,13,15,18,19. Bovendien zijn de fysische eigenschappenvan de veldstam on the fly kan worden gewijzigd tijdens een experiment. Deze vaardigheden kan de gebruiker de cellulaire en weefselniveau reactie op een groot aantal zeer complexe anisotrope, tijdelijk en ruimtelijk variërende spanning actiegebieden. Dit artikel beschrijft de voordelen en beperkingen van de BAXS platform, alsmede het ontwerp, de werkingsprincipes en de experimentele gegevens voor enkele cel en hele weefsel experimenten.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van de BAXS platform. A) Bovenaanzicht van de BAXS platform met de vier voice coil motor. B) Gedetailleerd beeld van de petrischaal verwarmingselement gebruikt om cellen en weefsels bij 37 ° C. C te houden) Het platform kan op een omgekeerde microscoop worden gemonteerd live- cell imaging tijdens stretching experimenten.D) Gedetailleerd beeld van de voice coil motor; het bewegende deel van het platform. E) gedetailleerd beeld van de lineaire positionering podium waardoor verticale verplaatsing van de klem-systemen. F) Gedetailleerd beeld van de optische encoder die real-time positie van de motor zorgt voor de motion controller. G) Gedetailleerd beeld van de motion controller met de vier optische encoder ingangen en vermogens om de vier voice coil motoren.

Figuur 2
Figuur 2. Spansysteem voor mobiele stretching experimenten. AB) Foto de details van de klemmen worden gebruikt om de PDMS substraat hechten aan de spreekspoel motoren strekken. C) Het substraat wordt gewikkeld rond het cilindrische gedeelte van de klem met de verankering Features zitten in de groef aan de top. Dan is de ondergrond wordt bevestigd met behulp van de stelschroeven dat het substraat te duwen / verankering functies in de bovenste groef. D) Illustratie van de BAXS platform met de klemmen die de ondergrond op zijn plaats. De inzet toont een gedetailleerd aanzicht van het substraat met cellen verbonden te zitten boven een dekglas en het microscoopobjectief.

Figuur 3
Figuur 3. Bill van materialen van het membraan en het spansysteem. Tekeningen toont de afmetingen van de belangrijkste onderdelen geïntegreerd in het biaxiale platform cel strekken experimenten.

Figuur 4
Figuur 4. Exruim van een klemsysteem voor stijfheid beoordeling van klein kaliber schepen. AB) Gedetailleerde foto's van het klemsysteem gebruikt om vervorming te induceren in een 1 mm diameter muis aorta. Roestvrij stalen pennen zijn zorgvuldig gevormd in open driehoeken, zodat het schip te glijden op beide pinnen. C) Illustratie van de BAXS platform met de klemmen houden van het vaartuig en een meetcel bevestigd tussen de vaste motor en de linker klem. De inzet toont een gedetailleerd bovenaanzicht van het vat gemonteerd op de pennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mechanische vervorming van enkele cellen

  1. Fabricage van een PDMS Ondergrond met ingebouwde TL-Beads
    Vóór vervaardiging van het substraat, worden fluorescente microsferen in water oplossing gesuspendeerd in isopropanol kraal menging te verbeteren op het PDMS vanwege de hydrofobe aard.
    1. Pipetteer 500 ul van fluorescerende microbolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 10 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en voeg 500 ul van isopropanol gevolgd door 5 min van vortexen. Plaats de flacon aan de kant 's nachts in het donker, zodat elke grote deeltjes aggregaten naar sediment.
    3. De volgende ochtend, verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof om een ​​schone microcentrifuge flacon. Deze kraal oplossing kan worden gebruikt om meer dan 5 substraten fabriceren. OPMERKING: De kraal oplossing blijft sediment voor de komende 3 dagen. Wees voorzichtig om te voorkomen resuspenderen de pellet.
    4. Giet 0,5 g hardingsmiddel ontvangende PDMS kit 1,5 ml microcentrifuge flacon met een wetenschappelijke evenwicht. Door opeenvolgende stappen, voeg een totaal van 90 ui bolletjes (in zes 15 pl toevoegingen), vortexen gedurende 1 minuut tussen elke toevoeging. Zet opzij.
    5. Weeg 10 g PDMS en meng gedurende ten minste 12 minuten met 0,5 g van het hardingsmiddel aangevuld met fluorescerende kralen.
    6. Fabriceren van een SU-8 2050 kruisvormige mal met behulp van standaard fotolithografietechnieken volgende instructies van de fabrikant. De gebruikte matrijs heeft een hoogte van 320 um en een oppervlakte van 13,4 cm2 (figuur 3). De schimmel kan 428 ul of 440 mg van PDMS bevatten.
    7. Giet 400 mg van de PDMS met kralen in het kruis-vormige mal met behulp van een pipet en uitharden gedurende 2 uur bij 80 ° C. Na uitharding, trek het substraat uit de mal (figuur 5A). Het substraat kan in een petrischaal bij kamertemperatuur gedurende 2 weken zonder dat significante veranderingen in de mechanische eigenschappen. Giet druppeltjes PDMS (verharder: PDMS met een verhouding van 01:20) in een petrischaal met een uiteindelijke grootte van ongeveer 4 mm in diameter en genezen ondersteboven gedurende 2 uur bij 80 ° C (Figuur 5B). Deze verankering functies kunnen in een petrischaal weken bewaard. OPMERKING: Houd de schotel ondersteboven te voorkomen dat de druppels van afvlakking tijdens het uitharden.
    8. Air-plasma-treat (30 sec bij 30 W) de ondergrond en 8 verankering functies. Bind de functies aan weerszijden van het substraat op een afstand van 4 mm van de vierkante streepje op het substraat (Figuur 5C).
  2. Montage Membraan op de klemmen
    1. Wikkel elk uiteinde van het substraat rond de gegroefde cilindrische deel van de klemmen en zet het vast met de 2 stelschroeven van boven (Figuur 2B en Cijfers 5D-E).
    2. Schroef de 4 klemmen op de klem houder en giet PDMS (verhouding 01:20) met behulp van een disposable transfer pipet op het grensvlak tussen het substraat en de gegroefde cilindrische gedeelte van de klemmen. Spreid de niet uitgeharde PDMS rond de gegroefde cilindrische deel met behulp van een 1,5 mm inbussleutel.
    3. Voor PDMS (01:20) in de groeven totdat volledig gevuld door capillaire werking en genezen het samenstel bij 80 ° C gedurende 2 uur (Figuur 5F).
  3. Seeding Cellen op het membraan
    1. Air-plasma behandeling (30 sec bij 30 W) het geheel te steriliseren en functionaliseren het substraat mogelijk te maken collageenbekleding.
    2. Functionaliseren het gebied van het substraat waar de cellen worden geënt met 1 ml 0,02 M azijnzuur aangevuld met 16 ug / ml rat-tail collageen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. De gewenste uiteindelijke collageen dichtheid 5 ug / cm 2.
    3. Spoel het substraat 3x met fosfaatbuffer en laten drogen bij kamertemperatuur voor tenminste 10 minuten.
    4. Voeg 40 ul kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum serum en 1% penicilline-streptomycine bevattende 2000 cellen in het middengedeelte van het substraat naar een gebied van 1 cm2 dekking (celdichtheid: 20 cellen / mm 2). Celdichtheid kan worden gewijzigd volgens experimentele eisen.
    5. Zet het geheel in een standaard celkweek incubator met de ondergrond naar boven met de daling van het kweekmedium dat de cellen op. OPMERKING: Het samenstel moet met het substraat naar boven minstens 3 uur om de cellen stevig hechten bewaard. Om verdamping te voorkomen, 30 pl warm kweekmedium wordt toegevoegd in de druppel op de ondergrond elke 45 min gedurende 3 uur.
    6. Na 3 uur, draait het geheel in een petrischaal gevuld met vers kweekmedium aan het substraat onder te dompelen en incubeer overnacht om cellen te vermenigvuldigen.
    7. De volgende dag bereiden HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, 1,8 mM CaCl2 en 11,1 mM dextrose). Breng de pH op 7,4. OPMERKING: De HBSS oplossing moet dagelijks worden bereid en bij 37 ° C gehouden tijdens de experimenten. Deze fysiologische oplossing wordt gebruikt om de cellen op de microscoop podium handhaven door het nabootsen van de normale weefsel / bloed omgeving.
    8. Monteer de set-up op omgekeerde fase contrast of fluorescentiemicroscoop Monteer de klem-substraat montage op de BAXS platform en motoren. Vul de petrischaal in de petrischaal verwarming met HEPES buffer (figuur 2D).

2. Stijfheid Meting van klein kaliber Schepen

  1. Voorbereiding
    1. Krebs fysiologische oplossing: Maak een oplossing van 118,1 mM NaCl, 11,1 mm D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, en 2,5 mM CaCl2. Stel de pH op 7,4 en de oplossing met zuurstof carbogen medisch gas (95% O 2/5% CO2) gedurende 30 minuten. OPMERKING: De Krebs solutiop moet dagelijks worden bereid en bij 37 ° C gehouden tijdens de experimenten. Deze fysiologische oplossing wordt gebruikt om de weefsels levend houden door het nabootsen van de normale weefsel / bloed omgeving.
    2. Verzamel instrumentatie voor de dissectie en mechanische beoordeling van aorta-schepen: chirurgische schaar, gebogen pincet, micro-schaar, chirurgische microscoop ontleden, 50 ml polypropyleen centrifugeerbuisjes, en 10 ml serologische pipetten. De chirurgische en experiment procedure geen steriele omstandigheden dit vereisen. Monteer de klemmen van de BAXS platform samen met de load cell vooraf.
  2. Tissue Isolatie en Dissection
    Alle experimentele procedures waarbij laboratoriumdieren hebben door de Animal Care en gebruik Comite van de gebruikers instelling, die voldoet aan de Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de gebruikers land worden goedgekeurd.
    1. Voer muis euthanasie met de inhalatie van 99% CO 2 (7 psi)in een plexiglas kamer (figuur 6A).
    2. Open muis buik en snijd de thoracale aorta om de muis te bloeden.
    3. Verwijder het membraan, de borstkas en de longkwabben (figuur 6B). OPMERKING: Om het risico van beschadiging van het weefsel te minimaliseren, houden het hart verbonden aan de aorta en vermijd direct contact met schip, maar manipuleren met behulp van het hart.
    4. Verwijder het hart, de aorta wortel en de thoracale aorta door voorzichtig te snijden tussen het schip en de wervelkolom. NB: Gebruik geen rek in het vat tijdens het uitsnijden niet bewegen om de inwendige structuur van het weefsel intact (figuur 6C) te houden.
    5. Onmiddellijk onderdompelen en houden het hart en de aorta in Krebs oplossing.
    6. Knip en zorgvuldig wassen van de aorta in Krebs oplossing voor elk bloedstolsels te verwijderen. Verwijder bindweefsel met behulp van micro-schaar, pincet en chirurgische dissectie microscoop (Figuur 6D-E). LET OP: Houd alle schepen met een lengte en gebruik de AORtic wortel naar de oriëntatie schip te bepalen.
  3. Vaartuig Dimension Vaststelling en Montage
    Om de stijfheid van het vaartuig te bepalen worden de onbelaste scheepsafmetingen vereist en kan worden gemeten met een geijkte microscoop.
    1. Snij een aorta ring van ongeveer 2 mm in lengte en nauwkeurig met behulp van een geijkte microscoop instelling (figuren 6F-G) zijn lengte te meten. Zet dit segment opzij Krebs oplossing.
    2. Snijd een aortaring zo klein mogelijk tussen elk van de segmenten 2 mm (figuur 6F). Zet dit kleine segment op een microscoop glasplaatje met het lumen naar boven en meet de wanddikte met een geijkte microscoop instelling (Figuur 6H).
    3. Vul de petrischaal op de BAXS platform met Krebs oplossing en plaats de 2 mm aorta ringsegment op het trekken pinnen (inzet in Figuur 4C).

ge = "altijd"> Figuur 5
Figuur 5. PDMS substraat fabricage en montage. A) Na uitharding wordt het substraat zorgvuldig afgepeld de SU-8 2050 schimmel en opzij gezet in een petrischaal. B) Verankering kenmerken gemaakt van PDMS en helpen om de ondergrond te bereiken over de klemmen. C) Substraat van verankerings eigenschappen klaar voor montage. D) Het substraat wordt op de klemmen 4, die vervolgens op de klemmendrager zijn aangebracht (zie inzet) gemonteerd. E) Gedetailleerd beeld van het substraat gemonteerd op de 4 klemmen. F ) Procedure gieten PDMS in de groef onder het substraat. De pijl geeft de PDMS langzaam vullen van de groef door capillariteit.

454fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 6. Bereiding en isolatie van de thoracale aorta. A) Voorbereiding chirurgische instrumenten en de muis gedood. B) via een longitudinale incisie in de buik, de borstkas en longen lobs verwijderd. C) De aorta wordt zorgvuldig verwijderd met het hart te manipuleren het weefsel. D) Het hart en de aorta worden in Krebs fysiologische oplossing. De aorta wordt gereinigd door alle bindweefsels. E) Uitgebreide showing hart en de aorta. F) Aorta segment voor stijfheid evaluatie samen met kleine segmenten voor diktemeting. GH) De precieze lengte (G) en dikte (H) elk segment vaartuig geëvalueerd middels een inverse microscoop en een analyseprogramma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cel Stretching

De BAXS platform werd gebruikt om de mechanische reactie van de kern in enkele muis myoblast cellen (C2C12) blootgesteld aan een substraat vervorming van 25% onderzocht. Myoblast cellen worden aangetroffen in het spierweefsel en worden voortdurend blootgesteld aan mechanische rek en compressie in vivo. De vorm en mechanische eigenschappen van de celkern blijkt een belangrijke rol spelen bij de regulatie van genexpressie en transcriptionele activiteit 20,21 en ook in een verscheidenheid van ontwikkelingsdefecten en ziekten zoals Hutchinson-Gilford progeria syndroom (HGPS), Emery -Dreifuss spierdystrofie (EDMD), verwijde cardiomyopathie, vroegtijdige veroudering en kanker 22-25. Daarom begrijpen hoe krachten van de uitwendige mechanische micro invloed op de structuur en functie van de kern is van extreem belang. De BAXS platform werd gebruikt om de overdracht van kracht van de mi onderzoeken croenvironment de kern door het uitrekken van het substraat evenwijdig aan de grote of kleine as. Figuren 7A-F illustreert de mogelijkheden van het platform voor het induceren van een vervorming in het substraat langs twee orthogonale richtingen. Bovendien kan de BAXS platform complexe stam velden in het substraat in aanvulling op de standaard eenassige van equi-biaxial stam velden opwekken. Figuren 7G-H illustreert de flexibiliteit van onafhankelijke controle van het veld stam langs twee orthogonale richtingen, waardoor we ofwel produceren een standaard (compressie) of zuivere (niet-compressie) eenassige stam veld. De BAXS platform kan een zuivere eenassige spanningsvelden te produceren door het substraat iets te trekken in de richting loodrecht op de belangrijkste strekrichting (figuur 7G) ter compensatie van de aanwezige druk in het substraat langs deze richting tijdens een standaard uniaxiale rek (Figuur 7H ).

ntent "fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 7
Figuur 7. Verplaatsing-deformatie relaties van het uitvoeren van standaard en zuivere eenassige stretching. AB) TL-kralen worden met de hand geselecteerd op het eerste frame van de video en bijgehouden van het ene frame naar de andere, totdat de maximale rek bereikt langs de horizontale (C) en verticale (D) richtingen. Een MATLAB script berekent automatisch de onderdelen van de Green vervormingstensor voor elk frame en produceert een kalibratiecurve van de spanning ten opzichte van de motor verplaatsingen 27. EF) De blauwe en rode lijnen overeen met de component van de Green vervormingstensor langs de horizontale en verticale richting respectievelijk. G) Stretchen hetzelfde substraat met 4 mm langs de x-as en lichtjes die zich uitstrekt langs dey-as 1,5 mm (rood gemarkeerd) produceert een zuivere eenassige veld zonder samendrukkende vervorming in het substraat. H) Stretching het substraat langs de x-as van 3,5 mm produceert een vervorming van 25% en een samendrukkende vervorming van 7% bij de einden van het substraat langs de verticale as zijn bevestigd (in rood).

Met de mogelijkheid om levende cellen microscopie voeren tijdens rek, werden kernen gekleurd met een levende cel fluorescente kleurstof die aan DNA bindt (Hoechst 33342). In het algemeen, C2C12 cellen bezitten elliptische kernen met een grote en kleine as. Eerst werden cellen geïdentificeerd waarbij de grote of kleine nucleaire assen evenwijdig aan de horizontale richting strekken georiënteerd waren. Op dit punt werden de cellen uitgerekt door 25% langs elke orthogonale assen strekken terwijl het verwerven van beelden van de onvervormde en vervormde kern uitstrekt tussen elke cyclus (Figuren 8A-I). Op deze wijze konden de vervormbaarheid van de kern beoordelenlangs de grote en kleine as onder een nauwkeurig gecontroleerde substraat vervorming. Ovuscule een ImageJ plugin werd gebruikt om de lengte van de grote en kleine nucleaire assen bepalen. Deze lengten zijn opgenomen tijdens de onvervormde toestand en als de kern achtereenvolgens werd uitgerekt langs de grote en kleine assen (figuren 8G-I). Om de vervorming van de kern langs de kleine en grote assen berekenen de relatieve lengteverandering langs elke as in de gestrekte en vervormde toestanden werd berekend:

waarbij ε is de vervorming, L1 de vervormde lengte L 0 is het onvervormde lengte.

De vervormbaarheid van de kern in C2C12 vertoont een mechanische anisotropie als toont een significant hogere vervormbaarheid langs de korte as (6,3 ± 1,1%) ten opzichte van de hoofdas (3,077, 0.6%) (figuur 8J). Verder onderzochten we ook de rol van actine en microtubuli cytoskelet reguleren nucleaire vervormbaarheid. Dit werd bereikt door het depolymeriseren van actine filamenten en microtubuli selectief met respectievelijk cytochalasine-D en nocodazol. Depolymeriseren de actine filamenten en de microtubuli bleek een verlies van de anisotrope vervormbaarheid van de nucleus (Figuur 8J) induceren. Deze resultaten ondersteunen de bevindingen dat cytoskelet componenten krachten overbrengen naar de kern van het substraat en is ook essentieel voor het behoud van de natuurlijke mechanische gedrag van de kern tijdens vervorming 25.

Figuur 8
Figuur 8. Stretching protocol en nucleaire vervormbaarheid. AC) Schematische illustratie van de stre k ijk en protocol van een enkele cel met zijn kern horizontaal georiënteerd. Fasecontrastbeelden (DF) en epi-fluorescentie afbeeldingen (GI) van een cel gekleurd met DNA-specifieke fluorescente kleurstof. Dit beeld opeenvolging illustreert een typische cel uitstrekt experiment waarbij dezelfde cel wordt blootgesteld aan orthogonale vervorming velden. Schaal bars zijn 25 micrometer. J) C2C12 toont anisotrope nucleaire vervormbaarheid met de kleine as vervormen aanzienlijk meer dan de hoofdas. In actine-of microtubule-arme cellen (cyt-d en nocodazole, respectievelijk), de anisotropie verdwijnt. In alle omstandigheden kern vervormingen zijn significant verschillend van nul onder een substraat vervorming van 25%. ** P <0,01, gepaarde t-test. † † p-waarde <0,01, † † † p-waarde <0,001, een-sample t-test.

Vaartuig Stijfheid Assessment

t "> onze onderzoeksgroep onderzocht het effect van de chronische overexpressie van hitteshockproteïne-27 (HSP27 o / e) op de vorming van plaques in de aorta atherosclerose-gevoelige muismodel (apoE - / -). 26 Wij bleek dat HSP27 fungeert als een eiwit dat atherosclerose plaque en lipide macrofaag overvloed vermindert en verhoogt de intimale gladde spiercellen en collageen (Figuren 9A-B). Om de gevolgen van deze histologische remodelleren van verblijf mechanische eigenschappen te bepalen, werd de BAXS platform gebruikt tot stijfheid van de aorta te meten.

Figuur 9C toont een typische spanning-rek kromme van de trek rekken van een aorta-ring. Stijfheid te kwantificeren, werd de incrementele modulus berekend uit spanning-rek kromme op een vervorming van 30%. De stijfheid is de helling van de raaklijn aan de curve. Door de invoering van een load cell op een van de BAXS platform motoren, de gelijktijdige aankoop van displacement en kracht van gegevens mogelijk is. De verplaatsing-kracht bochten werden omgezet in spannings-rek curves op basis van de onvervormde afmetingen van elke aorta ring. De stress en spanning worden berekend met behulp van de volgende formules:

waarbij ε is de vervorming, L1 de vervormde lengte L 0 is het onvervormde lengte s de spanning, F de kracht en A 0 is het onvervormde deel van het weefsel onder belasting. In het specifieke geval van een aorta-ring, het onvervormde gebied (A 0) is tweemaal de dikte van de ring maal de lengte van het segment.

Elk monster werd cyclisch vervormd met een maximale vervorming van 40% bij een verplaatsing van 50 micrometer / sec gedurende 12 cycli met de eerste 11 cycli waardoor conditioneren van het weefsel en de last een voor data-acquisitie. We vonden dat de stijfheid van de aorta segmenten van apoE - / - HSP27 o / e muizen (62,8 ± 3,0 kPa) aanzienlijk werden verhoogd met 41% ten opzichte van de apoE - / - controle muismodel (44,4 ± 3,8 kPa) (figuur 9D) .

Samengevat, de mechanische aanslag combinatie met het schip en plaque histologie aangetoond dat de overexpressie van HSP27 wordt gekenmerkt door een verhoogde stijfheid vaartuig en collageen / gladde spiercellen inhoud. Deze resultaten suggereren dat HSP27 zou kunnen verhogen de stabiliteit van atherosclerotische laesies en derhalve de kans op plaquebreuk verminderen.

Figuur 9
Figuur 9. Effect van HSP27 over-expressie op stijfheid schip. We toonden aan dat HSP27 wijzigde de histologische compoling van atherosclerose letsels door verhoging intimale gladde spiercellen (A: anti-α-SMA) en collageen (B: picrosirius rode vlek) C) Typische spanningsrekcurve verkregen uit strekken een aorta positie waar de stijfheid wordt berekend op 30. % van de stam. . De stijfheid is de helling van de raaklijn (rode lijn) aan de kromme D) Chronische overexpressie van HSP27 verhoogt vaartuigen stijfheid vergeleken controle apoE - / - muizen-model (D). Schaalbalken in (A) en (B) beide 40 urn en 400 urn in de bijvoegsels. L = lumen, I = intima, gestippelde lijnen schetst de media. * P-waarde <0,05, one-way ANOVA. *** P-waarde <0,001, one-way ANOVA. Figuur aangepast van het werk van Cuerrier et al. 26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De BAXS platform gepresenteerde vergemakkelijkt talrijke experimenten in de studie van mechanobiology uit onderzoek van enkelvoudige cellen tot volledige weefsels. Bovendien, het platform is zeer flexibel en configureerbaar, waardoor talrijke mechanische stimulatie experimenten en multi-axiale trekproeven. Het platform maakt ook het onderhoud van cellen en weefsels in fysiologische omstandigheden en toelaten om gelijktijdig microscopie tijdens het spannen experimenten. De twee experimenten in de vorige paragrafen beschreven tonen de veelzijdigheid van de BAXS platform bij gebruik van een goede set van bevestigingsklemmen. Een modulair en aanpasbaar monster montage systeem, optische toegang en de mogelijkheid om extra sensoren (bijvoorbeeld een load cell) toevoegen, openen talrijke mogelijkheden voor bijkomende soorten experimenten uit te voeren.

De hierboven gepresenteerde protocol bevat een groot aantal kritische stappen die moeten worden uitgevoerd eendequately om de beste resultaten. Binnen de cel uitstrekt protocol monteren PDMS substraat op de klemmen vereist gevoelige en nauwkeurige manipulatie. De PDMS ondergrond moet goed gecentreerd ten opzichte van de vier klemmen om ongewenste zijwaartse beweging van het substraat gedurende strekken voorkomen. Dergelijke zijwaartse bewegingen kunnen tijdens het spannen experimenten het volgen van de cellen moeilijk te maken. Ook, is het essentieel om de verdamping van de druppel kweekmedium tijdens zaaien van cellen wanneer het substraat naar boven in de incubator volgen. Afhankelijk van hoe vaak de incubator deur tijdens het proces wordt geopend, kan de verdampingssnelheid veranderen. Binnen het vat uitstrekt protocol, de meest kritische stap is het meten van de afmetingen van het te onderzoeken monster. Deze afmetingen moeten zo nauwkeurig mogelijk zijn zoals ze zijn betrokken bij de berekening van het weefsel stijfheid en dus een directe impact op de resultaten. Na dezelfde persoon te voeren vaartuig dDIMENSIE metingen zal helpen bij het verminderen van de variabiliteit tussen de monsters.

De fabricage van de klemmen gebruikt te trekken op de PDMS substraat tijdens cel stretching experimenten waren verschillende ontwikkelings cycli. De eerste versie van de klemmen niet over een verankering groef aan de onderzijde van de cilindrische delen (figuur 2B). Zonder deze groef, het substraat gleed langs het cilindrische gedeelte induceren een aanzienlijke variabiliteit in substraat vervorming tijd. Met de aanwezigheid van de groef en de toevoeging van uitgeharde PDMS (figuur 5F), het substraat niet meer glijdt. Deze experimentele opstelling produceert een constante vervorming in het substraat de tijd. Voor tissue stretching experimenten, het kiezen van de juiste load cell is ook erg belangrijk. De meetcel hier gebruikt heeft een lage belasting bereik (tot 150 g), die passend is voor de hier geteste monsters. De zeer gevoelige load cell nodig voor MMOijdens trekkrachten op kleine steekproeven bezat een relatief lage signaal-ruis (S / N) verhouding. Om de s / n verhouding te verbeteren en dus het verbeteren van de resolutie, is de load cell elektrisch geïsoleerd van de voice coil motor en alle metalen delen met plastic schroeven en afstandhouders. Op deze wijze wordt een hoge signaal / ruisverhouding met een resolutie van 0,03 g werd verkregen. Voor zachtere monsters, wordt het gebruik van een lager bereik load cell aanbevolen om hoge resolutie te behouden.

Momenteel is de belangrijkste beperking van de BAXS platform is het vermogen om lange termijn voeren uitstrekt experimenten door de verdamping van de HBSS buffer tijd. Waterverdamping verhoogt opgeloste concentratie die potentieel de cellen kan hebben. Met de huidige configuratie van de BAXS platform, is het moeilijk om een ​​experiment dat mechanisch zou stimuleren cellen of weefsels op dag als de buffer waarin de cellen en weefsels worden ondergedompeld moet Aanv te hebben ented met vloeistof in de tijd. In de huidige instelling, de verdampingssnelheid ongeveer 0,9 ml / uur van een eerste volume van 25 ml HBSS bufferoplossing. De huidige instelling is ideaal voor korte-termijn-experimenten. Om betrouwbare cellen en weefsels stretching experimenten over langere tijd uit te voeren, zijn twee voorgestelde toevoegingen: 1) Een fluidisch systeem voor het behoud buffer volume, en 2) de toevoeging van een commerciële of zelfgebouwde incubator ruimte omsluit het hele systeem in stand te houden constante luchtvochtigheid en temperatuur en een 5% / 95% CO 2 / atmosfeer. Wat de mogelijkheid strekken vasculaire weefsels, de bovenbeschreven opstelling konden we de stijfheid van klein kaliber vaartuigen meten. Het is belangrijk om te kunnen gebruiken met een geschikte diameter om te zorgen dat zij niet zullen vervormen tijdens het spannen, maar is klein genoeg om in het lumen van het vat. Niet nemen van deze informatie rekening kan onnauwkeurigheid te introduceren in de gemeten vervorming van het weefsel.

ve_content ">

In-vivo worden ingebed weefsel cellen blootgesteld aan mechanische krachten en spanningen die zowel ruimtelijk als in de tijd variëren, maar nog belangrijker ze vaak meerdere assen. Een goed voorbeeld is het mechanisch gedrag van de vasculatuur muren in reactie op hemodynamische krachten. De combinatie van lokale hemodynamische krachten 28-30 met de anisotrope eigenschappen van vaatweefsel 13,14,16,27 resulteren in een complexe mechanische micro-omgeving die endotheliale en vasculaire gladde spiercellen blootgesteld aan complexe multi-axiale en cyclische spanning velden. Hoewel de bestaande cel stretching experimenten sterk hebben bijgedragen tot de basiskennis van mechanotransduction en mechanobiology, hebben ze van oudsher vertrouwd op geïdealiseerde eenassige of equi-biaxial stam velden die niet in vivo stam velden 8-10,19,29,31-34 niet reproduceren . De BAXS platform maakt anisotrope biaxial cel uitrekken met gelijktijdige live-cel-l microscopie. De mogelijkheid om de vervorming van de ondergrond langs twee orthogonale richtingen controle stelt ons in staat om volledige controle over de veldstam hebben. Dit maakt de productie van complexe stam gebieden naast gewone uniaxiale en biaxiale equi-stam gebieden. Bovendien is het platform stelt ons in staat om dynamisch te veranderen de richting van het veld stam binnen dezelfde stretching experiment.

De optie van de integratie van een modulair en aangepaste klemsysteem opent de mogelijkheid voor vele toepassingen in cel mechanobiology en weefsel, gebruik makend van een enkele stretching platform. Bijvoorbeeld, met de juiste klemsystemen 13,27 Dit platform vlakke uniaxiale en biaxiale trekproeven van biologisch weefsel uitvoeren. Op deze wijze de mechanische eigenschappen van een weefsel gesneden in een rechthoekige of vierkante vorm, kan worden gekwantificeerd langs twee orthogonale assen in een enkel experiment. Bovendien maakt de uitvoering histologische eennalyses na mechanische stimulatie strekking geïnduceerde structurele veranderingen openbaren weefsels. Torsie is ook een belangrijk type mechanische belasting van spieren en ligamenten 35. Dit platform biedt de mogelijkheid om een ​​spansysteem dat een rotatie om de as uitstrekt kan bewegen een combinatorische mechanische belasting waarbij torsie en spanning produceren ontwerpen. Het is ook mogelijk om grotere kaliber schepen met geschikte bevestigingspennen beoordelen. Het bestuderen van cellulaire responsen na mechanische vervorming is ook onder intens onderzoek. De BAXS platform biedt een unieke eigenschap van het veranderen van de richting en de complexiteit van de spanningsvelden binnen hetzelfde experiment in aanvulling op waardoor gelijktijdige beeldvorming. Belangrijk multimodale vormen van microscopie nog mogelijk, als platform niet interfereert met de optische as van de microscoop. Dit is belangrijk omdat de structurele en biochemische levende cellen reacties op mechanische deformation kan worden gemeten. Samen genomen, de BAXS platform ontwerp bezit een aantal belangrijke functies die het gebruik ervan voor enkele cel en hele weefsel experimenten te vergemakkelijken. Door gebruik van een modulair klemsysteem en de toevoeging van maximaal vier mogelijke weegcellen, kan de BAXS platform worden voor een groot aantal experimenten. Dit artikel toont de details van de twee voorbeelden van experimenten; maar de modulariteit en flexibiliteit van het systeem kan verder worden benut om vele verschillende aspecten van mechanobiology bij de subcellulaire, cellulaire en gehele weefsel lengteschalen onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

DT werd ondersteund door een postdoctorale studententijd van le Fonds de Recherche du Quebec-Nature et Technologies (FQRNT) en een MITACS Elevate Strategic Fellowship. CMC werd ondersteund door een postdoctorale studententijd van le Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ) en de Ernest en Margaret Ford cardiologie begiftigd research fellowship van de Universiteit van Ottawa Heart Institute. EOB werd ondersteund door exploitatiesubsidies MOP80204 van het Canadese Institute for Health Research (CIHR) en T6335 van de Heart and Stroke Foundation van Ontario. De CIHR en Medtronic leveren collectief EOB met een peer-reviewed Research Chair (URC # 57093). AEP wordt gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant, een NSERC Discovery Accelerator Supplement en dankbaar erkent de steun van de Canada Research Chairs (CRC)-programma en een Early Onderzoeker Award van de provincie Ontario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheres Invitrogen F8810 Keep away from light.
Linear voice coil Moticont LVCM-051-051-01 The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide Edmund Optics NT37-360 Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage Edmund Optics 38-960 Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder GSI microE systems Mercury II 1600S - 0.5um resolution reflective incremental encoder.
Motion controller Galil DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell Honeywell 31 low miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm) Pin Service Austerlitz Insect pins Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050 Micro Chem SU-8 2050 Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system Glowresearch Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen Invitrogen A10483-01 Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342 Invitrogen R37605 DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters omega.ca KHLV-0504/(10)-P 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers omega.ca CN63200-R1-LV Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium Hyclone SH3024301 Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010 Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH3039603C Keep frozen.
Trypsin 0.05% Hyclone SH30236.02 Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes Wisent Inc 330-050-EL HEPES-buffered salt solution 
NaCl Fisher Scientific BP358-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl Fisher Scientific BP366-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4 Fisher Scientific M65-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2 Fisher Scientific C614-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose Fisher Scientific BP220-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1 Krebs physiological solution
KH2PO4 Fisher Scientific BP362-500 Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2 Lindle DIN:02154749 Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole Sigma M1404 Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D Sigma C8273 Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC Sigma F3777 Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain Fluka 43665 Used to stain and quantify collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics