Phosphopeptid Analyse af gnaver epididymale Spermatozoer

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spermatozoer er helt unikke blandt celletyper. Selv produceret i testiklerne, er både transkription og translation kernegen slukket når pre-cursor runde celle begynder at langstrakt og differentiere i, hvad der morfologisk anerkendt som en sædcelle. Men sædcelle er meget umodne, ikke har nogen mulighed for motilitet eller æg anerkendelse. Begge disse begivenheder opstår, når sædcellerne transit en sekundær organ kaldet bitestiklen. Under ~ 12 dage passage, det tager for en sædcelle at passere gennem bitestiklen, post-translationelle modifikationer af eksisterende proteiner spiller en afgørende rolle i modningen af ​​cellen. En vigtig facet af sådan proteinphosphorylering. For at karakterisere phosphorylering begivenheder, der finder sted i løbet af sæd modning, skal der etableres både rene sperm celle populationer og præ-fraktionering af phosphopeptider. Brug tilbage rødmen teknikker, en fremgangsmåde til isolering af ren spermatozoer of høj kvalitet og udbytte fra den distale eller kaudale bitestikler er skitseret. Trinene til solubilisering, fordøjelsen, og præ-fraktionering af sperm phosphopeptider gennem TiO2 affinitetskromatografi forklares. Når isolerede, kan phosphopeptider injiceres i MS for at identificere begge proteinphosphoryleringsbegivenheder om specifikke aminosyrerester og kvantificere niveauet af phosphorylering finder sted i løbet af sædmodning processer.

Introduction

Efter at have kommet ud af testiklerne, er spermatozoer stærkt differentieret endnu bemærkelsesværdigt, disse celler er umodne 1,2. Som sådan, de mangler komplet funktionalitet, herunder evnen til at svømme og binder til en oocyt 3. Selv om yderligere modning af sædcellen er påkrævet, kan dette ikke ske via kanoniske ruter, da der på dette stadium af deres celledifferentiering proces, er de ude af stand til gentranskription og yderligere proteinbiosyntese 4. Biologisk kompetence tillægges spermatozoer, som de forlader testiklerne og indtaste en del af det mandlige reproduktive system kaldet epididymis 5. Epididymis er en tæt oprullet, meget differentieret røret, der forbinder de efferente kanalerne (i testikler) til sædlederen og er til stede i alle mandlige pattedyr 6. Spermatozoer gradvist erhverve deres befrugtende potentiale under epididymalt afstamning, bygger på den evigt skiftende luminale miljø, som er crprettet af de lokale epididymale epitelceller 7. De forskellige sekretoriske og re-absorberende aktiviteter stede i epididymal milieu handling at ændre selve sæd, ændrer dets protein, kulhydrat og lipid sammensætning 6. Betydningen af bitestiklen, især den første "caput 'region af denne struktur er blevet eksemplificeret ved anvendelse af kirurgiske ligeringsteknikker 8. Spermatozoer tilbageholdt i testiklerne af efferente kanal ligering er helt mangler i enhver kapacitet til at befrugte ægget 9-11.

Ud over epididymal miljø, signaltransduktionsveje i spermatozoerne arbejde posttranslationelt modificere eksisterende sædcellen komplement. For eksempel spermatozoer fra de tidlige regioner epididymis vise forskellige mønstre af proteinphosphorylering forhold til sidstnævnte regioner 5,12. Dette er ikke overraskende, da der er store forskelle i Capability af sæd fra disse regioner. Eksempelvis spermatozoer fra begyndelsen, caput epididymis er immotilite. I modsætning hertil vil sædceller fra cauda region undergår fremad progressiv motilitet gang anbragt i isotonisk medium. Da epididymal sædceller er ude af stand de-novo proteinbiosyntese skal alle de iboende veje regulerer sperm funktion være gennem post-translationelle modifikationer (PTM). Derfor er det indlysende, at proteomics, og navnlig undersøgelse af PTMS såsom phosphorylering skal være en større fremstød, hvis vi skal forstå sædceller modning.

En alternativ metode til at opnå spermatozoer fra epididymidies at bruge retro-returskylning 13-16. Selv om denne teknik er helt sikkert mere tidskrævende og tager en større grad af dygtighed af operatøren, sædcellerne opnåede konsekvent demonstrere renhed på over 99,99%. Derudover, i modsætning til alle de andre teknikker, spermatozoer CAn isoleres i en hvilende tilstand, der gør det muligt at undersøge, hvordan spermamotilitet påbegyndes. Prøveforberedelse er det vigtigste aspekt for proteomanalyse er isolation af spermatozoer blevet en af ​​de vigtigste aspekter af sperm-proteomiske studier. Denne protokol giver en forklaring på, hvordan spermatozoer er isoleret fra cauda epididymis. Efter dette, er TiO2 phosphopeptid berigelse procedure skitseret, med særlig henvisning til, hvordan man kan udtrække peptider fra de meget differentierede sædceller. Kan bruges MS metode til at skelne skiftende phosphopeptider hvis man sammenligner den caudale epididymal spermatozoer i én stat (kun er ubevægelige sædceller eller ikke-kapacitetsbegrænsninger) til en anden (bevægelige, kapacitetsbegrænsninger, acrosom reagerede, etc.) gøre dette til en stærk tilgang til at studere sperm funktion.

Protocol

1. Fremstilling af Kultur Medier og retter

  1. Lav 200 ml Biggers Whitten og Whitten (BWW) 17 arbejder opløsning ved tilsætning af 5,54 g NaCl, 0,356 g KCI, 0,25 g CaCl2, 0,162 g H 2 KO 4 P, og 0,294 g MgSO 4 til 1 L Milli-Q-vand . Dette er stamopløsningen og kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
  2. Fra stamopløsningen tilsættes 420 mg NaHCO3 -, 200 mg glucose, 6 mg natriumpyruvat, 600 mg bovint serumalbumin, 0,74 ml natriumlactat og 4,0 ml HEPES-buffer til 193 ml af BWW lager. Dette er brugsopløsning og altid frisk på dagen og ækvilibreret til 37 ° C før brug.
  3. For at gøre kanylen, tage polyethylen (PE) rør med en indvendig diameter på 0,4 mm og en ydre diameter på 1,1 mm og hold ved svag varme (typisk methanolflamme), således at slangen begynder at smelte. Træk Umiddelbart slangen outward at strække og gøre den ydre diameter smallere.
  4. Cut at frembringe en indsnævring af den ene ende, som giver mulighed for lettere kanylering af sædlederen.
  5. Skær den anden ende af kanylen til omkring 15 cm. Sæt en 30 G nål i den stumpe ende, og vedlægge en 3 ml sprøjte til det (helt tilbagetrukket).
  6. Lav en sugemundstykke ved at skære en længde af PE rør (4,2 mm indre diameter, 6,4 mm ydre diameter) 20 cm. Indsæt et mundstykke i den ene ende.
  7. Indsæt mikro-kapillar glasrør indehaveren og glas mikro-kapillær selv (typisk 3 pi for en mus, 40 pi for en rotte) den.

2. Fjernelse af bitestikler fra mus

  1. Aflive mus efter hver enkelt institutions IACUC-godkendte procedurer.
  2. Tag dyret og gøre et lille snit i pungen at eksponere epididymis. Træk testiklerne og epididymis ud af hulrummet ved hjælp af et par urmager- # 5 pincet.
  3. Skær sædlederen således at mindst 1-2 cm blive siddende på cauda epididymis. Desuden skar de proximale efferente kabelkanaler og væv forbinder epididymis til testiklerne og fjerne hele mandlige reproduktive spor.
  4. Placer hele den mandlige reproduktive spor under et dissektionsmikroskop med en forstørrelse rækkevidde i størrelsesordenen 5-40X.

3. kanylering epididymis

  1. Tape ned kanylen til mikroskopet, således at 1-2 cm af den indsnævrede (kegle-formet) ende er fri og synlig gennem linsen.
  2. Tag et par urmager- # 5 pincet og forsigtigt spænde hver side af sædlederen og træk sædlederen på kanylen, således at kanylen går i sædlederen.
  3. Tag en længde på ikke-absorberbar sort flettet behandlet silke (størrelse 5-0), og binde en knude omkring cannulated sædlederen. Sørg knuden trækkes stramt til at holde kanylen inde sædlederen når lufttrykket from sprøjten er anvendt.

4. Retrograd eller tilbageskylning af Caudal epididymale Spermatozoer

  1. Brug af urmagere # 5 pincet, tag fat i distale ende af cauda epididymis og fjern tunica albuginea for at udsætte en enkelt epididymal tubulus.
  2. Ved hjælp af pincet, træk forsigtigt tubulus ud til at afsløre og derefter drille hinanden for at skabe en åbning til sædceller til at blive frigivet.
  3. Skub forsigtigt på de 3 ml (mus) eller 20 ml (rotte) sprøjte for at fjerne luft fra sprøjten ind sædlederen. Ved passende tryk, vil spermatozoer langsomt begynde at komme ud af den brudte tubulus ved den distale ende af cauda epididymis. På dette tidspunkt, sugning mundstykket for at trække spermatozoerne i kapillarrøret. Bemærk: typisk i en mus, kan 2-3 pi af spermatozoer opnås afhængigt af alder af dyret. En rotte vil i gennemsnit udbytte 30-40 pi.

5. Vaskog lyse af sædceller i Forberedelse til Proteomics

  1. Uddrive spermatozoer fra kapillarrøret i 1 ml opløsning af BWW opløsning (37 ° C) ved forsigtigt at blæse ind i mundstykket eller fastgørelse af en sprøjte og uddrive luft, således at skubbe spermatozoer tilbage ud af kapillarrøret.
  2. Når sædceller diffust, vask 3x (300 xg 5 min) med 1 ml BWW at fjerne forurenende proteiner. Efter den sidste vask fjernes supernatanten. Bemærk: På dette tidspunkt kan de sædceller fryses til senere brug.
  3. Solubilisere proteiner ved anvendelse af 4% CHAPS, 2 M thiourinstof og 50 mM Tris, pH 7,4 i 1 time med intermitterende hvirvelbehandling.
  4. Efter lysere cellerne, centrifuge (10.000 xg, 20 min), tage supernatanten og overføre til et nyt rør. Bemærk: På dette tidspunkt kan protein kvantificering udføres.

6. disulfidbindings reduktion og alkylering

  1. Tilsæt 10 mM DTT som en slutkoncentration på lyserede proteiner Vortex og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
  2. Tilsæt 50 mM idodoacetamide som en slutkoncentration på lysat, vortex og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.

7. Nedbør

  1. Methanol chloroform udfælde prøven ved tilsætning af 1 volumen af ​​lysat (400 pi som et eksempel), tilsættes et volumen (400 ul) methanol og 0,5 volumen (200 ul) chloroform.
  2. Vortex prøven og centrifugering (10.000 x g, 2 min).
  3. Bemærk, at to faser vises efter centrifugering. Kassér alle men 2 mm af øverste lag (pas på ikke at forstyrre interface).
  4. Tilsæt 1 volumen (400 ul) methanol, invertsukker rør forsigtigt 1-2x at blande og igen spinde (10.000 xg, 15 min). Kassér supernatanten til affald og lufttørre pille for 3-4 min.

8. trypsinfordøjelse

  1. Rekonstituer trypsin i 25 mM ammoniumbicarbonat indeholdende 1 M urinstof til et forhold på 50: 1 (W / W; protein: trypsin) og inkuberet overnight ved 37 ° C, fortrinsvis ved 700 rpm på en termomikser.
  2. Spin (10.000 xg, 15 min) for at pelletere ufordøjet materiale. Overfør supernatanten til nyt rør.

9. phosphopeptidet Enrichment

  1. Udfør rensning og berigelse af phosphopeptider fra tryptiske fordøje som tidligere beskrevet 18. Fortynd tryptiske peptider 10-fold i DHB buffer [DHB buffer består af: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic acid (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitril), 2% (v / v) TFA (trifluoreddikesyre syre)] og anvendes til at tørre TiO 2 perler (200 ug).
  2. Efterlad på en rotator ved stuetemperatur i 1 time.
  3. Vask prøven med DHB buffer, spinde og fjern supernatanten. Derefter vaskes prøven tre gange med vaskebuffer [80% ACN (v / v), 2% TFA (vol / vol)] for at fjerne DHB.
  4. Efter den sidste centrifugering, direkte elueres phosphopeptider hjælp elueringspuffer ved tilsætning af 25 pi af en 2,5% ammoniumhydroxid, pH ≥ 10,5 opløsning. Spin og fjern supernatanten. Umiddelbart neutraliseres med ~ 0,3 pi myresyre.

Representative Results

Kvaliteten af ​​resultaterne fra enhver proteomanalyse er stærkt afhængig af udgangsmaterialet. Med moderne MS, er svage forureninger i præparater prøve nemt afhentet. Derfor er det kritisk, i tilfælde af sperm cell proteomics, at vælge en metode, der giver yderst rene spermatozoer. Som illustreret i figur 1, er retrograd tilbageskylning bruges til at hente sædceller fra cauda epididymis. Dette indebærer kanylering sædlederen med PE rør, der gør det muligt at langsomt anvende lufttryk fra sprøjten fastgjort. Figur 1A viser cauda epididymis sammen med sædlederen. Figur 1B er et nærbillede skudt af hvordan sædlederen er bundet, hvor kanyle indsættes. Ved at gøre, så er spermatozoer frigives den udskårne ende af en tubulus fra den kaudale bitestikler. Som vist i figur 2A, er spermatozoerne ekstraheres fra den øverste områder af caudet epididymis og suges op i en glaskapillar i en hvilende tilstand (figur 2B). Dette har flere fordele frem for traditionelle "swim-up" metoder, ikke mindst som er evnen til at udføre en phoshoproteomic analyse af spermatozoer før og efter aktivering af motilitet. Den spermatozoer kan derefter udvises i medier efter eget valg. Figur 2C (venstre side) viser, hvordan sæden ser umiddelbart efter udvisning i BWW medier. Mange af cellerne klumpet sammen. Dog efter 10 min kompetence af cellerne demonstreret fordi de svømmer ud til homogenitet i opløsningen (figur 2C, højre celler). Da returskylningen teknik har meget ringe betydning for de sædceller, får vi tæt på 100% motilitet og cellerne spredes hurtigt ind i mediet uden ekstern provokation. I et typisk tilbageskylning eksperiment, sæd udvundet fra Swiss-mus indeholdermellem 1-5 x 10 6 celler. Dette er stærkt afhængig af dyrets alder og kan variere fra forskellige stammer af mus. I en norsk Rat vi typisk opnå 200 x 10 6 spermatozoer, ± 20%. Figur 2D repræsenterer renhed af spermatozoer fremstillet fra rotte cauda epididymis.

Udover selve prøven, en af ​​de store spørgsmål om prøveforberedelse er udbyttet af trypsin fordøjelse. Protein nedbør spiller en stor rolle, ikke kun i fjerne uønskede vaske- og salte, som begge er uforenelige med MS, men også i denaturering proteiner. Vi har fundet methanol-chloroform udfældning til at fungere bedst. Ikke alene er denne procedure blevet rapporteret at udfælde lave rigelige proteiner bedre end andre, herunder TCA-præcipitation 19, men det har yderligere fordele. Efter TCA nedbør, er det ofte nødvendigt at justere pH efter suspensionen af ​​TCA pellet, der kan forblive heltsure. Selvom det udfældede pellet TCA kan vaskes i høje organiske opløsninger for at fjerne syren, dette føjer til prøvehåndtering og irreproducibility af resultaterne. Manglende neutralisere syren vil resultere i dårlige tryptiske peptid udbytter. Methanol-chloroform udfældning er ikke kun hurtig, men vil ikke forsure prøven. Figur 3 illustrerer protein pellet typisk ses fra 100 ug prøve mellem den nedre og øvre interfasen.

Isoleringen af ​​phosphopeptider kan forekomme i en række måder; dog reproducerbarhed afhænger af, hvordan prøven er behandlet til og med dette tidspunkt. En af de mere almindelige, udvikle metoder er TiO2, oprindeligt udviklet af gruppen af Martin Larsen 18,20,21. Selv om der er beskrevet som en proces til brug i mikrosøjler, kan vi opnå reproducerbare data ved hjælp af batch-chromatografi. Succesen af ​​processen er stærkt afhængig af elueringsbufferen, som skal være gal e med den korrekte sammensætning; ellers phosphopeptider ikke elueres overhovedet.

Reproducerbarheden af protokollen og repræsentative data fra TiO2 beriget phosphopeptider fra cauda epididymis sperm i en ikke-motil (figur 4 øverst) og motile (figur 4 bund) state fra m / kan z 650-670 ses. Vi har vist, at dette er en yderst reproducerbar teknik, selv når du bruger biologisk gentagelser 17. De blå striber over tid er peptider eluerer fra en C18 nano-kolonne som koncentrationen af ​​acetonitril stiger. Det er klart, i motile population (n = 3 er vist, n = 8 løber typisk), der er et peptid klynge med en monoisotopisk masse omkring 651,5 Da område, der er helt fraværende i den ikke-motile rækkevidde. Tandem-massespektrometri anvendes derefter til at identificere dette peptid.

546 / 51546fig1highres.jpg "/>
Figur 1:. Kanylering af cauda epididymis (A) Billede af cauda epididymis. Kanylen selv tapes ned for at blotlægge ca. 1-2 cm af præ-trukket ende. Dette indsættes i sædlederen med fin # 5watchmakers pincet. (B) Kanylen holdes på plads ved at binde fint silke omkring et segment, der indeholder både sædlederen og kanylen. Fra mus er ca. 2-3 pi caudale epididymale celler og væske opsamles i en koncentration på 1 x 10 6 / pl. Fra rat (vist), er ca. 30-40 pi af væske opnås ved tilsvarende koncentrationer.

Figur 2
Figur 2: glaskapillar anvendes til at indsamle kompetente epididymal spermatozoer. (A) En tubulus fra toppunktet af cauda e pididymis er isoleret og brudt. Den omtrentlige position, hvorfra dette sker er vist. (B) Den øverste del af billedet viser et tomt glas kapillarrør og bunden viser en fra en tidligere returskylles rotte. Der er ingen blod forurening og forurening epitelcelle minimal. (C) Da sædcellerne stadig ufortyndet i epididymal væske, har de ikke begyndt at aktivere. Når sædcellerne i første omgang bortvist i en BWW løsning, de kommer ud som en kompakt "streng" (venstre side). Kompetencen af cellen let etableret, da efter 10 min meste af spermatozoer svømme i opløsning uden ydre forstyrrelse (højre side). (D) Et billede af en portion af caudale epididymale celler umiddelbart efter at de er overladt til at svømme ud viser renheden af ​​cellerne.

g3highres.jpg "/>
Figur 3:. Methanol-chloroform udfældning Når spermatozoer har været solubiliseret, den opløselige fraktion er methanol-chloroform præcipiteret at sikre denaturering af proteinerne og fjernelse af kontaminerende stoffer. Proteinet pellet vises på grænsefladen mellem methanol / vand og chloroform faser. Det øverste lag er fjernet omhyggeligt for ikke at forstyrre denne pellet. Det er almindeligt at forlade omkring 2-3 mm af den øvre fase, således intet protein tabt.

Figur 4
Figur 4:. Typisk TiO2 beriget phosphopeptid profil ved hjælp af den beskrevne protokol, blev caudale epididymal spermatozoer isoleret enten ubevægelige sædceller (top, N = 3) eller bevægelige tilstande (nederst, N = 3). Et peptid klynge med en mono-isotopisk masse ~ 651,5 Det er vist at være til stede i de bevægelige befolkninger, men helt fraværende i de kun er ubevægelige sædceller dem (pil). Sammenligninger af denne art benævnes "label-free (MS-baseret)." Peptidet masse og retentionstid derefter anvendes til at målrette forbindelsen til tandem-massespektrometri og identificere protein, hvorfra peptidet blev afledt.

Discussion

De kritiske trin for en vellykket og reproducerbar proteomanalyse af spermatozoer er: 1) renhed af udgangsmaterialet; 2) fjernelse af uønskede salte og rengøringsmidler; 3) denaturering proteiner i deres fulde udstrækning, således at trypsin at fordøje et højt udbytte af proteiner og 4) minimerer håndtering af prøver for at reducere tab af peptid.

For at kunne tilbageskylning cauda epididymis, er det vigtigt at finde det område, hvorfra spermatozoerne vil afslutte. I tilfælde af både rotter og mus, er på toppen af den konkave område i midten af den kaudale område af epididymis (se figur 2A). Hvis man kommer videre mod sædlederen, tilbageskylning er lettere og succesraten er generelt højere. Men dette kommer på tabet af antallet af sædceller. Alternativt, hvis man forsøger at bevæge sig mere proximalt til corpus, så det krævede tryk for at skubbe spermatozoer tilbage gennem epididymal kanaler er ofte så høj, at skader på epididymis uundgåeligt opstår.

Tilbageskylning af epididymis traditionelt udført under anvendelse af vandmættet mineralolie og en balanceret saltopløsning i sprøjten selv som et medium for at fjerne spermatozoerne 22-25. Begge procedurer er potentielt problematiske af LC-MS. For det første mineral sandsynligvis blokere nano-C18 nano-kolonner, der grundlæggende anvendes verden over for proteomisk analyse og skal man være omhyggelig, så ingen bliver fremføres i proceduren. Hvis dette sker, er det umuligt at fortsætte, og prøven væsentlige tabt. Dette kan overvindes ved anvendelse af BWW eller andre balancerede saltopløsninger i sprøjten, men selv om dette er en succes, vi snart erkendt, at mange af spermatozoer blive motile så snart BWW opløsning kom i kontakt og blandes med den kaudale epididymal celler. For at omgå dette problem, vi simpelthen backflush spermatozoerne med luft. Ikke kun er Quality af spermatozoer sammenlignes med væskebaserede metoder, men mængden er identiske.

Fosfoproteom er måske et af de eneste måder at aftale, hvilke signalveje finder sted i sædceller efter ejakulation. En af de store veje Vi undersøger er processen kapacitation. Sædceller skal gennemgå "kapacitation", før det er i stand til at binde til et æg. I praksis opnås dette stort set ved inkubering spermatozoer for en periode (mus 40 min; rotte 1,5 time humant 3-24 timer) i BWW opløsning med serumalbumin. Tidligere har vi og andre vist en rolle for flere kinaser involveret i kapacitation. Af interesse, sletning af PKA μ II producerer mus hvis spermatozoer svømme spontant in vitro, men kan ikke undergå hyperaktivering 26. Sidstnævnte er kendetegnende for kapacitation, hvorved spermatozoer ændre deres svømning mønster fra en høj hastighed, lav amplitude, til en lavhastighed, høj amplitude slå frekvens. Vi har vist downstream kinaser er involveret i denne proces, omfatter pp60-CSRC (SRC) 13,27 C-ja 28 og C-ABL 14. Interessant hæmning af SRC stopper kapacitation afhængig tyrosinphosphorylering 13. Dog kan dette overvindes med okadainsyre, tyder på, at SRC ikke er direkte involveret i den generelle indtræden af tyrosinphosphorylering 29, men kan regulere en phosphatase 29. Problemet med at bruge BWW som et medium til at tvinge spermatozoer fra epididymis er, at når aktiveret, mus spermatozoer kun tage cirka 40 minutter at capacitate. Eftersom isolation af spermatozoer kan tage 5 min / mus og ofte flere mus anvendes i et eksperiment, så spermatozoer vil være på forskellige stadier af modenhed ved begyndelsen af ​​eksperimentet. For at overvinde dette kan lufttryk anvendes til at skubbe spermatozoer fra den kaudale epididymis i et glas kanyle. Ikke alene er alle sperm Inaktivive og væsentlige som de ville findes i caudale miljø, det gør det muligt at sammenligne ikke-bevægelige og bevægelige fosfoproteom.

Prøvehåndtering for fosfoproteom bør holdes på et minimum, når man sammenligner spermatozoer i to forskellige funktionelle tilstande. Brugen af methanol chloroform i forhold til andre traditionelle metoder til proteinudfældning 1) reducerer behovet for ekstra vasketrin, 2) fjerner næsten alle spor af salte og fedtstoffer og 3) har en dokumenteret evne til at udfælde lav hyppighed proteiner i TCA 19. Anbefales Protein nedbør før trypsinfordøjelse da Dette er ikke blot med til at denaturere protein (som hjælper trypsinfordøjelse), men fjerner mange af de MS-stridige metabolitter er til stede i cellen.

Sammenligningen af ​​sædceller phosphopeptider kan gøres på en række måder. På det grundlæggende niveau, en simpel sammenligning af de identificerede phosphopeptid i én prøve, som i en andenprøve i den såkaldte "spektral optælling" kan gøres. Men kritik har været på denne tilgang dybest set fordi tidlige proteomiske undersøgelser brugte lave gentagelser (for en mere fuldstændig diskussion se Lundren et al. 30). En mere raffineret fremgangsmåde er at se på intensiteten af ​​peptidet forælder masse og sammenligne dette med de andre prøver (label-free sammenligning). I den i figur 4 viste eksempel kan et peptid fraværende fra fra ikke-motile (figur 4 øverst), men er til stede i motile (figur 4 nederst) spermatozoer fra m / z 650-670 ses. Denne proces, der omtales som MS-baserede label fri kvantificering er en etiket-fri strategi.

En alternativ strategi er almindeligt anvendt til at reducere mængden af ​​kørsler, der kræves for proteomisk kvantificering er at bruge isotoper. Som massen af ​​en isotop er forskellige, kan massespektrometer anvendes til at sammenligne intensiteterne af eluting peptider. Men i modsætning til de fleste andre celletyper, kan ikke anvendes nogle isotopmærkning spermatozoer. For eksempel tilsætning af stabile isotoper (en tung isotop bliver tilføjet til en prøve, mens en lettere version bliver føjet til en anden) kan anvendes i vævskultur. Når isotoper gå inkorporeres i proteinet, kan en proteomics analyse udføres ved at kombinere de to prøver (multiplexing). Men i tilfælde af spermatozoer, kan dette ikke ske, blot på grund af det faktum, at 1) isotopmærkning kræver flere passager (op til 8) i vævskultur og 2) sædcellerne har ingen transkription og translation nukleare gen og dermed de kan ikke optage isotoper i alle deres protein alligevel. En måde omkring dette er at bestille radioaktivt mærkede mus, men disse er notorisk dyre. En alternativ metode er at anvende en kemisk tag. Dette er blevet gjort, når ikke-kapacitetsbegrænsninger mus blev sammenlignet med kapacitetsbegrænsninger mus. I dette tilfælde en D 0 og D 31. Andre fremgangsmåder kan omfatte anvendelse af iTRAQ (isobare tag for relativ og absolut kvantificering), hvorved lysiner mærkes kemisk med forskellige masse isotoper; ICAT (isotop kodet affinitetsmærke), hvorved cysteiner er mærket med forskellige masse isotoper og tunge og lette mærkning vand.

I hvert enkelt tilfælde, men en ting skal holdes for øje. MS kun rapporterer, hvad der er til stede i en prøve, og det er en afspejling af alt, hvad der er sket for at prøve indtil da. Minimering prøvehåndtering samtidig maksimere udbyttet på hvert trin er nødvendige for en vellykket proteomisk analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone Aldrich 195464
2-D Quantitation Kit VWR (GE Healthcare) 80-6483-56
Albumin from bovine serum Sigma A7030
Ammonia solution 25% Merck 1.05432
Ammonium bicarbonate Sigma A6141
Calcium chloride Sigma C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate Research Organics 1300C
Chloroform BDH 10077.6B
Disodium hydrogen phosphate Merck 1.06580
Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779
Formic acid Sigma O6440
Glucose Sigma G6152
Glutamine-L Sigma G7513
Hepes (free acid) Sigma H3375
Iodoacetic acid free acid Sigma I4386
Lactic acid Sigma L1750
Magnesium chloride Res. Org. 0090M
Methanol Merck 10158.6B
Percoll (sterile) VWR (GE Healthcare) GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt ThermoFisher Scientific (Pierce) PIE78420
Potassium chloride Sigma P9333
Potassium hydrogen carbonate Medical Store CH 600
Sodium bicarbonate Sigma S3817
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium dihydrogen phosphate Merck 1.06346
Sodium hydrogen carbonate BDH 10247.4V
Sodium pyruvate Sigma S8636
Tris, ultra pure grade Amresco (Astral) AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade Promega V5280
Urea Sigma U5128
Zinc chloride Sigma Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317100
30 G needle Terumo NN2038R
3 ml Syringe Terumo SS035
4.2 mm Polyethylene tubing Goodfellow ET317640
Braided silk (5-0) Dynek CSS0100
Trichloroacetic acid Sigma 299537
TiO2 beads (from disassembled column) Titansphere 6HT68003
Eppendorf Tube Eppendorf 22431081
C7B30 Sigma C0856

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
  2. Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
  3. Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
  4. Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
  5. Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75, (4), 588-597 (2006).
  6. Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
  7. Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. The Epididymis. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).
  8. Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
  9. Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
  10. Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
  11. Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
  12. Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
  13. Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
  14. Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
  15. Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10, (3), 1004-1017 (2010).
  16. Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
  17. Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. The culture of mouse embryos in vitro. Freeman. (1971).
  18. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
  19. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
  20. Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
  21. Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
  22. Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
  23. Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69, (6), 1801-1807 (2003).
  24. Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
  25. Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
  26. Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
  27. Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
  28. Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
  29. Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
  30. Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
  31. Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics