Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Immunology and Infection

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Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

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Abstract

Introduction

Le glioblastome (GBM) est la tumeur la plus fréquente primaire maligne au cerveau et est toujours mortelle. La résection chirurgicale couplé à la norme non-spécifique de chimiothérapie et la radiothérapie soins ne parvient pas à éliminer complètement les cellules malignes, résultant en un mauvais pronostic de moins de 15 mois chez les patients atteints de cette maladie une. En revanche, l'immunothérapie offre une approche précise pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, et a donc le potentiel pour servir de plate-forme de traitement très efficace avec un risque réduit de garantie toxicité 2-4. Des lymphocytes T modifiés ex vivo pour exprimer des récepteurs d'antigènes chimériques (RAC) offrent une stratégie polyvalente pour l'immunothérapie des tumeurs. RAC sont produites par fusion de la région variable d'un anticorps extracellulaire avec une ou plusieurs cellules T molécule intracellulaire (s) de signalisation, au lieu d'une pleine longueur complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) -restricted récepteur de cellule T 5. Ce mode d'anticorps-antigène comme reconpermet à des cellules T spécifiques de l'antigène de réactifs reconnaissent et répondent aux antigènes de tumeur en l'absence de CMH et peuvent être adaptés pour un répertoire pratiquement infini d'antigène.

CAR cellules T modifiées contre une variété d'antigènes tumoraux ont montré l'efficacité préclinique et la promesse exceptionnelle dans la clinique 6-9. Plus précisément, dans le cadre de GBM, une variante CAR T plate-forme de ciblage cellulaire de croissance épidermique du récepteur du facteur III (EGFRvIII), une mutation spécifique de la tumeur exprimé sur la surface de la cellule 10, a été représenté à prolonger la survie chez les souris de gliome portant 11. Malgré leur polyvalence, cependant, le bénéfice clinique de la RCA thérapie adoptive n'a pas été pleinement réalisé, en partie grâce à une immunosuppression associé à une tumeur et l'évasion immunitaire 12-16 ainsi que les défis dans l'établissement et le maintien des cellules T spécifiques de l'antigène in vivo. Se appuyant sur la norme de diligence (SOC) avec une immunothérapie peut potentiellement surmonter plusieurs de ces limitations, résultant en une efficacité accrue à la fois dans la mise en préclinique et clinique.

SOC pour la post-résection GBM se compose de témozolomide à haute dose (TMZ), un agent alkylant d'ADN 17, et l'irradiation du cerveau entier (WBI) 1. Ces traitements sont présumés en synergie avec les vaccins tumorales via la régulation positive de la tumeur expression du CMH 18-20 et l'effusion d'antigènes par les cellules tumorales mortes 17,19,21,22. En effet, l'addition de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI conduit à une amélioration efficacité antitumorale de traitements immunitaires dans la mise en préclinique. En outre, comme de nombreux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques non-spécifiques, TMZ est connu pour causer de 25,26 lymphopénie systémique, qui peut être mis à profit comme un moyen de l'hôte conditionné pour les plateformes de thérapie adoptifs 27-29. Lymphodepletion TMZ médiée a été montré pour améliorer la fréquence et la fonction des cellules T spécifiques de l'antigène, ce qui augmente l'efficacité d'un 'adoptiontive plate-forme de traitement contre les tumeurs intracrâniennes 30. Dans le cadre de la thérapie de voitures, lymphodepletion sert de moyen de conditionnement d'hôte à la fois par la réduction du nombre de lymphocytes T suppresseurs endogène 31 et induire la prolifération homéostatique réduite 32 par compétition pour des cytokines 33, améliorant ainsi l'activité antitumorale 11,34. Étant donné la relation synergique entre GBM SOC et d'immunothérapie plates-formes, l'évaluation de nouvelles thérapies adoptifs et les plates-formes de vaccins dans le cadre du SOC est essentiel pour tirer des conclusions significatives concernant l'efficacité.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour la production et l'administration intraveineuse de cellules T spécifiques CAR-EGFRvIII murins aux côtés de TMZ et le WBI chez les souris portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs (voir la figure 1 pour le traitement timeline). Brièvement, les cellules T sont versées CAR ex vivo par transduction rétrovirale. Rein embryonnaire humain (HEK) 293T cellules sont transfectées en utilisant un complexe ADN / lipide (contenant le vecteur de la RCA et plasmides PCL-Eco) pour produire un virus, qui est ensuite utilisé pour la transduction de splénocytes murins activés qui sont récoltées et cultivées en parallèle. Au cours de la génération de la RCA, les hôtes murins portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs sont administrés fractionné l'ensemble du cerveau irradiation aux rayons X et le traitement systémique TMZ à des doses comparables à SOC clinique. cellules T CAR sont ensuite livrés par voie intraveineuse à des hôtes lymphodepleted.

La procédure suivante est décrite dans sept phases distinctes: (1) L'administration de témozolomide à la tumeur portant souris, (2) Le total irradiation de cerveau de souris porteuses de tumeurs, (3) la transfection, (4) La splénectomie et cellules T Préparation, (5 ) transduction, (6) Culture CAR des lymphocytes T et la récolte, et (7) l'administration de cellules T CAR à des souris porteuses de tumeurs. Ces phases se composent de plusieurs étapes qui se étendent sur 6-7 jours et sont exécutés simultanément.

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Protocol

Ce protocole est basé sur un modèle expérimental où 10 souris sont traitées avec 10 cellules T 7 CAR chacun. Cela signifie que 10 8 cellules CAR T seront nécessaires; le rendement devrait être surestimée par 5 x 10 -1 7 x 10 8 pour tenir compte de la perte de la viabilité. Le protocole suivant est mis à l'échelle pour générer environ 200 x 10 6 cellules. Les cellules sont ensuite administrées par voie intraveineuse à la femelle C57BL / 6 de souris avec des tumeurs de 9 jours établis syngéniques de EGFRvIII positif intracrâniennes, développé à partir des lignes existantes de cellules de mélanome de KR158B astrocytome ou B16. Concomitamment avec la RCA génération de lymphocytes T, des souris porteuses de tumeurs sont administrés des doses cliniquement pertinentes de lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) et de WBI (16,5 Gy).

Les souris ont été maintenus et élevés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes à Duke University Medical Center (DUMC). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon des protocoles approuvés par la Duke University Institutional protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Administration de Témozolomide à des souris porteuses de tumeurs

Jours 0 à 4:

  1. Calculer le nombre total de souris à injecter et à multiplier par 0,5 pour déterminer le volume de solution TMZ nécessaire (par exemple, 30 souris x 0,5 ml = 15 ml TMZ) et ajouter 1,5 ml à ce volume pour tenir compte des retombées (16,5 ml TMZ ).
  2. Multipliez ce volume total de 3 mg / ml pour déterminer le poids de lyophilisé TMZ nécessaire (par exemple, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Peser cela dans un 50 ml conique.
    ATTENTION: TMZ est toxique par inhalation, ingestion et contact avec les yeux, la peau et les muqueuses. Consultez travail sécurité de l'institution et / ou la santé de l'environnement et le département de bien-être pour les recommandations sur la réduction des risques d'exposition.
  3. Multipliez le volume total de 0,15 pour déterminer le volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) nécessaire (par exemple, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtre stériliser ce volume de DMSO (plus un supplément de 2 ml pour tenir compte des retombées) à travers un filtre de 0,2 um dans un tube stérile. Ajouter 2,475 ml de DMSO stérile pour la poudre TMZ.
  4. Placer la solution TMZ / DMSO dans un bécher d'eau sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10-15 min. Une fois TMZ est entièrement dissous, la solution devrait devenir de couleur jaune pâle; si la solution devient rose, le TMZ est dégradée, et une nouvelle solution devrait être préparée par un nouveau lot de TMZ.
  5. Calculez le volume approprié de solution saline stérile nécessaire en multipliant par 0,85 le volume total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solution saline). Ajouter 15 ml de solution saline stérile à 50 ml d'une conique. Bien que le TMZ est dissout dans le DMSO, la chaleur du sérum physiologique à 65 ° C.
  6. Vortexer la solution / DMSO TMZ faire en sorte que la poudre soit complètement dissoute TMZ et ajouter lentement une solution saline chauffée à la solution / DMSO TMZ.
  7. Immédiatement après la préparation, charger entièrement 15 x 1 ml Seringue tuberculinees avec une solution TMZ pour l'administration à des souris porteuses de tumeurs établies de quatre jours.
  8. Répétez cette procédure sur les jours 1 à 4 pour un total de cinq administrations TMZ.

2. Cerveau Global irradiation des souris porteuses de tumeurs

Jours 2 à 4:

  1. Allumez l'irradiateur à rayons X et le laisser se réchauffer-à pleine tension. Assurez-vous que le filtre approprié est en place et entrée la tension appropriée et les paramètres actuels (figure 2A).
    NOTE: La dosimétrie de l'irradiateur sera établie au préalable pour déterminer les paramètres de tension et la disposition de grille (figure 2A, B) approprié.
  2. Calculer la longueur de temps qui est nécessaire pour aboutir à 5,5 Gy d'irradiation aux rayons X. Par exemple, si les rayons X sont livrés à un taux de 2 Gy / min, puis 2,75 min est nécessaire pour livrer un total de 5,5 Gy. Saisissez le durée appropriée.
    NOTE: Le tableau 2 présente la souris WBI doses And leurs équivalents cliniques chez l'homme. Dans le contexte de gliomes de haut grade, 60 Gy fractionnée WBI (deux fractions Gy, 5 jours / semaine pendant 6 semaines) est la norme clinique des soins, et l'équivalent murin utilisé ici est de 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Préparer une solution fraîche de la kétamine / xylazine pour l'anesthésie systémique par addition de 2 ml de kétamine et de xylazine 1 ml à 17 ml de sérum physiologique telle que la solution finale est de 10 mg / ml de kétamine et 1 mg / ml de xylazine.
  4. Peser et administrer des souris 10 ul de la kétamine / xylazine par voie intraperitoneale par gramme de poids corporel, tels que les animaux reçoivent une dose de kétamine à 100 mg / kg et 10 mg / kg de xylazine. Souris devrait être pleinement sous sédation et respiration visiblement moins de 2 minutes de la kétamine administration / xylazine.
  5. Pour maintenir l'humidité ophtalmique chez les animaux sous sédation, frottez doucement une petite quantité de larmes artificielles onguent sur chaque œil.
  6. Placer sous sédation souris sur la grille de telle sorte que les têtes sont positionnées dans la zone qui reçoit la plus élevée des rayons X enintensité (figure 2B, C). corps de blindage de la nuque vers le bas avec la taille appropriée tuyau de plomb de bloquer la livraison systémique rayons X (figure 2D).
  7. Passer souris positionné sous le faisceau de rayons X de telle sorte que le laser désignant le point focal du faisceau de rayons X est à la coordonnée (0,0) sur la configuration de la grille. Commencez livraison X-ray.
  8. Lorsque la livraison de rayons X est terminée, retirez les animaux de l'irradiateur et les placer sur un coussin chauffant chaud. Ne pas abriter des animaux sous sédation avec des animaux conscients que les animaux ont repris conscience suffisante pour maintenir couchée sternale. Une fois que les animaux peuvent maintenir couchée sternale, placer des animaux conscients de retour dans leurs cages appropriées.
  9. Répéter ce procédé aux jours 3 et 4 pour un total de trois doses fractionnées de rayonnement.

3. transfection

Jour -1:

  1. Préparer médias D10 en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 ml de M par Dulbeccoodified milieu Eagle (DMEM).
  2. Préparer T milieux cellulaires (TCM) en ajoutant 5,5 ml de L-glutamine, 5,5 ml de pyruvate de sodium, 5,5 ml d'acides aminés non essentiels, et 5,5 ml de pénicilline / streptomycine (pen / strep) à 500 ml de milieu RPMI-1640. Ensuite, ajouter 550 pi de 2-mercaptoéthanol et 550 ul de gentamicine. Enfin, ajoutez 50 ml de FBS.
  3. Récolte in vitro des cellules HEK293T cultivés dans et amener à une concentration de 7,5 x 10 6 cellules / ml dans les médias de D10.
  4. Plaque de support 10 ml de D10 et ajouter 1 ml de suspension de cellules HEK293T dans chacun des 16 x 10 cm de poly-D-lysine (PDL) des plaques revêtues.
  5. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.

Jour 0:

  1. Remplacez le support avec 10 ml D10 frais au moins 30 min avant la transfection de cellules.
  2. Déterminer la quantité de vecteur plasmidique, PCL-Eco vecteur et réactif de transfection liposomale nécessaire pour la transfection en multipliant le nombre total de plaques + 1 (16 + 1 = 17) de 14,1 ugvecteur plasmidique (14,1 x 17 = 239,7 ug), 9,9 ug PCL-Eco vecteur (9,9 x 17 = 168,3 ug), et 60 pi de réactif de transfection liposomale (60 x 17 = 1020 pi). Tous les réactifs doivent être à température ambiante avant de préparer les solutions.
  3. Étiqueter deux tubes A et B. Dans le tube A, ajouter 239,7 ug vecteur plasmidique et 168,3 ug PCL-Eco vecteur (1,5 x 17) ML-sérique réduite du milieu de Eagle (RS-MEM) modifié. Dans le tube B, ajouter 1 020 pi de réactif de transfection liposomale à (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Incuber A et B séparément pendant 5 min à température ambiante.
  5. Mélanger A et B ensemble doucement (vortex pendant 1-2 sec ou inverser plusieurs fois) et incuber pendant 20 min à température ambiante pour former lipide / le complexe d'ADN.
  6. Ajouter goutte complexe lipide / ADN sage de cellules HEK293T en boîte de 10 cm.
  7. Incuber à 37 ° C pendant 6-8 heures ou toute la nuit (ne pas dépasser 24 heures).
  8. Après 6-8 heures d'incubation, remplacez milieu avec 12 ml de TCM frais pour la production virale. Ce support plaquésera utilisé lors de la Journée 2 comme surnageant viral T transduction cellulaire.

4. La splénectomie et T Préparation des cellules

Jour 0:

  1. Verser 10 ml de TCM dans un conique de 50 ml et placer sur la glace pour la collecte de la rate.
  2. Sacrifiez le nombre approprié d'animaux par asphyxie au CO2 et la décapitation secondaire: La place des animaux dans une cage recevoir CO 2 à un débit de 10 à 30% du volume cage / minute, par directives de l'American Veterinary Medical Association (pas plus de cinq animaux peuvent être sacrifiée simultanément) jusqu'à ce que se termine de la respiration et pendant deux minutes par la suite. Retirer les animaux de la chambre de CO 2 et de décapiter.
    REMARQUE: Une rate d'un vieux 6-12 semaines féminine souris C57BL / 6 donnera environ 4,5 à 5 x 10 7 splénocytes. Ici, quatre rates seront récoltées pour environ 200 x 10 6 cellules.
  3. Placez la souris de sorte que son côté droit vers le haut, etvaporiser avec 70% d'éthanol. Avec la pince, saisir une mince pli de la peau en dessous de la cage thoracique gauche et couper une légère incision avec des ciseaux. Peler la peau, prenez soin d'une mince repli du péritoine avec une pince, et couper une petite cavité.
  4. La rate est un petit organe allongé rouge, et sombre qui ressemble à un haricot aplati; délicatement saisir la rate avec la pince et de l'accise en coupant le tissu conjonctif environnant. Placez les rates excisées dans le conique contenant 10 ml de TCM sur la glace.
  5. Verser rates sur une maille de tamis de 70 pm et ventiler par brassage avec l'extrémité émoussée de l'intérieur d'une seringue de 5 ml pour générer une suspension à cellule unique. Un maximum de deux rates devraient être ventilées par passoire.
  6. Utilisez un petit volume de TCM à laver soigneusement la crépine suivante désagrégation de recueillir des splénocytes restants. Piscine toute rates ventilées en une suspension à cellule unique. Apportez volume final à 50 ml avec MTC pour un lavage d'uneD tourner à 300 g pendant 10 min.
  7. Préparer une solution de tampon de lyse par addition de 1 x 5 ml de tampon de lyse 10X et 45 ml d'eau stérile. Pour éliminer les globules rouges, remettre le culot dans 5 ml de 1x tampon de lyse par rate dans un 50 ml conique, bien mélanger en pipetant doucement monter et descendre. Si plus de 5 rates, utiliser un tube de centrifugeuse de 250 ml. Passer conique ou tube de centrifugeuse dans un bain d'eau à 37 ° pendant 5 min.
  8. Retirer la réaction de lyse à partir du bain d'eau et ajouter TCM à un rapport 1: 1 avec du tampon de lyse pour neutraliser la réaction. Laver par centrifugation à 300 g pendant 10 min.
  9. Aspirer surnageant et le culot entièrement remettre en suspension dans TCM (2 ml / rate, 8 ml au total pour 4 rates) par aspiration et refoulement.
  10. Compter les cellules en ajoutant 10 ul de suspension de cellules à 190 pi de bleu trypan (1:20 de dilution). Multiplier le nombre obtenu en l'un des quatre points de grille de carrés de 20 x 10 x 4 volume total (8 ml) pour obtenir le nombre total de cellules (par exemple, des cellules 125 x 20 x 10 4 6 splénocytes).
  11. Diluer les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml dans du TCM, supplémenté avec 2 pg / ml de concanavaline A (ConA) et 50 UI / ml recombinant interleukine-2 humaine (rhIL-2). Ainsi, pour 200 x 10 6 splénocytes, ajouter 92 ml médias à 8 ml de cellules, 200 ug ConA, et 5000 UI rhIL-2.
  12. Ajouter 2 ml de cellules dans chaque puits de plaques de culture tissulaire à 24 puits traitées, de telle sorte que 4 x 10 6 cellules sont dans chaque puits (par exemple, 100 ml de cellules, il faudra environ 4 plaques).
  13. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2.

5. transduction

Jour 1:

  1. Calculer le nombre de culture non-tissu traité plaques à 24 puits nécessaires pour la transduction en multipliant le nombre de rates récoltées par deux (8 plaques sont nécessaires pour quatre rates).
  2. Ensuite, on calcule le volume requis de fragment de fibronectine humaine recombinante (RHFF) solutionnécessaire pour plaques de revêtement en multipliant (nombre total de puits + 3) x 0,5 ml (8 x 24 puits des plaques = 192 = 195 + 3) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Préparer 97,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant RHFF à une concentration de 25 ug / ml en multipliant le volume total de 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 pg). Ajouter cette quantité de RHFF à 97,5 ml de PBS.
  4. Culture non traitée tissu Coat plaques à 24 puits par addition de 0,5 ml de solution PBS / RHFF par puits.
  5. Incuber pendant une nuit à 4 ° C.

Jour 2:

  1. Dump solution PBS / RHFF culture de tissu non traitée plaques à 24 puits.
  2. Ajouter 1 ml / puits de sérum albumine bovine à 2% (BSA) dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  3. Retirer BSA par bouleversant fermement plaque. Lavez en ajoutant 2 ml de PBS.
  4. Recueillir surnageant viral par le transfert de médias de chaque plaque PDL HEK293T dans un tube de 250 ml de centrifugeuse et tourner 10 min à 500 x g.
  5. Soigneusement transférer su viralepernatant dans un 250 ml nouveau tube de centrifugation, en étant sûr de ne pas perturber le culot cellulaire qui se est formée.
  6. Ajouter TCM frais au surnageant viral de telle sorte que le volume final est de 3 ml de plus que la quantité nécessaire pour les puits revêtus de RHFF. Par exemple, pour 192 puits revêtues RHFF, porter le volume de surnageant viral pour 192 ml + 3 = 195 ml.
  7. Retirer splénocytes en culture de l'incubateur et remettre en suspension en pipetant doucement monter et descendre 2-3 fois dans chaque puits. Transférer dans un 250 ml conique. Si vous utilisez une pipette multicanaux, en utilisant un réservoir stérile avant de transférer va aider à accélérer cette étape. Compter comme décrit précédemment et de spin à 300 g pendant 10 min.
  8. Ajouter rhIL-2 à surnageant viral à une concentration de 50 UI / ml. Par exemple, ajouter 50 x 195 = 9750 UI rhIL-2 à 195 ml de surnageant viral.
  9. Reprendre splénocytes en surnageant viral à 1 x 10 6 cellules / ml
  10. Ajouter 1 ml / puits de la suspension de splénocytes RHFF revêtues de plaques à 24 puits.
  11. Spin pendant 90 min selon les paramètres suivants: 770 x g, l'accélération = 4, freinage / décélération = 0, 32 ° C.
  12. Préparer une solution de TCM avec 50 UI / ml de rhIL-2. Par exemple, préparer une solution en ajoutant 200 MTC 10000 UI rhIL-2. Ajouter 1 ml de rhIL-2 / TCM de chaque puits après centrifugation.
  13. Culture pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO2.

6. RCA cellules T Culture et récolte

Jours 3 et 4:

  1. Si les cellules T atteindre> 80% de confluence, les cellules peuvent être divisés (cela se produit généralement après 3 jours ou 4 jours). Pour diviser les cellules, pipeter doucement monter et descendre dans chaque puits 2-3 fois, et passer de 1 ml de chaque puits dans de nouveaux puits d'une 24 puits de culture tissulaire nouvelle plaque traitée. Ensuite, ajoutez 1 ml de TCM frais avec 50 UI / ml d'IL-2 à chaque puits de telle sorte que le volume final est de 2 ml dans tous les puits.
  2. Si les cellules ne parviennent pas à> 80% de confluence, effectuez un changement moitié de médias par pipetage lentement 1 ml de milieu du haut de chaque puits. Évitez disturbing cellules installées sur le fond tout en enlevant les médias. Ajouter 1 ml de TCM frais contenant 50 UI / ml rhIL-2.

Jour 5:

  1. Resuspendre les cellules T CAR par pipetage doucement monter et descendre trois fois dans chaque puits et transférer dans un tube de centrifugeuse de 250 ml. Spin cellules à 300 g pendant 10 min.
  2. Aspirer le surnageant sans déranger culot. Laver une fois avec du PBS, compter les cellules comme décrit précédemment, et laver avec du PBS une seconde fois. Un rendement typique CAR de cellules T est d'environ 1 x 10 6 cellules par puits (8 plaques de cellules x 24 puits = 192 x 10 6 CAR T).
  3. Resuspendre les cellules dans du PBS à une concentration de 5 x 10 7 / ml pour une injection de 1 x 10 7 dans un volume de 200 pg (par exemple, de 192 x 10 6 cellules CAR T, remettre en suspension lavé le culot dans 3,84 ml de PBS).

7. CAR T administration de cellules à des souris porteuses de tumeurs

Jour 5:

  1. Transport cellules sur la glace à l'animalerie pour l'injection intraveineuse. Charge 500-1000 ul dans l'insuline seringue avec 27-31 aiguille G, assurant que toutes les bulles sont expulsés.
  2. Prenez une souris à la base de la queue et placer dans un limiteur de tube.
  3. Tirez la queue tendue avec la veine vers le haut, et glisser l'aiguille d'environ 1-2 mm sous la peau dans la veine en l'insérant parallèle à la veine de la queue. Lentement expulser 200 pi dans la veine. Si l'aiguille est correctement inséré dans la veine, le volume facilement circuler dans; sinon il y aura résistance et l'aiguille devra être retiré de la queue et ré-inséré correctement.

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Representative Results

cellules T CAR sont générés par transduction avec le vecteur rétroviral EGFRvIII CAR 11. Ce vecteur, MSGV1, a été développé à partir du vecteur SFGtcLuc_ITE4 35, qui contient le virus de cellules souches murines (MSCV) longs Les répétitions terminales, la région de gag et enveloppe site d'épissage prolongée (donneur d'épissage, sd, et accepteur d'épissage, SA), et virale signal d'emballage (ψ). Le CAR EGFRvIII contenant la chaîne unique fragment humaine anti-EGFRvIII variable (scFv) 139, en tandem avec CD8TM murin, régions intracellulaires CD28, 4-1BB et CD3ζ, a été cloné dans le vecteur rétroviral en aval du site Ncol (Figure 3) .

Après transduction, les cellules T CAR peuvent être quantifiés et phénotypées par cytométrie de flux. Cellules EGFRvIII CAR T peuvent être visualisées avec un panneau 2 couleurs composée d'une streptavidine-phycoérythrine (SA / PE) conjugué à biotynlated multimère EGFRvIII dérivés et anti-CD3 FITC. Utilisation de la culture et de transduction protocols décrits ici, nous observons systématiquement l'expression de la RCA entre 55-70% de splénocytes murins (figure 4A) 11. Alternativement, les voitures peuvent aussi être colorées pour l'expression en utilisant F chèvre anti-humaine (ab ') Anticorps secondaires 2-biotine primaire et SA / PE qui a été décrite précédemment 36. CAR cellules T peuvent être encore phénotypées par l'ajout d'autres anticorps marqués par fluorescence sur le panneau de la RCA à deux couleurs. Par exemple, coloration pour CD8 et CD4 montre que 70% des voitures sont transduites cellules T CD8 +, tandis que 20% sont des cellules T CD4 + (figure 4B). CAR cellules T avec ce profil d'expression ont été montré pour facilement le trafic vers le cerveau et le traitement des tumeurs intracrâniennes.

Tableau 1:. Temozolomide dose en fonction du poids de l'animal doses témozolomide ont été calculés selon une dose totale de 60 mg / kg.

Le poids corporel Volume
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
# fractions LIT SOC
16,5 5.5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52,5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tableau 2:. Doses de rayonnement biologiquement équivalents cliniquement significatives doses de rayonnement ont été calculées selon BED = D [1+ d / (α / β)],D = dose totale, la dose d = fractionnée, et α / β = 2). La dose totale administrée que WBI à l'hôte murin est représentée en termes de ee doses fractionnées livrés et la dose humaine qui est modélisée par ces fractions de dose. Aux fins du modèle, la tumeur maligne dont le lit est norme de soins est également indiquée.

Figure 1
Figure 1:. Chronologie pour le traitement des tumeurs des souris porteuses et concurrente ex vivo génération de voiture standard de la chimiothérapie de soins et une irradiation encéphalique totale commence quatre jours après l'implantation de la tumeur (A). Pendant cet intervalle de temps, les cellules T CAR sont générés et cultivées ex vivo (B) et livrés après un cycle complet de l'hôte conditionné.

Figure 2
Figure 2: Mise en page et les paramètres pour la livraison de rayonnement.Les rayons X sont délivrés selon une dosimétrie de 320 kV et 10 mA, avec une durée variable choisie en fonction de la dose désirée (A). Le champ focal du rayonnement X-ray est une étroite 2,5 cm région. Sédation animaux sont agencés selon la grille (B) de telle sorte que leurs têtes se trouvent dans la zone de plus forte intensité de rayons X; (C) représente la vue d'une extrémité du faisceau de rayons X. Environ quatre animaux peuvent être sous la irradiateur pendant une cours de l'administration de rayons X selon cette disposition de la grille (B, D). Tube de plomb est utilisé pour protéger le corps, ne laissant que leurs têtes exposées pour WBI (D).

Figure 3
Figure 3: Le vecteur rétroviral SFGtcLuc_ITE4 modifiée, MSGV1, a été utilisé pour la transduction et la génération de cellules T Le CAR.Insert de CAR EGFRvIII contenant la chaîne unique fragment humain anti-EGFRvIII variable (scFv) 139, en tandem avec CD8TM murin, les régions intracellulaires CD28, 4-1BB, et CD3ζ, est flanqué par le virus de la cellule souche murine (MSCV) de longues répétitions terminales (LTR ). En amont de l'insert de la RCA sont la région gag étendue et site d'épissage de l'enveloppe (donneur d'épissage, sd, et accepteur d'épissage, SA), et le signal d'emballage virale (ψ).

Figure 4
Figure 4: RAC EGFRvIII sont exprimés sur la surface des cellules T 48 heures suivant la transduction, les cellules T ont été colorées pour l'expression de surface de RAC EGFRvIII utilisant un multimère composé de LEEKKGNYVVTDHC-K (biotine) -NH 2 / streptavidine-PE.. Cellules T non transduites d'un même donneur ont été également colorées comme contrôle négatif. Les données montrent le nombre de cellules T (CAR axe des ordonnées) positifs pour staining par le multimère d'EGFRvIII conjugué à PE (axe des x), fermée sur cellules CD3 + en tant que marqueur des cellules T, où l'expression se est révélée être de 60,9% (A). CAR cellules T CD4-colorées pour PerCP-Cy5.5 et CD8-APC montrent un profil d'expression de 21,7% et 70,9%, respectivement (B).

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Discussion

Le calendrier de traitement décrit ici a été conçu pour modéliser norme clinique de soins et de tirer parti de ses effets pour la RCA thérapie adoptive. T doses CAR cellulaires, schémas TMZ, et l'administration de la radiothérapie peuvent être modifiés pour améliorer l'activité in vivo des cellules T, lymphodepletion, et le meurtre de la tumeur. TMZ schémas peuvent être augmentés pour obtenir myéloablation hôte et une expansion accrue des cellules adoptive transférés 30. En outre, les effets de lymphodepletive TMZ peuvent être récapitulées par une faible dose (4-6 Gy) seule fraction totale irradiation corporelle (TBI), contournant ainsi les propriétés tumoricides de SOC. Le schéma de rayonnement appliqué ici imite une dose biologiquement équivalente de 60 Gy; toutefois, le nombre de fractions et les fractions de doses peut être accordé pour simuler d'autres doses cliniques (Tableau 2). Surtout, notre modèle de SOC utilise des doses biologiquement équivalents de WBI, plutôt que la radiothérapie externe livré focalement à la tumeur et margins, comme ce est souvent utilisés dans la clinique, et peuvent ainsi conduire à une moindre dose de rayonnement délivrée à la tumeur et un risque accru de toxicité à cerveau de souris en bonne santé. Malgré ces limites, cependant, WBI est une technique reconnue pour la modélisation de radiothérapie clinique dans un cadre préclinique.

T doses de cellules de voiture peut être augmenté ou diminué d'observer des effets de dose sur le meurtre de la tumeur et la survie globale 11. En outre, le moment du traitement et de la voie de livraison peut être modifiée pour voir des différences d'efficacité. Par exemple, les cellules T CAR peuvent être livrés par voie intracrânienne à garantir une activité au niveau du site de la tumeur. Le rendement des cellules T CAR-positive peut varier en fonction de l'efficacité de transduction. Une façon de garantir une transduction succès est en effectuant une protéine fluorescente (GFP) -contrôle vert pendant toute la procédure. Pour ce faire, une HEK293T 10 cm plaque de PDL peut être attribuée pour la GFP transfection et transduction d'un seul puits de cellules T à éboulisn pour la GFP sur 3-5 jours. Un facteur critique dans l'efficacité de transduction est l'ampleur de l'activation des lymphocytes T et la prolifération par addition de surnageant viral. Nous notons une différence importante entre notre méthode d'activation des cellules T, qui est obtenu par l'addition de ConA au milieu de culture, et de celle utilisée dans le milieu clinique, réalisé par des anticorps monoclonaux agonistes CD3 et CD28. Bien que ce dernier est couramment utilisé pour générer des cellules T CAR patients rétroviraux transduction et a également été couronnée de succès dans la transduction des lymphocytes T murins, nous avons précédemment déterminé que ConA stimulation conduit à de meilleures et plus cohérentes transductions 37. Nous avons également observé que le rendement des cellules T CAR globale peut varier en fonction lorsque l'étape 5.18 est effectuée. Si vous rencontrez un faible rendement CAR lymphocytes T, nous recommandons d'effectuer l'étape 5.18 immédiatement après l'étape 5.17 au lieu d'attendre pour l'incubation de 5-6 heures. Bien que cela puisse influer sur l'efficacité de la transduction, nous ne avons pas observé dif significativeconférences dans l'expression de surface de la RCA dans nos études.

Après transduction, les cellules T CAR peuvent être quantifiés et phénotypées par cytométrie de flux; nous tacher nos cellules EGFRvIII CAR T avec un panneau 2 couleurs composée d'une streptavidine-phycoérythrine (SA / PE) conjugué à biotynlated multimère EGFRvIII dérivés et anti-CD3. Alternativement, les voitures peuvent aussi être colorées pour l'expression en utilisant F chèvre anti-humaine (ab ') Anticorps secondaires 2-biotine primaire et SA / PE qui a été décrite précédemment 36. Nous observons régulièrement l'expression de la RCA entre 55-70% de splénocytes murins 11. Nous avons précédemment montré que la livraison des cellules T avec ce profil d'expression de la RCA peut facilement le trafic vers le cerveau et le traitement des tumeurs. Lymphopénie TMZ- ou TBI-induite améliore expansion clonale de cellules adoptive transférés, l'augmentation de la fréquence des cellules CAR-positifs et leur réponse globale antitumorale. CAR cellules T peuvent être suivis in vivo par coloration sang périphérique avec l'untétramère ppropriate; ce est une technique utile pour comprendre CAR T survie cellulaire au fil du temps et les effets de l'hôte conditionné sur la fonction des cellules T CAR et de la persistance. Alternativement, si aucune tétramère est disponible pour le récepteur de l'antigène, un rapporteur fluorescent peut être inclus dans la construction de vecteur de voiture, ou des cellules CAR T peut être étiqueté ex vivo avec l'ester carboxyfluorescéine succinimidyl (CFSE) avant l'administration pour le suivi in vivo.

Selon le modèle de la tumeur, la plate-forme d'immunothérapie, et SOC régime, SOC clinique administré aux côtés de la thérapie adoptive ou vaccins peut conduire à des toxicités. TMZ est un agent alkylant d'ADN qui conduit à la mort des cellules non spécifique, et intensifié doses peuvent entraîner une perte de poids et de morbidité chez les hôtes murins. À haute dose et fractions prolongées de WBI peuvent entraîner une hydrocéphalie. En outre, les effets inflammatoires de forte vaccin et / ou réponses des lymphocytes T adoptive transférés peuvent entraîner une morbidité due àtempêtes de cytokines toxiques. Il est également important de noter les effets de l'anesthésie systémique sur les animaux morbides. Si TMZ et le WBI conduisent à toxicités importantes, alors la kétamine / xylazine de doses peuvent être diminué de 20 à 25% afin de réduire le risque de mortalité, que les animaux ne doivent être sous sédation et immobilisé pendant 10 min pour la livraison de petites doses de rayonnement (2- 8 Gy).

Host conditionné est essentiel pour toutes les plateformes d'immunothérapie qui incluent le transfert adoptif. Comme les essais d'immunothérapie sont souvent évaluées dans le cadre du SOC, évaluation préclinique des immunothérapies doit être fait dans ce cadre de récapituler le scénario clinique. Nous présentons ici un exemple de tirer parti de la lymphodepletive et les effets tumoricides de SOC avec la thérapie adoptive utilisant des cellules T CAR. Ce schéma est un outil puissant qui peut être appliquée à d'autres plates-formes d'immunothérapie pour évaluer les effets de la SOC combinée.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

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References

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