High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human vævssnit til forbedring Patologi

* These authors contributed equally
Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sreedhar, H., Varma, V. K., Nguyen, P. L., Davidson, B., Akkina, S., Guzman, G., Setty, S., Kajdacsy-Balla, A., Walsh, M. J. High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) Spectroscopic Imaging of Human Tissue Sections towards Improving Pathology. J. Vis. Exp. (95), e52332, doi:10.3791/52332 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spektroskopisk imaging er en spirende tilgang for at opnå detaljerede billeder, der er forbundet biokemisk information. FT-IR billeddannelse af væv er baseret på princippet om, at forskellige regioner i midten af infrarøde absorberes af forskellige kemiske bindinger (fx C = O, CH, NH) inden celler eller væv, kan derefter blive relateret til tilstedeværelsen og sammensætning af biomolekyler (fx lipider, DNA, glycogen, protein, collagen). I et FT-IR billede, hver pixel i billedet omfatter en hel Infrarød (IR) spektrum, der kan give oplysninger om den biokemiske status for de celler, der kan udnyttes til celletype eller sygdom type klassificering. I dette papir viser vi: hvordan du kan få IR-billeder fra humane væv ved hjælp af en FT-IR-systemet, hvordan du ændrer eksisterende instrumenter for at muliggøre high-definition billeddannelse kapaciteter, og hvordan man kan visualisere FT-IR-billeder. Vi derefter præsentere nogle anvendelser af FT-IRfor patologi ved hjælp af lever og nyre som eksempler. FT-IR imaging holder spændende applikationer i at tilvejebringe en ny rute for at få biokemisk information fra celler og væv i en helt label-fri som ikke medfører forstyrrelser vej mod at give ny indsigt i biomolekylære ændringer som en del af sygdomsprocesser. Derudover kan denne biokemiske information potentielt give mulighed for objektiv og automatiseret analyse af visse aspekter af sygdomsdiagnose.

Introduction

IR-spektroskopi har været et analytisk værktøj til rådighed i en eller anden form siden 1930'erne; er det imidlertid kun været inden for det sidste årti, at området af væv billeddannelse med FT-IR er eksploderet. De fremskridt i FT-IR for væv billeddannelse er blevet drevet i en stor del af tre vigtigste udvikling: 1) øget hastighed dataopsamling på grund af tilgængeligheden af store Focal Plane Array (FPA) detektorer, der typisk har tusindvis af IR følsomme detektorer 1 , 2, 2) udvikling af avancerede algoritmer og datakraft til at håndtere store hyperspektrale datasæt 3, og 3) modellering af FT-IR billeddannende systemer til at maksimere rumlig opløsning 4,5. Der har været talrige høj kvalitet og meget omfattende artikler gennemgå området for FT-IR-spektroskopi nylig 6-16, i tillæg til en Nature Protocols papir, der beskriver de skridt til at opnå point spektre eller kort fra væv 17. I dette papir vil vi fokusere på protocol at opnå billeder af væv ved hjælp af en 128 x 128 FPA detektor i en modificeret FT-IR system med høj definition kapaciteter.

FT-IR imaging har længe været foreslået at være et potentielt ønskeligt værktøj til celler og væv billeddannelse på grund af evnen til at opnå billeder, hvor hver pixel har et væld af biokemisk information. FT-IR imaging er baseret på princippet om, at forskellige biomolekyler i en prøve kvantitativt vil absorbere forskellige regioner i mid-infrarød; dette giver mulighed for at udlede en "biokemisk fingeraftryk '. Denne fingeraftryk var blevet vist i mange undersøgelser for at ændre mellem forskellige celletyper og sygdomstilstande. I modsætning til konventionel patologi praksis, hvor pletter og immunhistokemiske markører skal anvendes til at visualisere og identificere celletyper og vævsstrukturer, der anvendes til at lede diagnose og behandlingsmuligheder er billederne fra FT-IR dannet baseret på iboende biokemi af vævet. Den nuværende Technique af farvning væv til diagnose er tidskrævende, destruktiv, besværlig og kræver subjektive ekspertise patolog, mens FT-IR giver mulighed for at gøre denne proces hurtig, ikke-destruktiv, højt automatiseret, og mere objektiv. Desuden FT-IR tilvejebringer en hidtil ukendt vej til at opnå yderligere biokemiske information, som måske ikke være let tilgængelig ved anvendelse af traditionelle farvningsteknikker.

En af de mest spændende fremskridt i de senere år har været tilgængeligheden af ​​høj opløsning billeddannelse tilgange, der kan nu giver mulighed for visualisering og karakterisering af celletyper og vævsstrukturer, som er kritiske for omfattende sygdomsdiagnose. En af disse teknikker er svækket Total Reflectance (ATR) FT-IR, som inkorporerer en fast nedsænkning linse (SIL) af et højt brydningsindeks, som giver mulighed for høj opløsning billeddannelse 18 med mange meget spændende undersøgelser, der viser dens anvendelsesmuligheder 19-25. Desuden wsom for nylig viste, at den øgede rumlige opløsning er forbundet med ATR imaging kan give mulighed for visualisering og klassifikation af endotel og myoepitelcellerne i brystvæv, som udgør en vigtig del af brystkræft diagnose 26. Mens ATR billeddannelse er meget nyttig, kræver denne teknik SIL at komme i kontakt med vævet til dannelse af FT-IR-billeder; Derfor er dens anvendelse noget begrænset for væv patologi, hvor store områder af væv skal hurtigt afbildes.

En anden fremgangsmåde blev demonstreret ved kobling af en høj objektivforstørrelse til en eksisterende FT-IR system, der bruger en synkrotron som en lys kilde til IR, er det muligt fuldt ud at belyse et FPA billede og med en effektiv pixelstørrelse på 0,54 x 0,54 um. Dette gav mulighed for os at visualisere vigtige strukturer i bryst og prostata væv, der ikke var løses ved anvendelse af traditionelle FT-IR-systemer 4. Mens disse dramatiske stigninger i IR billede rumlig resolution var spændende, dets anvendelse fortsat begrænset på grund af at kræve en synkrotron. Efterfølgende blev et optimalt system, der, som også giver mulighed for HD-billeddannelse kapaciteter med en 1,1 x 1,1 um pixelstørrelse uden krav om en synkrotron kilde, men snarere ved hjælp af en traditionel globar IR kilde 5. I denne artikel viser vi, hvordan du ændrer en eksisterende kommerciel FT-IR imaging system til at give mulighed for diffraktion begrænset IR billeddannelse af væv med et acceptabelt signal støjforhold at bruge flere IR mål (15X, 36x, og 74X). Den effektive pixel størrelse med de tre mål er 5,5 x 5,5 um (15X), 2,2 x 2,2 um (36X) og 1,1 x 1,1 um (74X). Så giver vi nogle eksempler på betydningen af de gevinster i rumlig opløsning til påvisning sygdom i lever og nyre biopsier 27.

Protocol

1. Opsætning af en FT-IR mikroskop og Erhvervelse Tissue Images

  1. Afsnit en formalinfikseret paraffinindlejret væv blok på 4 um tykkelse på et IR kompatibel slide under anvendelse af en mikrotom. Alternativt sektion en flydende nitrogen frosset væv ved 4 pm tykkelse på en IR kompatible dias ved hjælp af en kryostat.
    BEMÆRK: Typisk vil en seriel sektion også erhverves på et objektglas og farves med en særlig (såsom Hæmatoxylin og eosin (H & E)) eller immunhistokemisk farvning. Desuden kan dyrkede cellelinier dyrkes på IR kompatible objektglas. IR kompatible dias kan være IR reflekterende dias for refleksion tilstand billeddannelse (f.eks MirrIR slide, guld) eller IR gennemsigtige rutschebaner til transmission tilstand billeddannelse (f.eks BaF 2, CaF 2).
  2. Rensning af FT-IR mikroskop og spektrometer ved anvendelse af enten tør luft eller tør nitrogengas for at fjerne atmosfærisk vand fra systemet. Vent mindst 45 minutter før billeddannelse for at sikre en grundig purge.
  3. Cool både FPA detektor (79 K) og den interne MCT-detektor i FT-IR mikroskop anvendelse af flydende nitrogen. Cool detektorerne cirka hver 6 timer.
    ADVARSEL! Flydende nitrogen er en kryogen væske og kan forårsage kolde forbrændinger, forfrysninger og i lukkede rum kvælning.
  4. Monter prøven slide på mikroskopet scenen for FT-IR-billeddannelse.
  5. Sørg for synligt lys er "ON" og derefter enten ved hjælp af kikkert eller prøven capture program (som giver en real-time synligt billede af vævet), fokus på prøven.
  6. Åbn bundle softwarepakke såsom resolutioner pro og klik på 'Collect "klik" Diagnosticering "og derefter vælge" Juster Spectrometer «. Sørg for, at strålen sti til spektrometer indre detektor ikke hindres.
  7. Klik på 'Opsætning Imaging ".
  8. I fanebladet 'Elektronik', vælge den relevante "Speed", "Under Sampling Ratio (UDR) "og" filtre "indstillinger afhængigt af systemet.
    BEMÆRK: I dette eksempel er indstillingen Speed ​​= 2,5 KHz, UDR = 4 og Filtre = Ingen.
  9. Under fanebladet 'Optics' sikre 'Mid-IR kilde', 'Open blænde "og" 100% stråle dæmperen "er valgt.
  10. For at kalibrere systemet, i »Optics 'fanen, skal du vælge' Detektor 'som' Ground ',' Microscope Detector« som »Venstre«, og vælg derefter enten "Transmittans« eller »Reflectance 'under' Optics mode 'afhængigt af den type af glide anvendes.
  11. Klik på Opsætning, som vil åbne op for 'Lancer Control' vindue.
    BEMÆRK: refleksion tilstand følge instruktionerne i 1.12 og 1.13, og for transmission tilstand følge instruktionerne i 1,14-1,16. Fortsæt fra 1,17 til både refleksion og transmission.
  12. For refleksion tilstand i &# 8216; Lancer Control 'Klik på' Raw '. Brug af scenen kontrol joystick og ser live-visningen af ​​FT-IR interferogram billede (øverst til højre billede), flytte til et rent område på objektglasset.
  13. Juster integration tid til cirka 8.000 tæller. Dernæst flytte scenen for at finde et stykke væv med struktur, fortrinsvis i udkanten af ​​en væv, og perfekt fokus af billedet. Change 'Warmth "og" Kontrast "muligheder for at hjælpe danne et billede for at forbedre fokus, vil det ikke have nogen effekt på IR data. Fortsæt fra 1.18.
  14. For transmission tilstand i 'Lancer Control' Klik på 'Raw'. Brug af scenen kontrol joystick og ser live-visningen af ​​FT-IR interferogram billede (øverst til højre billede), flytte til et rent område af slæden.
  15. Juster integration tid til cirka 8.000 tæller.
  16. Juster bunden fokusering / kondensator mål at øge antallet af tællinger til sin Maksi-m. Se formen af ​​det nederste højre billede i Lancer kontrol for at sikre, at det er gaussisk i udseende og relativt ensartet. Juster integration igen til ca. 8.000 tæller.
    BEMÆRK: Hvis nogen af ​​pixels i FT-IR interferogram billede bliver hvide, reducere integrationstiden.
  17. Flyt trin at finde et stykke væv med strukturen, fortrinsvis kanten af ​​et væv og perfekt fokus af billedet. Eventuelt ændre varmen og kontrast muligheder for at bidrage til at danne et billede for at forbedre fokus, men vil ikke have nogen effekt på IR data.
  18. Brug af scenen kontrol joystick, flytte til et rent område af slæden. Tryk på "Kalibrer" -knappen. Sørg for, "Out Of Range (OOR)» værdien er mindre end 50, og forskellen mellem "High Flux" og "Low Flux 'tæller er mindst 4.000 tæller.
  19. Vælg "OK" to gange. I optik fanerne vælge; »Detektor '=' MCT ',' Microsklare Detector '=' rigtige 'og klik på' Setup '. På dette tidspunkt vil der være en FT-IR interferogram på skærmen. Klik på 'Find Centerburst «. Klik på 'Okay'.
  20. I fanebladet 'Optics ", genvælge' Detektor '=' Ground ',' Microscope Detector '=' left 'og vælg' Setup '.
  21. I Lancer Control - sikre billedet er stadig på et rent område, og klik på 'Kalibrer' igen. Klik på 'Okay'.
  22. Dernæst indsamle en baggrund FT-IR billede for at korrigere for absorbans fra atmosfæren, systemet og slide. Gå til fanen 'Elektronik' og vælge en passende spektral opløsning, typisk på 4 cm-1 eller 8 cm -1 til væv.
  23. Gå til fanen 'Baggrund' og skriv 128 i »Scanninger at co-add". Vælg "Ny fil ... 'og placere baggrunden filen i passende folder. Kontroller "Imaging" Tab for at sikre mosaicing er 1 med 1. Klik på 'Baggrund', vente til scanningen færdig og bekræft hvor du vil gemme filen. Klik på en region på baggrund FT-IR billede og tjek spektret.
  24. For at tage et stort mosaik billede af prøven, skal du vælge fanen 'Imaging "og indsætte antallet af X og Y rammer for mosaik størrelse du ønsker at erhverve.
  25. Klik på 'Setup' og i Lancer Kontrol bruge levende IR for at finde det område af interesse. Hvis tager en mosaik, centrere levende foder i midten af ​​området af interesse. Klik på 'Okay'. Gå til fanen 'Elektronik' og skriv antallet af scanninger til at co-tilføje (typisk en værdi mellem 2 og 16 scanninger for væv). Klik på 'Scan'.
  26. Kontroller indsamlet FT-IR billede på skærmen for at sikre, at det ser fokuseret. Klik på billedet for at hente et IR-spektrum fra det pågældende sted, og kontrollér, at det ser ud til at have et acceptabelt signal til støj. Acquire et synligt billede af prøven.
  27. Gem billedet, og eksportere den til det ønskede format, såsom ENVI-IDL.

2. Tilpasning af en FT-IR Microscope for HD-Capabilities

BEMÆRK: De fleste FT-IR-systemer er udstyret med et mål på ca. 15X forstørrelse og 0,5 numerisk åbning (NA). Til billede i high-definition-tilstand, kan en IR kompatible 36X eller 74X mål bruges til at give diffraktion begrænset billeddannelse kapaciteter.

  1. Fjern systemets 15X målsætning ved at skrue mod uret.
  2. Skru i enten 36X eller 74X mål i stedet. Juster målet før brug. Brug linse forlængerrør at bringe målet tæt nok til prøven.
  3. Placer væv under det nye mål og fokusere ved hjælp af synligt lys ved hjælp af enten kikkerten eller prøve Capture program.
    BEMÆRK: High-definition billedbehandling skal ske i transmission mode. Den meget tæt arbejdsafstand afSE mål (1-2 mm) og meget lavvandet dybdeskarphed kræver fokus langsomt og forsigtigt, tager tid at sænke målet uden at røre prøven.
  4. Følg anvisningerne 1,6-1,11.
    BEMÆRK: På grund af at være betydeligt mere vanskeligt at fokusere og langt mindre lys, der når detektoren, er følgende protokol justeres baseret på 1.14.
  5. I transmission, skal du klikke på 'Raw'. Brug af scenen kontrol joystick og ser live-visningen af ​​FT-IR interferogram billede (øverst til højre billede), skal du flytte til vævet og fokusere (helst på en kant).
    BEMÆRK: Det kan være svært, derfor justere "varme" og "Kontrast" muligheder for at bidrage til at danne et billede for at forbedre fokusering (disse muligheder har ingen indflydelse på IR data).
  6. Når fokuseret ved hjælp af scenen kontrol joystick og live IR visningen flytte til et rent område af dias. Juster integration tid til cirka 8.000 tæller. Juster bunden fokuserer formål atøge antallet af tællinger på sit maksimum. Juster integration igen til ca. 8.000 tæller.
  7. Flyt trin at finde et stykke væv med strukturen, fortrinsvis kanten af ​​et væv, og perfekt fokus af billedet.
  8. Hvis billedmosaik et billede i høj opløsning, skal du justere scenen for at muliggøre korrekt bevægelse kræves på tværs af afstande til nøjagtig mosaicing. For at ændre indstillingerne fase afstand, gå til 'Setup fase «i Lancer Kontrol og justere den vandrette og lodrette indstillinger alignment at give mulighed for korrekt billedmosaik.
  9. Brug af scenen kontrol joystick flytte til et rent område af dias. Tryk på "Kalibrer" -knappen. Sørg for Out Of Range (OOR) værdi er mindre end 50 for både 36X og 74X mål. Sørg forskellen mellem High Flux og Low Flux værdier er mindst 1.000 tæller for 74X mål og 2.000 tæller for 36X mål.
  10. Fortsæt 1,19-1,27. Antallet af scanninger i 1,23 og1.25 vil skulle justeres på grund af nedsat signal til ca. 256 scanninger til baggrundsbilledet og 16-128 scanner for vævet billede.

3. visualisere og klassificere IR spektrale datasæt

BEMÆRK: I dette afsnit vil vi diskutere, hvordan man kan visualisere og udtrække data fra spektrale billeder ved hjælp af geospatiale billedbehandling og analyse software såsom ENVI + IDL, men processen er meget ens for enhver alternativ software som MATLAB, gratis software som CytoSpec eller instrumentets udviklerens egen software. Der er et par forskellige spektrale forarbejdningsteknikker, der kan udføres på IR data.

  1. Åbent geospatiale billedbehandling og analyse software og indlæse IR datafil.
  2. Påfør en baseline korrektion algoritme til IR data ved at vælge "Spectral værktøjer" og rul ned og klik på "Absorbansspektre". Overhold en pop-up-menuen og vælg "Baseline korrektion "
    BEMÆRK: Baseline korrektion fjerner en baseline offset skråning fra data som følge af spredning
  3. Udfør Spectral normalisering ved opstilling af forhold dataene til en vis spektral spids (typisk amid I (1.650 cm -1) eller amid II (1.550 cm -1)) eller et område under et defineret område af spektre. Gør dette ved at vælge "Normal spektre" under "absorbansspektre" menupunkter.
    BEMÆRK: Spectral normalisering udføres således, at eventuelle forskelle i spektre er reelle biokemiske forskelle og ikke på grund af tykkelse eller densitetsforskelle mellem prøver.
  4. Brug en støjreduktion algoritme til at fjerne støj fra spektrene evt 28.
    BEMÆRK: Der er flere tilgange til rådighed, som baseline korrektion, spektral normalisering og støjreduktion kan opnås, med de fleste software med automatiserede algoritmer indbygget Derudover er der en spirende række metoder, der vil korrigere for.spektrale afvigelser, der er blevet drøftet i detaljer 29-42; Men samfundet endnu ikke enige om, hvilke af disse er nødvendige.
  5. Overhold en liste over alle de IR frekvenser indsamlet i billedet (typisk af en spektral område fra 900 til 4.000 cm -1). Klikke på de frekvenser, der svarer til specifikke biomolekyler at observere et billede af vævet ved den valgte frekvens.
    1. For eksempel skal du klikke på 1.650 cm -1 band at observere fordelingen af proteiner i prøven. Alternativt kan du klikke på 1.080 cm -1 band at observere fordelingen af nukleinsyrer i prøven. Brug bølgetal 1.650 cm -1.
  6. Oprette flere billeder ved at beregne spektrale tophøjde nøgletal, toparealforhold mv, der vil give mulighed for visualisering af forskellige biomolekylære komponenter. Klik på "Spectral Funktioner 'og vælg derefter enten" tophøjde Nøgletal "eller" Beregn billedområde'at skabe billeder.
  7. Scan den tilsvarende tilstødende væv sektion, som er plettet med en separat hel dias imager, der indfanger lysfelt billeder. Sideløbende med IR billedet, opdrage det digitale billede af de farvede væv med et synligt billede program.
  8. Højreklik på billedet ved et område af interesse og vælg 'Z-profil ". Dette vil give den spektrale information ved den valgte pixel.
  9. Kig på IR-spektre af flere pixels fra flere klasser, såsom sammenligning celletyper, sygdomstilstande. Mark specifikke pixels på billedet ved hjælp af værktøjet "regioner af interesse (ROI). For at udføre denne, skal du højreklikke på billedet og vælg 'værktøj ROI «. Opret klasser, der skal mærkes, for eksempel normal, dysplasi, og kræft klasser. Vælg derefter, »type ROI '-' point '. Vælg derefter klassen til at vælge pixel til og trække på de relevante pixels på IR billedet. Udlede den gennemsnitlige spektre feller hver af klasserne via den gennemsnitlige ROI "værktøj.
  10. Sammenlign afledt spektre ved at plotte i graftegning software.

Representative Results

FT-IR imaging tillader afledning af IR-billeder af væv, der kan give forskellige kontraster afhængigt IR frekvens af interesse. Derudover i en IR billede, hver pixel består af hele IR-spektrum, med forskellige toppe svarende til forskellige biomolekyler, som kan give oplysninger om de biokemiske egenskaber af celletyper eller sygdomstilstande (figur 1). Her har vi vist hvordan man kan sammenligne spektrale signaturer mellem klasser, men mere avancerede automatiske klassifikation er mulig ved brug af yderligere algoritmer 3,43-50, såsom Bayesian klassificering, Random Skove, kunstige neurale netværk, og hierarkisk Cluster analyse kan udføres på data. Overvåget klassifikation tilgange vil give mulighed for opførelse af en klassificeringen der kan trænes til at give mulighed for automatisk anerkendelse af celletyper eller sygdomstilstande. Uovervågede klassifikation metoder kan bruges til at lede efter naturligt forekommende difskelle i væv eller celler på grund af biokemisk varians.

FT-IR instrumentering har udviklet sig i de seneste årtier, fra måling i et enkelt punkt / kortlægning tilstand ved hjælp IR uigennemsigtige åbninger til billedbehandlingstype hjælp Cassegrain mål, ved hjælp af enten en lysende mål kombineret med en opsamling mål i transmission-mode eller et enkelt mål at både lyser og indsamler i refleksion tilstand (figur 2). Det blev for nylig vist, at indsamling af målsætningen i transmissionsmode kunne skiftes ud for en større forstørrelse og objektiv numerisk åbning for at muliggøre diffraktion begrænset IR billedbehandling, der fører til betydelige stigninger i den rumlige opløsning af indsamlede IR-billeder 4,5. De fremskridt i den rumlige opløsning for væv billeddannelse har været af afgørende betydning, da vi nu kan identificere celletyper og vævsstrukturer, for eksempel de funktionelle enheder i nyren, glomeruli, ved hjælp af tilpasset i husetFT-IR-systemer (figur 3).

High-definition FT-IR-billeddannelse giver mulighed for detaljerede billeder af væv, der skal undersøges for at identificere unormale regioner og identificere biokemiske forskelle mellem forskellige celletyper. I en levervæv kerne, er det muligt at visualisere hepatocytter og regioner infiltrerende fibrose, der skiller to forskellige områder af dysplasi og ikke-dysplastiske cirrose (figur 4). Vi arbejder på at udnytte dette til at gøre automatiserede diagnostiske værktøjer til brug i vanskelige tilfælde af leversygdom.

Vigtigt er det, kan den øgede rumlige opløsning nu tillade os at isolere specifikke strukturelle træk, der kan være kemisk modificeret ved sygdom før histologiske ændringer er tydelige. For eksempel er vi fokuseret på at identificere biokemiske forandringer i nyrerne glomerulære strukturer såsom Bowmans kapsel, mesangium, glomerulære basalmembran og rørformede basalmembran, før ændringer identificeret af patologen kan observeres (figur 5). Især er vi interesserede i at identificere ændringer i forbindelse med udviklingen af ​​diabetisk nefropati og kronisk afstødning hos transplantationspatienter, hvor de nuværende teknikker undlader at identificere ændringer i en tidlig nok mode for en vellykket intervention.

Figur 1
Figur 1. FT-IR-billeder og spektret fra en lever kerne. Billede af (A) H & E farvet kerne fra leverbiopsi og billeder af IR-absorbans af seriel sektion af den samme kerne ved (B) 3.286 cm -1 og (C) 2.603 cm-1, som fremhævede forskellige strukturelle træk. (D) Typisk IR-spektrum af væv, med vigtige toppe mærket. Scale bar = 100 um.fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Optik skematiske beskriver FT-IR mikroskop driftstilstande. (A) i transmissionsform prøven belyses gennem bunden mål, og det lys, der passerer gennem prøven opsamles ved den øverste mål. (B) I refleksion tilstand den øverste målsætning tjener både til at belyse prøven og til at indsamle det reflekterede lys. Den nederste mål anvendes ikke. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Sammenligning af different mikroskop mål på FT-IR-billeder af en nyre glomerulus på 2925 cm -1. (A) 15X indsamle objektive med NA = 0,5 (5,5 x 5,5 um pixel størrelse). (B) 36X indsamle mål med NA = 0,5 (2,2 x 2,2 um pixelstørrelse). (C) 74X indsamle mål med NA = 0,65 (1,1 x 1,1 um pixelstørrelse). Scale bar = 50 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Spektrale forskelle mellem fibrose og hepatocytter i en lever kerne. (A) H & E stained kerne fra leverbiopsi. (B) Billede af en seriel sektion kerne scannet i FT-IR (36X objektiv opsætning). (C) Reptant spektre af hepatocytter og fibrose, taget fra regioner af væv, der er angivet med pile i (A) og (B). Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Differentiering af nyre væv biopsi funktioner ved hjælp af high-definition FT-IR-billeddannelse. (A) Periodiske syre-Schiff farvet sektion med de funktioner, der skal udvindes mærkes. (B) HD-FT-IR billede af CH2 asymmetrisk strækning region (36X objektiv setup) af en seriel sektion af det samme væv. (C) Funktioner mærket i (A), der udvindes ved hjælp af FT-IR billede i (B) for at være i stand til kemisk differentiate de fire elementer i vævet. Scale bar = 50 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

FT-IR er en ny modalitet til label-fri biokemisk billeddannelse af vævssnit, med potentiale til at spille en vigtig rolle i at forbedre den nuværende standard for diagnosen i patologi. Den nuværende gold standard for patologi kræver væv, der skal biopsi, fikseret i formalin, indlejret i paraffin, snittet flere gange og farvet med flere pletter. En højt uddannet patolog skal subjektivt visuelt vurdere vævsstruktur og cellemorfologi for at bestemme en diagnose. Her viser vi, hvordan at indsamle højopløselige IR-billeder fra den samme type af sektioner og diskutere nogle af de beregningsmæssige metoder til at undersøge kemiske forskelle mellem celletyper og sygdomstilstande.

De kritiske trin i denne protokol er at sikre, at vævet er meget omhyggeligt fokuseret og at systemet er kalibreret til at sikre høj kvalitet spektroskopiske data. Den når indførelsen af ​​systemet pleje er særlig criti cal når der arbejdes med høj forstørrelse mål. For at hjælpe i fejlfinding, følgende liste omfatter nogle af de potentielle vanskeligheder;

Problem: Lav IR intensitet, når billeddannelse i refleksion. Løsning: Kontroller IR slide retning som reflekterende belægning kan være på den forkerte side af slæden.

Problem: Lav signal / Rød advarselsskilt i Lancer Control. Løsning: Cool detektorer med LN2. Flydende nitrogen er påkrævet for FPA detektorer til at fungere og kræver periodisk blive toppede.

Problem: Velocity fejl / bevægelse fejl. Løsning: Reset spektrometer og reducere vibrationer. Vibrationer vil få bevægelige spejl i interferometeret at blive forstyrret.

Problem: Vanddamp spidser i data. Løsning: Forøg udrensning på systemet og beskytte prøve fra luften.

Problem: Ugyldig centerburst. Løsning: Find centerburst igen.

e_content "> Problem:. lav flux forskel i transmission, selv om fokus. Løsning: Juster bund kondensator Dette vil ske som IR lys ikke bliver fokuseret på et punkt på prøven.

I dette papir, har vi fokuseret på, hvordan man kan erhverve høj opløsning IR-billeder af væv ved enten transmission eller transflectance mode. Arten af ​​FT-IR-billeddannelse, er, at der er flere modifikationer, der kan gøres til datafangst, såsom typen af ​​substrat, fiksering teknik, prøvetykkelse, spektral opløsning, interferometer spejl hastighed etc. Virkningen af ​​disse parametre har blevet drøftet i omfattende detaljer nylig 4,5,17,51.

Der er en række ændringer, der kan gøres til billeddannende system herunder billeddannelse i ATR-modus 10,24,26 og bruge nanoskala termiske metoder 52,53 for at tillade høj opløsning IR billeddannelse. Den største begrænsning med høj opløsning IR billeddannelse er at TIssues skal omhyggeligt forberedt og tynd nok til IR til at passere gennem (typisk 4 um tykkelse). Desuden transmission og reflektans FT-IR-billeddannelse kræver prøverne at være tør på grund af absorbansen af ​​IR ved vand. Men FT-IR imaging har betydelige fordele i forhold til andre teknikker, da det kan meget hurtigt billede store områder af væv, mens stammer rig og detaljeret biokemisk information. Andre lignende teknikker, der stammer biokemisk information på en etiket-fri mode omfatter Raman spektroskopi dog overtagelsestidspunktet data er meget langsommere til at erhverve billeder. Ny Raman billedteknik dukker herunder stimuleret Raman spredning (SRS) og sammenhængende Antistokes Raman spredning (CARS); Men de har adgang begrænset spektralområde eller enkelt frekvens billeddannelse.

De fremskridt i hastighed dataopsamling, rumlig opløsning, og tilgængeligheden af ​​beregningsmæssige metoder har været af enorm værdi i at gøre FT-IR imaging en mere realistisk tilgang til oversættelse som ny imaging værktøj i patologi. De seneste fremskridt inden for rumlig opløsning har været særligt vigtigt for væv patologi grundet vigtige celletyper ikke er løses ved anvendelse af traditionelle FT-IR billeddannelse. Den nylige papir af Reddy et al. viste, hvordan at modellere et ideelt system til at opnå den optimale rumlige opløsning af et FT-IR imaging system 5. Nyrevævet eksempel i dette papir viser betydningen af højere rumlige opløsninger for at udtrække biokemisk information fra glomerulære strukturer (figur 3 og figur 5). I fremtiden nye fremskridt inden Quantum Cascade Lasers som meget lyse IR lyskilder 54-57, 3D spektral billeddannelse 58 og gennembrud inden for nanoskala IR teknologier 52,53,59,60 holde spændende nye muligheder for forskning, der kan have enorme konsekvenser i fremtiden af ​​væv billeddannelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cary 600 Series FT-IR system Agilent Multiple configurations  Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR Edmund Optics 66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR Edmund Optics 66-586
MirrIR slide Kevley Technologies CFR For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides International Crystal Laboratories Multiple sizes For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas Multiple gas suppliers Multiple sizes
Hexane Sigma Aldrich Multiple sizes For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen Multiple cryogenic liquid suppliers Multiple sizes
ENVI-IDL software Exelis-Vis Other software packages available
Whole slide Imager Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) To image stained slides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, E. N., et al. Fourier transform spectroscopic imaging using an infrared focal-plane array detector. Anal Chem. 67, (19), 3377-3381 (1995).
  2. Dorling, K. M., Baker, M. J. Rapid FTIR chemical imaging: highlighting FPA detectors. Trends Biotechnol. 31, (8), 437-438 (2013).
  3. Fernandez, D. C., Bhargava, R., Hewitt, S. M., Levin, I. W. Infrared spectroscopic imaging for histopathologic recognition. Nat Biotechnol. 23, (4), 469-474 (2005).
  4. Nasse, M. J., et al. High-resolution Fourier-transform infrared chemical imaging with multiple synchrotron beams. Nat Methods. 8, (5), 413-416 (2011).
  5. Reddy, R. K., Walsh, M. J., Schulmerich, M. V., Carney, P. S., Bhargava, R. High-definition infrared spectroscopic imaging. Appl Spectrosc. 67, (1), 93-105 (2013).
  6. Walsh, M. J., Bhargava, R. Chapter 10; Infrared spectroscopic imaging: an integrative approach to pathology. Nanobiophotonics. McGraw Hill. (2010).
  7. Walsh, M. J., Reddy, R. K., Bhargava, R. Label-Free Biomedical Imaging With Mid-IR Spectroscopy. Ieee J Sel Top Quant. 18, (4), 1502-1513 (2012).
  8. Matthaus, C., et al. Chapter 10: Infrared and Raman microscopy in cell biology. Methods Cell Biol. 89, 275-308 (2008).
  9. Walsh, M. J., et al. IR microspectroscopy: potential applications in cervical cancer screening. Cancer Lett. 246, (1-2), 1-11 (2007).
  10. Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138, (7), 1940-1951 (2013).
  11. Sahu, R. K., Mordechai, S. Spectral signatures of colonic malignancies in the mid-infrared region: from basic research to clinical applicability. Future Oncol. 6, (10), 1653-1667 (2010).
  12. Kendall, C., et al. Vibrational spectroscopy: a clinical tool for cancer diagnostics. Analyst. 134, (6), 1029-1045 (2009).
  13. Steiner, G., Koch, E. Trends in Fourier transform infrared spectroscopic imaging. Anal Bioanal Chem. 394, (3), 671-678 (2009).
  14. Biswas, S., Walsh, M. J., Bhargava, R. Ch. 16. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 475-504 (2014).
  15. Bhargava, R. Infrared Spectroscopic Imaging: The Next Generation. Appl Spectrosc. 66, (10), 1091-1120 (2012).
  16. Malek, K., Wood, B. R., Bambery, K. R. Ch. 15. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics. 14, 419-473 (2014).
  17. Martin, F. L., et al. Distinguishing cell types or populations based on the computational analysis of their infrared spectra. Nat Protoc. 5, (11), 1748-1760 (2010).
  18. Sommer, A. J., Tisinger, L. G., Marcott, C., Story, G. M. Attenuated Total Internal Reflection Infrared Mapping Microspectroscopy Using an Imaging Microscope. Appl Spectrosc. 55, (3), 252-256 (2001).
  19. Glassford, S. E., Byrne, B., Kazarian, S. G. Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochim Biophys Acta. 1834, (12), 2849-2858 (2013).
  20. Andanson, J. M., Chan, K. L., Kazarian, S. G. High-throughput spectroscopic imaging applied to permeation through the skin. Appl Spectrosc. 63, (5), 512-517 (2009).
  21. Kuimova, M. K., Chan, K. L., Kazarian, S. G. Chemical imaging of live cancer cells in the natural aqueous environment. Appl Spectrosc. 63, (2), 164-171 (2009).
  22. Chan, K. L., Kazarian, S. G. Attenuated total reflection-Fourier transform infrared imaging of large areas using inverted prism crystals and combining imaging and mapping. Appl Spectrosc. 62, (10), 1095-1101 (2008).
  23. Gajjar, K., et al. Diagnostic segregation of human brain tumours using Fourier-transform infrared and/or Raman spectroscopy coupled with discriminant analysis. Anal Methods. 5, 89-102 (2012).
  24. Holton, S. E., Walsh, M. J., Bhargava, R. Subcellular localization of early biochemical transformations in cancer-activated fibroblasts using infrared spectroscopic imaging. Analyst. 136, (14), 2953-2958 (2011).
  25. Gulley-Stahl, H. J., Bledsoe, S. B., Evan, A. P., Sommer, A. J. The advantages of an attenuated total internal reflection infrared microspectroscopic imaging approach for kidney biopsy analysis. Appl Spectrosc. 64, (1), 15-22 (2010).
  26. Walsh, M. J., Kajdacsy-Balla, A., Holton, S. E., Bhargava, R. Attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopic imaging for breast histopathology. Vib Spectrosc. 60, 23-28 (1016).
  27. Investigating the Biochemical Progression of Liver Disease Through Fibrosis, Cirrhosis, Dysplasia and Hepatocellular Carcinoma using Fourier Transform Infrared Spectroscopic Imaging. Sreedhar, H., et al. Biomedical Vibrational Spectroscopy VI: Advances in Research and Industry, 89390J (2014).
  28. Reddy, R. K., Bhargava, R. Accurate histopathology from low signal-to-noise ratio spectroscopic imaging data. Analyst. 135, (11), 2818-2825 (2010).
  29. Bassan, P., et al. The inherent problem of transflection-mode infrared spectroscopic microscopy and the ramifications for biomedical single point and imaging applications. Analyst. 138, (1), 144-157 (2013).
  30. Bassan, P., et al. FTIR microscopy of biological cells and tissue: data analysis using resonant Mie scattering (RMieS) EMSC algorithm. Analyst. 137, (6), 1370-1377 (2012).
  31. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering in infrared spectroscopy of biological materials--understanding the 'dispersion artefact'. Analyst. 134, (8), 1586-1593 (2009).
  32. Bassan, P., et al. RMieS-EMSC correction for infrared spectra of biological cells: extension using full Mie theory and GPU computing. J Biophotonics. 3, (8-9), 609-620 (2010).
  33. Bassan, P., et al. Resonant Mie scattering (RMieS) correction of infrared spectra from highly scattering biological samples. Analyst. 135, (2), 268-277 (2010).
  34. Bassan, P., et al. Reflection contributions to the dispersion artefact in FTIR spectra of single biological cells. Analyst. 134, (6), 1171-1175 (2009).
  35. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of mid-infrared absorption microspectroscopy: II. Heterogeneous samples. Anal Chem. 82, (9), 3487-3499 (2010).
  36. Davis, B. J., Carney, P. S., Bhargava, R. Theory of midinfrared absorption microspectroscopy: I. Homogeneous samples. Anal Chem. 82, (9), 3474-3486 (2010).
  37. Kohler, A., et al. Estimating and correcting mie scattering in synchrotron-based microscopic fourier transform infrared spectra by extended multiplicative signal correction. Appl Spectrosc. 62, (3), 259-266 (2008).
  38. Miljkovic, M., Bird, B., Lenau, K., Mazur, A. I., Diem, M. Spectral cytopathology: new aspects of data collection, manipulation and confounding effects. Analyst. 138, (14), 3975-3982 (2013).
  39. Miljkovic, M., Bird, B., Diem, M. Line shape distortion effects in infrared spectroscopy. Analyst. 137, (17), 3954-3964 (2012).
  40. Bird, B., Miljkovic, M., Diem, M. Two step resonant Mie scattering correction of infrared micro-spectral data: human lymph node tissue. J Biophotonics. 3, (8-9), 597-608 (2010).
  41. Mohlenhoff, B., Romeo, M., Diem, M., Wood, B. R. Mie-type scattering and non-Beer-Lambert absorption behavior of human cells in infrared microspectroscopy. Biophys J. 88, (5), 3635-3640 (2005).
  42. Bambery, K. R., Wood, B. R., McNaughton, D. Resonant Mie scattering (RMieS) correction applied to FTIR images of biological tissue samples. Analyst. 137, (1), 126-132 (2012).
  43. Kwak, J. T., Reddy, R., Sinha, S., Bhargava, R. Analysis of variance in spectroscopic imaging data from human tissues. Anal Chem. 84, (2), 1063-1069 (2012).
  44. Trevisan, J., Angelov, P. P., Carmichael, P. L., Scott, A. D., Martin, F. L. Extracting biological information with computational analysis of Fourier-transform infrared (FTIR) biospectroscopy datasets: current practices to future perspectives. Analyst. 137, (14), 3202-3215 (2012).
  45. Trevisan, J., et al. Measuring similarity and improving stability in biomarker identification methods applied to Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. J Biophotonics. 7, (3-4), 254-265 (2014).
  46. Bhargava, R., Fernandez, D. C., Hewitt, S. M., Levin, I. W. High throughput assessment of cells and tissues: Bayesian classification of spectral metrics from infrared vibrational spectroscopic imaging data. Biochim Biophys Acta. 1758, (7), 830-845 (2006).
  47. Menze, B. H., et al. A comparison of random forest and its Gini importance with standard chemometric methods for the feature selection and classification of spectral data. BMC bioinformatics. 10, 213 (2009).
  48. Kelly, J. G., et al. Biospectroscopy to metabolically profile biomolecular structure: a multistage approach linking computational analysis with biomarkers. J Proteome Res. 10, (4), 1437-1448 (2011).
  49. Bird, B., et al. Infrared micro-spectral imaging: distinction of tissue types in axillary lymph node histology. BMC Clin Pathol. 8, 8 (2008).
  50. Baker, M. J., et al. Investigating FTIR based histopathology for the diagnosis of prostate cancer. J Biophotonics. 2, (1-2), 104-113 (2009).
  51. Baker, M. J., et al. Using Fourier transform IR spectroscopy to analyze biological materials. Nat Protoc. 9, (8), 1771-1791 (2014).
  52. Katzenmeyer, A. M., Aksyuk, V., Centrone, A. Nanoscale Infrared Spectroscopy: Improving the Spectral Range of the Photothermal Induced Resonance Technique. Anal Chem. 85, (4), 1972-1979 (2013).
  53. Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Appl Spectrosc. 66, (12), 1365-1384 (2012).
  54. Kole, M. R., Reddy, R. K., Schulmerich, M. V., Gelber, M. K., Bhargava, R. Discrete frequency infrared microspectroscopy and imaging with a tunable quantum cascade laser. Anal Chem. 84, (23), 10366-10372 (2012).
  55. Vrancic, C., et al. Continuous glucose monitoring by means of mid-infrared transmission laser spectroscopy in vitro. Analyst. 136, (6), 1192-1198 (2011).
  56. Mid-infrared microspectroscopic imaging with a quantum cascade laser. Yeh, K., Schulmerich, M., Bhargava, R. Next-Generation Spectroscopic Technologies VI, 8726, 87260E (2013).
  57. Brandstetter, M., Volgger, L., Genner, A., Jungbauer, C., Lendl, B. Direct determination of glucose, lactate and triglycerides in blood serum by a tunable quantum cascade laser-based mid-IR sensor. Appl. Phys. B. 110, (2), 233-239 (2013).
  58. Martin, M. C., et al. 3D spectral imaging with synchrotron Fourier transform infrared spectro-microtomography. Nat Meth. 10, (9), 861-864 (2013).
  59. Kwon, B., et al. Infrared microspectroscopy combined with conventional atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 116, 56-61 (2012).
  60. Marcott, C., et al. Nanoscale infrared (IR) spectroscopy and imaging of structural lipids in human stratum corneum using an atomic force microscope to directly detect absorbed light from a tunable IR laser source. Exp Dermatol. 22, (6), 419-421 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics