Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi en effektiv metod för isolering, identifiering och rening av mus-tymus epitelceller (TEC). Protokollet kan användas för studier av thymus-funktionen för normal T-cellsutveckling, tymusdysfunktion, och T-cells rekonstitution.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51780, doi:10.3791/51780 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den bräss är ett viktigt organ för T-lymfocyter utveckling. Av tymiska stromaceller, tymiska epitelceller (TEC) är särskilt viktigt på flera stadier av T-cellsutveckling: T-cell engagemang, positiv urval och negativt urval. Dock förblir funktionen av TEC i tymus ofullständigt känd. I artikeln ger vi en metod för att isolera TEC delmängder från frisk mus bräss med en kombination av mekanisk störning och enzymatisk nedbrytning. Metoden tillåter tymiska stromaceller och tymocyter som skall effektivt frigöres från cell-cell-och cell-extracellulär matrix-anslutningar och för att bilda en enkelcellsuspension. Med hjälp av isolerade celler, kan multi flödescytometri tillämpas på identifiering och karakterisering av TEC och dendritiska celler. Eftersom TEC är en sällsynt cellpopulation i tymus, även beskriver vi ett effektivt sätt att berika och rena TEC genom att tömma tymocyter, den mest förekommande celltyp i tymus. Follovinge anrikn, cellsortering tid kan minskas, så att förlust av cellviabilitet kan minimeras under rening av TEC. Renade celler är lämpliga för olika nedströms analyser som Real Time-PCR, Western blot och genuttryck profilering. Protokollet kommer att främja forskning av TEC funktion och liksom utvecklingen av in vitro-T-cell beredning.

Introduction

Tidigt i T-cellsutveckling, är benmärg hematopoetiska stamcellsderiverade multi stamceller rekryteras till cortex i tymus, genomgår engagemang för T härstamning och blir T-cell prekursorer 1. I cortex, T-cell prekursor CD4 och CD8 dubbla negativa (DN) thymocyter expandera och differentiera till omogna CD4 och CD8 dubbelt positiva (DP) tymocyter, som bildar en stor pool av progenitorer med mycket variabel T-cellsreceptorer 1. Endast en utvald MHC-begränsad delmängd av DP celler blir CD4 eller CD8 enda positiva (SP) tymocyter, migrera till medulla i tymus, och differentierar till funktionellt kompetenta mogna T-celler, en händelse som kallas positiv selektion 2- 6. Däremot kloner av auto-reaktiva tymocyter genomgår negativt urval och avlägsnas via apoptos, omräknat till regulatoriska T-celler för självtolerans, eller avledas till intraepitelial lymfocyter för ändamål som är ännu oklart 3.7-10.

I bräss, tymiska stromaceller bildar en unik mikromiljö som ger signaler för dessa olika T-cell utvecklings öden 5,11,12. Thymic stromaceller är sammansatta av tymiska epitelceller (TEC) - inklusive kortikala TEC (cTECs) och medullära TEC (mTECs), dendritiska celler, makrofager, fibroblaster, endotelceller, neurallist-härledda pericyter och andra mesenkymala celler 13-15. Bland dessa, TEC är avgörande vid de olika stadierna av T-cellsutveckling 1,2,16,17. Dock har bristen på ett robust sätt att isolera TEC försvårat en omfattande förståelse för deras funktion 16. Särskilt cTECs, som bildar ett tredimensionellt nätverk kring stamceller i hjärnbarken, är avgörande för positiv selektion 13,18,19 skäl som ännu inte är klar. Tidigare studier förutsatt ledtrådar till heterogenitet och roll TEC, främst förlita sig på morfologiska och histologiska verktyg 13 12,20. En robust och reproducerbart sätt att isolera TEC är grundläggande för att uppnå opartisk karakterisering av TEC undergrupper, kvantitativ och kvalitativ bedömning av TEC funktioner och förtydligande av mekanismer hur cTECs stödja positiva val.

På grund av sällsynthet TEC i tymus och snäva interaktioner bildar i intakta organ, har isoleringen av TEC varit utmanande. Protokollet som beskrivs här bygger på tidigare upptäckter, för närvarande tillgängliga reagens, tekniker och kunskap om bräss struktur och stromal sammansättning. Nästan två decennier sedan, har flera förfaranden rapporterades att dela upp bräss vävnader 21-27, där olika enzymer användes under matsmältningen, inklusive trypsin, kollagenas och Dispase. Gray et al. jämfört dessa enzymer i sin precedure 28, och redovisade ett förbättrat methOD med flera steg nedbrytning av enzym cocktails 29 som blev ofta används 20,30. Dock innebär en lång förberedelsetid och komplexa rötningssteg och resulterar i varierande final cell nummer och proportioner av TEC även inom samma mus kohort 29,30 denna metod. För flera år sedan, Liberase forskningskvalitet enzym, innehållande högrenat kollagenas och neutrala proteas började användas i thymus vävnadsdissociering 30. Här beskriver vi en Liberase digestion-baserat protokoll, med optimerade rutiner mekanisk separation, som ger ett stort antal livskraftiga TEC från mus bräss vävnader. .

Att berika dissocierade stromaceller, har tidigare studier använt antingen densitetsgradienter eller magnetiska pärla separation 21,29. Men båda metoderna orsaka allvarlig förlust av vissa populationer av tymiska stromaceller, särskilt befolkningen i cTECs 29. Cytotoxiska eliminering och panorering tekniker 12,31. Efter jämförelse av dessa tekniker har vi etablerat det nuvarande panorering protokoll för anrikning av TEC. Den milda tillstånd under förfarandet anriknings leder till mindre celldöd och opartisk och ökad TEC återhämtning.

Den isolerade bräss cellsuspensionen beskrivs i avsnitt 3 kan appliceras direkt på flödescytometrisk analys för identifiering och karakterisering av TEC delmängder och dendritiska celler. Avsnitt 4 beskriver ett enkelt och användbart sätt att identifiera TEC delmängder som använder multi flödescytometer. För experiment som syftar till att erhålla renade cTECs eller mTECs, TEC anrikning och cellsortering förfaranden finns i avsnitt 5 och 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denna studie, vuxna - var (6 8 veckor) hona C57Bl / 6 möss används. Möss köptes från National Cancer Institute och underhållas under specifika patogenfria förhållanden. University of Minnesota Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkände alla djurförsök.

1 Beredning av instrument och buffertar

  1. Förbered enzymlösning (RPMI1640 medium med 0,05% [vikt / volym] av Liberase TH och 100 U / ml av DNas I), albumin-rik buffert (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-fri] med 0,5% bovint serum albumin och 2 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA]), FACS-buffert (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-fri] innehållande 1% fetalt bovint serum [FBS] och 0,02% NaN3), FACS-sortering buffert (1X PBS [Ca2 + / Mg2 +-fri] innehållande 2% FBS) och RP10 medium (RPMI-1640-medium som levereras med 10% FBS).
  2. Förbered 10 panorering plattor. Bered 40 ml beläggningslösning (0,01 mg / ml Ghavre anti-råtta IgG i 0,1 M NaHCOs 3 Buffer), och tillsätt 4 ml beläggningslösning i varje 100 x 15 mm platta, snurra och inkubera vid 4 ° CO / N. Häll av antikroppslösningen och skölj plattan med användning av 5 ml 1 x PBS för två gånger, virvla kraftigt mellan sköljningar. Förvara preparerade plattorna vid 4 ° C.

2 Skörd av Thymus Tissue

  1. Euthanize mus i en CO 2 kammare. Placera djuret på rygg på en dissektion matta, nåla fötterna på mattan och fukta pälsen genom att spraya med 70% etanol.
  2. Gör en mittlinjeincision genom huden, med början uppifrån urinrörets öppning rakt upp till den nedre käften med en sax och förlänga incisionen nedåt till knäna på båda sidor. Snittet ser ut som ett uppochnedvänt "Y". Dra den lösa huden tillbaka på sidorna, och fästa den på dissekering mattan.
  3. Punktera membranet från xiphoid, skära revbenen på varje sida upp till nyckelbenet, lyft sedan upp revbenen medpincett och fästa den på dissekering mattan. Den bräss är precis under revbenen, och ser ut som två tunna vita lober liggande hjärtat (figur 1). Koppla bindväv som omger bräss, dra försiktigt och ta bort par av bräss lober med böjda sågtandade pincett. Placera bräss lober i en 6 brunnar innehåller 5 ml RPMI-1640.

3 Beredning av Thymic stromaceller

  1. Trimma någon omgivande fett och bindväv och överföra tymus loberna till en ny brunn i 6-brunnars platta innehållande 5 ml förbereda färskenzymlösning. Gör små snitt i tymus lober med fina saxar och inkubera plattan vid 37 ° C under 20 min.
  2. Pipett försiktigt smälta bräss vävnad upp och ned 2-3 gånger med 5 ml pipett för vävnadsdissociering. Samla supernatantfraktionen i ett 50 ml rör innehållande 10 ml kallt albumin-rik buffert för att neutralisera enzymerna. Håll provröret på is. Lägg 2,5ml enzymlösning till den kvarvarande vävnaden och inkubera plattan vid 37 ° C under 15 min.
  3. Utför försiktig mekanisk omrörning med en 3 ml spruta och 18 G nål för att bryta upp aggregat. Pool vätskan in i provröret. Lägg 2,5 ml enzymlösning till den kvarvarande vävnaden och inkubera plattan vid 37 ° C under 15 min.
  4. Upprepa försiktig mekanisk omrörning med en 3 ml spruta och en 25 G nål, och inkubera plattan ytterligare 5-10 min.
  5. Efter fullständig digestion, pool supernatanten in i provröret. Centrifugera uppsamlingsrör vid 400 xg, 4 ° C under 8 min för att samla upp cellerna. Aspirera vätskan och suspendera pelleterade cellerna i 10 ml albumin rika buffert och filtrera provet genom 100 mm maska. Räkna celler med användning av en hemocytometer. Utför sedan flöde cytometic analys (avsnitt 4) eller TEC anrikning (5 §).

4 Identifiering av TEC med flödescytometri

  • Bered celler till en slutlig koncentration av 4 x 10 6 celler per 100 | al i FACS-buffert för färgning i en 96 brunnars rundbottnad testplatta och hålla plattan på is. Lägg 20 pl Fc-block lösning (anti-CD16 / CD32 antikropp vid 10 | ig / ml i FACS-buffert) till cellerna och inkubera cellerna under 10 min på is. Snurra plattan vid 400 xg, 4 ° C under 3 min. Kasta vätska från brunnarna genom att ställa plattan ansiktet ner i ett handfat.
  • Suspendera de pelleterade cellerna i 100 | il antikropp cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC klass II, och -Ly51 antikroppar och UEA-1 lektin märkta med olika fluorokromer vid tillverkarens rekommenderade eller testade optimala koncentrationer av varje antikropp i FACS-buffert ), och inkubera cellerna på is under 20 minuter i mörker. För kompensation, färga 1 x 10 6 celler med varje enskild fluorokrom.
  • Lägg 100 | il FACS-buffert till varje brunn och snurra plattan vid 400 xg, 4 ° C under 3 min. Upprepa tvättsteg entid, och sedan återsuspendera cellerna i 100 | il FACS-buffert. Överför cellerna till en 12 x 15 mm rundbottnad FACS-rör fylldes med 300 | il FACS-buffert. Förvärva prover på flödescytometer och analysera data med hjälp av FACS analysprogram. TEC gating strategi visas i figur 2.
  • 5. Anrikning av TEC genom Panorering

    1. Centrifugera ner de tymusceller (framställda i avsnitt 3) vid 400 xg, 4 ° C under 5 min. Aspirera vätskan och suspendera de pelleterade cellerna i FACS-sortering buffert vid en koncentration av 2 x 10 8 celler per ml i en 15 ml eller 50 ml koniska rör. Lägg anti CD90.2 antikropp (klon 30-H12) (eller anti-CD45) vid en slutlig koncentration av 2,5 | ig / ml av cellsuspension och inkubera cellerna försiktigt på en roterande bländare vid 4 ° C under 30 min. Efter inkubationen tvättas med en 5 - 10x volym av RP10 medium och centrifugera röret vid 400 xg, 4 ° C under 5 min.
    2. Aspirera vätskan och suspendera de pelleterade cellerna iRP10 medium vid en koncentration av 1 x 10 7 per ml. Lägg 5 ml cellsuspension till varje belagd vask platta (framställd i steg 1,3), virvla och inkubera under 30 min vid RT. Snurra kraftigt; överföra supernatanterna i en konisk tub. Skölj plattan två gånger med RP10 medium och pool supernatanterna in i provröret.
    3. Centrifugera uppsamlingsrör vid 400 xg, 4 ° C under 5 min. Aspirera vätskan och suspendera de pelleterade cellerna i 5 ml RP10 medium. Lägg cellsuspensionen till ett nytt vask platta, virvla och inkubera under 30 min vid RT. Samla cellerna skölj plattan och samla dem i en konisk tub. När TEC berikas, spinna ned cellerna vid 400 xg, 4 ° C under 5 min och suspendera cellerna i 5 ml FACS-sortering buffert.

    6 Rening av TEC genom cellsortering

    1. Räkna celler med användning av en hemocytometer och förbereda cellsuspension vid en koncentration av 4 x 10 7 celler i FACS sorteringsbuffert. Lägg antikroppar desfaktorer beskrivs i avsnitt 4.4 i cell-lösning och inkubera cellerna försiktigt på en roterande bländare vid 4 ° C under 30 min. Efter färgning, tvätta och suspendera cellerna till en koncentration av 10 x 10 6 celler per ml av FACS-sorteringsbuffert.
    2. Sortera TEC undergrupper genom en 100 iM munstycke med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering. Sorterade celler uppsamlas i 30% (v / v) FBS i RPMI-1640). När cellsortering görs, centrifugera celler vid 400 xg, 4 ° C i 5 min och förbereda nedströms analys.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Med hjälp av detta protokoll, var en tymus organ avlägsnats från en vuxen mus (avsnitt 2) och en tymisk cellsuspension framställdes som beskrivs i avsnitt 3 Den erhållna cellsuspensionen bestod av tymocyter, hematopoetiska-härledda stromaceller och icke-hematopoetiska stromaceller. CD45 är en hematopoetisk pan-markör uttryckt på båda tymocyter och hematopoietiska stromala celler såsom makrofager och dendritiska celler. Däremot TEC är inte av hematopoetisk ursprung och inte uttrycker CD45 15. Cell färgning och flödescytometrianalyser utfördes som beskrivs i avsnitt 4.

    Två typer av TEC undergrupper, cTECs och mTECs, härstammar från en gemensam bi-potent TEC gångare 15. Både cTECs och mTECs uttrycker EpCAM-molekylen på sin yta 28. Sålunda TEC kan gated enligt EpCAM-positiva och CD45-negativa genom flödescytometri (Figur 2A). cTECs och mTECs kan särskiljas genom två reagenser: den Ly51antikropp som känner igen glutamyl aminopeptidas uttrycks av CTEC och lektin Ulex Europaeus agglutinin-1 (UEA-1) 28 som binder till MTEC (Figur 2B). Både mTECs och cTECs uttrycker MHC klass II molekyler på sin yta (figur 2C och 2D). mTECs kan vidare delas in i MTEC låg och MTEC hög beroende på nivån av MHC II molekyler (Figur 2D). Det genomsnittliga antalet TEC per bräss är ca 9 x 10 5. I direkta jämförelser, återhämtade vi ungefär åtta gånger fler TEC använder denna Liberase enzym baserat protokoll jämfört med en flerstegsprotokoll med kollagenas / dispas 29 (Figur 3).

    För att minska sorteringstiden och öka livskraften i återvunna stromaceller utvecklade vi en panorering metod för att utarma tymocyter eftersom bräss cellsuspensionen består av över 95% tymocyter. Cellerna inkuberades med enti-CD90-antikropp och fångas upp av förbelagda plattor. Jämfört med den i hela beredda tymusceller (pre-berikade), var andelen TEC ökat från mindre än 0,5% till över 15% i efter berikade celler (Figur 4A och 4B). Panorera med anti-CD45 kan också användas om till exempel behöver man inte återhämta dendritceller också. I det här fallet, TEC anriknings ökar till ca 80% (data visas ej). Efter stromal cell anrikning genom att panorera, jämfördes den andel av TEC delmängder ändras inte (Figur 4C och 4D), vilket tyder på att en delmängd eller den andra inte är selektivt förlorad under panorering. Jämfört med för-anrikningsprov, återvinningsgraden av TEC var cirka 85% (Figur 4E).

    Figur 1
    Figur 1. mus tymus During dissekering. Tymus är belägen ovanför hjärtat i den främre övre bröstkorgen. Efter kapning och lyfta revbenen, de två vita lober bräss exponeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 2
    Figur 2 Identifiering av CTEC och MTEC med flödescytometrisk dataanalys. Stained bräss cellprover analyserades med flödescytometri. Representativa FACS-profiler visas. Siffrorna anger den procentuella andelen av varje population. (A) Av levande celler, en grind av CD45-negativa och EpCAM-positiva händelser representerar TEC celler. (B) Inom TEC porten är två populationer åtskilda av nivån på Ly51 och UEA- 1. cTECs har höger expression av Ly51; mTECs har högre nivå av UEA-1. (C) MHC II molekyler är högt uttryckt på cTECs. (D) mTECs består av MHC II höga och MHC II Ande subpopulationer, som separat benämnes MTEC hög och MTEC låg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3 A Liberase-baserat protokoll tillåts högre cellutbyten från tymus än att använda en flerstegs kollagenas / dispas-protokollet. Thymus celler preparerades med användning av en tidigare publicerad flerstegs kollagenas / dispas protokoll eller denna Liberase-baserat protokoll. De två grupperna av prover analyserades genom flödescytometri. (A) </ Strong> Representativa FACS profiler visas. Siffrorna anger den procentsats av TEC-celler i varje grupp. (B) Totalt cell nummer av TEC per mus thymus visas i stapeldiagrammet. Felstaplar anger standardavvikelsen (n> 3). En två-tailed, oparade t-test utfördes med hjälp av programvara Prism. P <0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 4
    Figur 4 Anrikning av TEC genom vaskmetoden. FACS profiler för före och efter berikad tymus stromaceller visas. Beredda tymusceller färgades med anti-CD90-antikropp. CD90-positiva tymocyter komponera över 95% av tymusceller. Under TEC förfarandet anrikning, tymocyter är Captured och utarmat på förbelagda vaskplatta är således TEC anrikas i supernatanten. (A) och (B), är TEC portar visas. Siffrorna visar hur stor andel av TEC bland totala levande celler i start populationen (Pre-anrikning) eller efter anrikning (Post-anrikning). (C) och (D), är Celler inom CTEC och MTEC portar visas. Siffrorna visar den procentsats av CTEC och MTEC i TEC-populationer från varje grupp. (E) Cellantal av cTECs och mTECs per mus tymus visas i grafen. Data är representativa för fem experiment. "Pre" står för prov föranrikning; "Post" står för prov efter anrikning; små horisontella linjerna anger medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I protokollet, kritiska steg är att förbereda bräss stromaceller (avsnitt 3) och anrikning av TEC (avsnitt 4). Det rekommenderas starkt att färsk enzymlösning bereds varje gång och vävnaden behandlas så snart som möjligt. För poolade Thymi, är att optimera volymen av enzymlösning som krävs beroende på antalet Thymi. Om någon vävnad rester finns kvar efter behandling, kan lägga till mer enzymlösning och förlängning av inkubationstid öka cellutbytet. Under anrikning av TEC, slutföra samling av supernatanten och upprepa plåtskölj beskrivs i avsnitt 5.3 kommer att minska cellförlust.

    I 1980, Wekerle et al. först rapporterade en typ av TEC - "tymiska sjuksköterska celler" (TNF) 33, som är stora kortikala epitelceller som helt omsluter många livskraftiga lymfoida celler i intracellulära vesiklar. År 1982 Kyewski och Kaplan beskrev olika isolerings diritions som påverkar utbytet av transnationella företag 34. Nyligen Takahama och kollegor revisited isolering och egenskaper transnationella företag. De identifierade sådana celler på grundval av förmåns färgning för CD45 först efter membran permeabilization 35. De beskrev också "trasig" TNC i deras förberedelser, som bestod av en CTEC och flera bundna tymocyter. Sådan brutna TNC var positiva för extracellulärt CD45 och för CTEC markör β5t och omfattade 70% av den totala cTECs i deras förberedelser. I själva verket konstaterade vi också en liknande cellpopulation, som var CD45 hög EpCAM + och Ly51 + i vårt förberedda bräss cellsuspension, även omfattade mindre än 40% av de totala cTECs med vår isolering förfarande. Dessa trasiga TNC avlägsnas från TEC anrikningsprotokoll, som vårt, som använder utarmning med antingen CD90 eller CD45. Således kommer en framtida utmaning är att minimera förlusten av denna befolkning.

    Jämförttill den befintliga flerstegs uppslutning 29 tillåter Liberase matsmältningen protokollet en betydligt högre cell direktavkastning på TEC (Figur 3). Andra grupper har också rapporterat sina nya metoder för tymisk stromal cellisolering genom att modifiera Grays metod 30,36, även om cellutbyte inte var signifikant. Nyligen Chidgey och kollegor rapporterade självständigt ett TEC-protokoll använder Liberase matsmältningen och de fick också effektiv frisättning av TEC 37. Däremot har den första tymocyt frigör steg i sitt protokoll potential att göra sig av ca 1,6 x 10 4 TEC från varje tymus 29, varav de flesta är cTECs. På grund av densitetsgradient anrikning leda till förlust av mindre stromaceller är en AutoMACS Baserad CD45-mikrokorn utarmning populärt används för anrikning av TEC före FACS rening 29,36,37. Jämfört med AutoMACS baserade berikning med CD45-mikrokorn utarmning protokoll 29, depanorering anrikning erhålls högre återbetalningsgrad av TEC. Sammantaget protokollet presenteras här aggregerar ett antal tidigare rapporterade fördelar. TEC delmängder renats med detta protokoll (§ 6) har med framgång använts för vidare analys, till exempel Real Time-PCR och Western blot-analys 12.

    Detta protokoll är också lämpligt för isolering och studium av andra tymiska stromala celler, såsom dendritiska celler. Vi tror att den kraftiga isoleringen av tymiska stromaceller, särskilt TEC, kommer att påskynda förståelse för hur bräss funktioner för T-cellsutveckling och nå in vitro T-cells konstitution. Vidare karakterisering av dessa celler har stort praktiskt värde för den medicinska gemenskapen, eftersom ett vanligt problem med återhämtning från behandlingar (såsom de som används vid transplantation och behandling av cancer) är dålig beredning av epitelceller i tymus som leder till immunbrist.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

    Acknowledgments

    Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (till KAH). Vi tackar också University of Minnesota flödescytometri Resurs.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Anti-mouse EpCAM eBioscience XX-5791-YY* Clone G8.8
    Anti-mouse MHC II eBioscience XX-5321-YY* Clone M5/114.15.2
    Anti-mouse Ly51 eBioscience XX-5891-YY* Clone 6C3
    UEA-1 Vector Laboratory FL-1061
    Flow cytometer BD Biosciences  LSRFortessa
    Flow cell sorter BD Biosciences  FACSAria
    FACS tubes BD Biosciences 352052
    Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
    *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
    2. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
    3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
    4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
    5. Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
    6. Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
    7. Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
    8. Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
    9. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
    10. Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
    11. Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
    12. Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
    13. Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
    14. Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
    15. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
    16. Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
    17. Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
    18. Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
    19. Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
    20. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
    21. Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
    22. Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
    23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
    24. Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
    25. Shortman, K., Vremec, D., D'Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
    26. Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
    27. Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
    28. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
    29. Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
    30. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
    31. Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7, (Unit 7.3), (2001).
    32. Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3, (Unit 3.5), (1991).
    33. Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
    34. Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
    35. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
    36. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
    37. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).

    Comments

    23 Comments

    1. Interesting approach, Could you please specify what kind of Panning Plates were used in this experiment?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 12:30 PM
    2. Sterile Petri Dishes were used in this experiment.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 1:48 PM
    3. The plates are made from polystyrene.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 20, 2015 - 3:48 PM
    4. Thank you. is there a specific clone for the Goat anti-Rat IgG that you used to coat the panning plates? and the company if possible?

      Reply
      Posted by: Sara A.
      January 20, 2015 - 4:02 PM
    5. We purchased the Goat anti-Rat IgG antibody from Sigma-Aldrich. Other companies' product should work as well.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:02 AM
    6. The antibody we used is polyclonal.

      Posted by: Yan X.
      January 22, 2015 - 11:11 AM
    7. Did you use the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma? Thank you!

      Posted by: Geoffrey G.
      May 12, 2016 - 10:06 AM
    8. Yes, I used the whole molecule, unconjugated, lyophilized antibody from Sigma.

      Posted by: Yan X.
      May 12, 2016 - 3:59 PM
    9. Hi there, do you have a catalog number for the liberase TH you used?

      Reply
      Posted by: Lindsey W.
      February 2, 2016 - 7:52 PM
    10. Roche 05401135001 10 mg (2 x 5 mg);
      Roche 05401151001 100 mg (2 x 50 mg)

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 3, 2016 - 11:36 AM
    11. How many ml of RPMI1640 medium did you use for dissolve a vial of 5mg or 50mg liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 20, 2017 - 11:48 AM
    12. Dissolve 5 mg liberase TH in 10 mL of RPMI1640 medium; 50 mg liberase TH in 100 mL of RPMI1640.

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 21, 2017 - 3:56 PM
    13. Hi, do you have a catalog number for the DNase I you used?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      February 27, 2017 - 4:14 PM
    14. Roche 10104159001

      Reply
      Posted by: Yan X.
      February 28, 2017 - 4:51 PM
    15. The packing information for Roche DNAse (10104159001) is 100mg, how did you make the 100 U/ml of DNase I as in the protocol. The vendor seems do not provide information as how to convert mg to units. Thank you!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 11:34 AM
    16. 100mg=200KU

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 21, 2017 - 12:10 PM
    17. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 21, 2017 - 12:31 PM
    18. May I ask that how will you store the H2O-reconstituted DNAse after aliquot? According to Sigma information sheet, it should be reconstituted in water and can only be kept for 2 to 3 days at 2 to 8 °C (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US) . Because each time I only need a small amount aliquot (~1mg), not sure how can the rest be stored properly. The Sigma technical service does not provide more support to this question. Thank you very much!

      Reply
      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 9:22 AM
    19. -20 °C

      Reply
      Posted by: Yan X.
      July 25, 2017 - 10:47 AM
    20. Does the reconstituted DNAse need other reagents except H2O when store in -20 °C?

      Posted by: Tong W.
      July 25, 2017 - 11:59 AM
    21. Interesting method, but because Liberase TH is not available currently at Sigma, do you have other recommendation which is equally effective as Liberase TH?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      June 1, 2017 - 4:36 PM
    22. We were told orders will be filled in July and our stocks are holding for now. So, I do not have an answer for you. If any others do, please post.

      Reply
      Posted by: Kris H.
      June 2, 2017 - 9:29 AM
    23. I found out a lost of CD4/8 markers in thymocytes after harsh Liberase TH treatment, have you seen the similar phenomenon in your experiment?

      Reply
      Posted by: Tong W.
      August 15, 2017 - 6:43 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics