Évaluation de l'encéphalopathie spongiforme transmissible barrières d'espèces avec une

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Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

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Abstract

Introduction

Encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST, maladies à prions) sont un groupe de maladies neurodégénératives fatales avec des périodes d'incubation prolongées qui touchent une variété d'animaux et les humains. L'agent étiologique présumé des EST est constitué d'un isomère mal repliée de la protéine prion hôte (PrP), qui est capable d'auto-propagation par conversion du modèle mécanique de la forme cellulaire normale de la PrP (PrPc) en un infectieuse, associée aux maladies forme (PrP EST) qui se accumule dans les tissus du système nerveux central de l'hôte infecté 1. Prions de mammifères infectieuses transmettent généralement de l'hôte à hôte d'une manière spécifique à l'espèce, qui a donné naissance au concept de la «TSE espèces barrière» limitant événements de transmission inter-espèces 2. Les déterminants biologiques de la barrière des espèces de prion ne sont pas bien comprises. similarité de séquence d'acides aminés entre la PrP infectieux des EST et l'hôte PrP C cUne influence fortement si la conversion a lieu 3-5, mais reste insuffisante pour expliquer tous les événements de transmission du prion observés in vivo 6,7.

Ainsi, la caractérisation des barrières d'espèces TSE se est largement appuyée sur des études de provocation des animaux: exposer les animaux naïfs d'une espèce donnée aux prions de l'autre et la mesure du temps d'incubation résultant d'apparition de la maladie et le taux d'attaque comme indicateurs de l'efficacité de la transmission. Souris exprimant la PrP C à partir d'espèces hétérologues sont également utilisés pour ce type d'étude 8. Les coûts associés à la production de souris transgéniques et des essais biologiques à prions prolongées, ainsi que des considérations éthiques de l'utilisation des animaux, sont des obstacles à une enquête expérimentale de TSE barrières d'espèces. Évaluation de la barrière d'espèce humaine aux EST se appuie sur des souris modifiées pour exprimer humaine PrP C. Ces souris exigent longues périodes d'incubation de succomber aux EST ou des modifications à T humainsil molécule humaine PrP C pour la maladie rapide apparition 9. La période d'incubation des EST non humain chez ces souris peuvent se étendre au-delà de la durée de vie de souris normale rend l'interprétation des résultats négatifs difficiles. Les primates non humains ont également été utilisés comme procurations pour étudier les barrières d'espèces humaines, mais ces études souffrent avec les mêmes défis que les autres types de l'expérimentation animale et les primates non humains ne peut pas résumer précisément la maladie car elle procède de l'hôte humain.

essais biologiques des animaux restent la méthode «étalon-or» pour mesurer la sensibilité d'une espèce à une EST, mais les obstacles, les coûts et l'éthique de ces études d'animaux vivants ont contraint enquête sur des solutions de rechange. Un certain nombre d'essais in vitro, fondées sur l'évaluation de la conversion de l'hôte PrP C à une protéinase K (PK) de l'Etat, résistante (de PrPres) lorsque ensemencée par PrP TSE, ont été développées et utilisées pour étudier TSE spECIES barrières 10-12. Des exemples de tests in vitro comprennent analyses sans cellules conversion, mauvais repliement des protéines amplification cyclique (PMCA), et le taux de rendement de conversion (CER) de dosage 10-14. Bien qu'aucun de ces tests prennent en compte des facteurs périphériques impliqués dans les barrières d'espèces après l'infection naturelle, tout le monde peut être utile pour identifier les hôtes potentiellement sensibles pour les EST.

Ici, nous présentons le protocole pour l'essai de CER, dans lequel deux substrats dénaturées PrP C dérivés de homogénats de cerveau normales sont utilisées dans paillasse réactions de conversion du prion (figure 1) 13. PrP C dans le substrat dénaturée à pH 7,4 ne peut être converti en PrPres par PrP EST ensemencées dans la réaction en l'absence d'une barrière de 14 espèces. En revanche, la dénaturation de la PrP C dans l'autre substrat à pH 3,5 permet d'être converti en une incubation de PrP suivantavec PrP EST provenant de toute espèce et sert de contrôle pour la conversion. Le rapport de conversion de la PrPc en PrPres à pH 7,4 substrat par rapport à celui du substrat pH 3,5 donne une mesure de la barrière des espèces. Nous avons trouvé que le dosage de CER prédit connu barrières d'espèces de souris de laboratoire à divers EST et ont utilisé le test dans les efforts pour prédire la barrière des espèces de nombreuses espèces de mammifères, y compris le mouflon d'Amérique, à la maladie du dépérissement chronique (MDC) et autres EST 14, 15. Les enquêteurs se intéressent à un outil permettant le dépistage rapide des EST barrières d'espèces ou de l'évaluation de la conversion de PrP C de-PrP trouveront cette méthodologie utile.

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Protocol

travaux animale menée à la National Wildlife Health Center USGS a été réalisée en conformité avec l'Office de lignes directrices NIH Laboratoire bien-être animal et sous protection des animaux et le comité de l'utilisation protocole # EP080716. Tissus d'animaux de chasseurs-récoltés étaient des cadeaux du Wisconsin ou du Michigan ministères des Ressources naturelles.

1. Solution Préparation

REMARQUE: Les solutions énumérées ci-dessous sont nécessaires pour la préparation du substrat de dosage de CER dans la section 2 ci-dessous. Préparer chacune de ces solutions de concentration des solutions d'achat d'actions plus élevés; concentrations recommandées pour les solutions d'achat d'actions seront indiqués entre parenthèses après chaque nom chimique respective énumérés. Préparer toutes les solutions fraîches lors de la préparation du substrat et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.

  1. Pour tampon de lyse, préparer une solution de la suivante dans Tris 10 mM, pH 7,5 (Tris 1 M, pH 7,5 solution stock recommandé): 100 mm schlorure de odium (NaCl, 1 M solution mère), l'acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 solution mère), 0,5% de NP-40 (solution à 10% d'actions), 0,5% de désoxycholate (DOC, 10% solution stock ).
  2. Pour mémoire tampon de conversion, préparer une solution de dodécylsulfate de sodium à 0,05% (SDS, solution à 10% d'actions) et 0,5% de Triton X-100 (10% de solution de stock) dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS, 10, pH 7,4 solution mère).
  3. Pour les solutions chaotropiques, préparer deux solutions 3 M de chlorhydrate de guanidine (GdnHCl, 8 M stock) en 1x PBS (solution 10x de stock). Ajuster le pH de l'une des solutions à 3,5 ± 0,05 avec de l'acide chlorhydrique concentré (HCl). Vérifier que le pH de la deuxième solution se maintient à un pH de 7,4 ± 0,05 et ajuster en utilisant du HCl concentré ou d'hydroxyde de sodium (NaOH), si nécessaire.

2. Préparer Paires CER Assay Substrate

  1. Obtenir le tissu cérébral sain, non-TSE-infecté à partir d'espèces d'intérêt et de préparer un volume poids par 10%(P / v) dans du tampon d'homogénat de lyse en utilisant l'une des méthodes suivantes: Dounce, broyeur à billes, ou homogénéisation mortier et un pilon. Affiner plus loin homogénats résultant en les soumettant à seringue-aiguille et l'homogénéisation à l'aide d'aiguilles de calibre croissant jusqu'à ce que le substrat peut être aspiré et expulsé avec facilité par une aiguille G 27 de la seringue.
    1. Pour les substrats préparés à partir de rongeurs et autres petits mammifères, homogénéiser cerveau (s) ensemble; pour les substrats préparés à partir de grands mammifères, utiliser obex (tronc cérébral) tissus pour préparer homogénats. Lors de la sélection de la quantité d'homogénat de cerveau, la préparation ne dépassant pas 50% de la capacité de la centrifugeuse utilisée pour la précipitation des protéines à l'étape 2.6.
    2. Si la qualité du tissu cérébral acquis est discutable, évaluer les niveaux PrP C par SDS-PAGE 16 et 17 immunoblot avant substrat préparation.
  2. Divisez homogénat de cerveau en deux volumes égaux dans des tubes coniques distincts étiquetés plastique. Ajouter GdnHCl (3 M dans une solution PBS) à pH 3,5, soit 7,4 ou de chaque tube dans un rapport 1: 1 en volume d'homogénat de cerveau.
  3. Vérifiez les valeurs de pH des deux solutions. Ajuster le pH du substrat pH 3,5 à pH 0,05 ± utilisant du HCl concentré. Se assurer que le pH de l'autre substrat reste à un pH de 7,4 ± 0,05 et ajuster le pH si nécessaire avec de l'HCl ou de NaOH selon les besoins. Évitez dépassement des valeurs de pH par addition judicieuse d'acide ou de base.
  4. Tournez solutions sur un mélangeur à tambour-end à la température ambiante (RT) pendant 5 heures.
  5. Précipiter la protéine en ajoutant quatre volumes de méthanol à la solution de substrat dans chaque tube conique, vortex pour bien mélanger et incuber à 20 ° C pendant 16-18 h.
  6. Les échantillons de sédiments par centrifugation à 13 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Décanter avec soin et jeter le surnageant et laisser se évaporer le methanol à partir des pastilles. Utilisation des applicateurs en coton-tige pour aider à l'absorption du methanol est attachée à l'intérieur du tube. Ne pas permettre à plus de pellets-dry methanol et une fois ne est plus visible, passer à l'étape suivante.
  7. Pastilles de protéines remettre en suspension dans un tampon de conversion. Utilisation d'une quantité de tampon de conversion égal à la quantité de matériau de départ d'homogénat cérébral distribué dans chaque tube à l'étape 2.2.
    NOTE: Il est essentiel que le tampon de conversion utilisé pour remettre en suspension les granulés de protéines à la fois un pH de 3,5 et de préparations de substrat 7,4-traités est la solution définie à l'étape 1.2 ci-dessus (qui contient de faibles niveaux de détergents et un pH physiologique).
  8. Brièvement soniquées solutions de substrat dans un sonicateur à cuphorn (10 sec à ~ 30% puissance maximale), portion dans 0,5 à 1,0 ml par étiquetés 1,5 ml microtubes. Effectuer un immunoblot de contrôle de qualité (étape 2.9) sur une partie aliquote de chaque substrat. Stocker d'autres aliquotes à -80 ° C jusqu'au moment d'effectuer dosage de CER (section 4).
  9. Effectuer un contrôle de qualité sur les paires de substrat de CER avant de les utiliser (figure 2). Ces étapes se assurer que les substrats de CER seront provide des résultats optimaux dans les études de conversion.
    1. Assurer des quantités comparables de PrP C dans les deux substrats. Comparer les niveaux de PrP en 10-25 ul de chaque substrat par 16 SDS-PAGE et immunotransfert 17. Si les niveaux de protéine dans le pH 7,4 et 3,5 substrats sont dans ~ 10% de l'autre, les paires de substrat sont appropriés pour une utilisation dans des études de CER.
      REMARQUE: Les immunoblots PrP ne devraient pas montrer des preuves de la dégradation importante PrP C. L'immunoréactivité PrP devrait être essentiellement> 20 kDa. Bandes moins de cette masse moléculaire peuvent être produits de dégradation. Modèles baguage devraient être à peu près équivalente entre les paires de substrat.
    2. Comme la PrP C dans les deux substrats devrait être PK sensibles, traiter 10-25 ul de chaque substrat avec PK à une concentration finale de 100 pg / ml et digérer des échantillons à 1000 rpm à 37 ° C pendant 1 heure dans le thermo-agitateur. Évaluer tout signal PrP reste par SDS-PAGE 16 et 17 immunotransfert.Substrats avec PrP res ne sont pas appropriés pour une utilisation dans les études de CER.

3. Préparer agent de l'EST Seeds

  1. Obtenir tissu cérébral TSE-infectés par des espèces d'intérêt et de préparer un 10% (p / v) dans homogénat 1x PBS pH 7,4 en utilisant les méthodes énumérées à l'étape 2.1 ci-dessus.
    NOTE: Semences pourraient également être produits à partir d'autres tissus TSE-infectés en dehors du système nerveux central, cependant, l'efficacité de la conversion de substrats dérivé du cerveau par des graines provenant de tissus périphériques TSE-infectées n'a pas encore été évalué expérimentalement dans la littérature publiée.
  2. Aliquote homogénat (s) en 100 résultant - 300 volumes ul dans 0,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C jusqu'au moment d'effectuer le test de CER.

4. CER Assay

NOTE: Le test de CER implique plus d'une quantité relativement faible de PrP TSE (fourni dans la «semence») d'une espècedans un excès relatif de PrP C (fourni dans le cerveau non infecté "substrat") d'une autre espèce qui a été partiellement dénaturées soit à pH 3,5 ou 7,4. Après une période d'incubation secouant étendu, la conversion du modèle mécanique de PrP C par PrP EST dans chaque réaction est évaluée par le signal densitométrique de la PrP res restant après digestion avec PK et la détection de immunoblot. La comparaison des niveaux de PrPres dans les substrats précédemment dénaturés à un pH de 3,5 par rapport à 7,4 donne une mesure de la barrière des espèces. Une vue d'ensemble expérimental de cette procédure de test est fourni à la figure 1.

  1. Décongeler lentement non infectées paires de substrat de CER (dosage nécessite des volumes égaux de substrats préalablement dénaturé à la fois à 3,5 pH et 7,4) et des solutions de semences TSE-infectés en les plaçant sur le dessus d'un lit de glace (environ 1 heure de temps de dégel).
  2. Une fois complètement décongelé, aspirer puis expulser chaque solution de substrat à travers une27 G aiguille de la seringue à plusieurs reprises pour re-homogénéiser. Brièvement soniquer chaque solution de semences TSE-infectées pendant 10 secondes à ~ 30% de la puissance maximale. Gardez toutes les solutions sur la glace lors de la préparation des réactions de conversion.
  3. Label 5 tubes individuels faibles contraignantes, à paroi mince PCR par agent de l'EST à l'essai.
  4. Préparer les réactions de conversion dans ces tubes en ajoutant 5 ul de solution de semences infectés par l'EST 10% à 95 ul de (a) substrat CER préparés à pH 7,4 et (b) de substrat CER préparé à pH 3,5.
    1. Pour chaque échantillon expérimental, préparer réactions parallèles en paires de substrat CER préalablement dénaturé à la fois à pH 3,5 et 7,4.
    2. Optimiser ratios de TSE semences d'agent pour substrat de cerveau infecté par la détermination empirique. Semences communes: ratios de substrat employé de maintenir un volume de réaction total de 100 pi et pi comprennent 1:99, 2:98 et 5:95 ul ul. Pour la plupart des applications, la graine 5:95 ul: rapport de volume de substrat est approprié et ce qui est est présenté dans eest le protocole.
  5. Préparer trois échantillons de contrôle par agent de l'EST à l'essai comme suit: (a) ajouter 5 pi de solution de semences TSE-infecté 10% à tampon de conversion de 95 pi de contrôle pour entrée PrPres; ajouter un tampon de conversion de 5 ul à 95 ul de substrat préparé en (b) pH 3,5 et (c) à pH 7,4 en tant que témoins pour la conversion non-basé sur un modèle non spécifique.
  6. Vortex brièvement chaque échantillon dans son tube de PCR fermé de mélanger les semences et le substrat ainsi. Suivi par une impulsion momentanée d'une faible vitesse de paillasse mini-centrifugeuse pour éliminer tout le volume du mélange réactionnel piégé dans le couvercle de tube de PCR.
  7. Charger les échantillons dans des tubes PCR individuellement marqués dans une paillasse thermo-agitateur équipé d'accepter tubes PCR. Secouez échantillons à 1000 rpm à 37 ° C pendant 24 heures.
  8. Suite à agitation, ajouter Sarkosyl à une concentration finale de 2% (p / v) et PK à une concentration finale de 100 ug / ml. Échantillons Digest à 1000 rpm à 37 ° C pendant 1 heure dans le thermo-agitateur.
    NOTE: Ajout de sarkosyl à des échantillons d'aides post-conversion en PK digestion de PrP C. Signaux faux positifs dans des échantillons non ensemencés (étape 4.5) sont pratiquement éliminés par addition de sarkosyl.
  9. Ajouter du tampon d'échantillon SDS-PAGE, les échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 5 minutes et résoudre PrP res restants dans chaque échantillon par SDS-PAGE suivie d'un immunotransfert 16 17.
    REMARQUE: Après addition de tampon d'échantillon et le chauffage, les échantillons peuvent être traités immédiatement ou les échantillons peuvent être stockés à -20 ° C ou -80 ° C avant l'immunotransfert. Toutes les données présentées ici ont été générés en utilisant du gel et des systèmes d'échange Novex NuPAGE. Des échantillons individuels de l'essai de RGC ont été traitées avec un tampon d'échantillon et l'agent réducteur selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été ensuite chauffés à 95 ° C pendant 5 min et 30 ul de chaque échantillon ont été chargés dans un 12% de Bis-Tris gels préfabriqués.
  10. Calculer le rapport de rendement de conversion (CER) comme une mesurede barrière des espèces. Mesurer les niveaux de PrPres par densitométrie 17 et divisent la densité totale de l'échantillon pH 7,4 par celle du pH 3,5 échantillon. Multiplier par 100 pour produire un pourcentage.
  11. Compiler les données de répétitions expérimentales indépendantes pour générer une moyenne ± écart-type CER pour une espèce avec un agent de l'EST donné.

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Representative Results

L'utilisation réussie de l'essai de CER dépend en grande partie la qualité de la paire de substrats utilisés dans les réactions de conversion. Pour cette raison, les procédures pour préparer paires de substrat CER suivant, un immunoblot de contrôle de la qualité doit être effectuée (Figure 2). Pour les deux substrats, un dosage de 10 à 25 ul par immunotransfert. PrP C doit être facilement détectable dans chaque substrat et les niveaux de PrP C doit être approximativement la même entre les deux. Immunoréactivité sera principalement visible au-dessus de 20 kDa, mais petites bandes peut également être évidente. Dans notre expérience, la présence de petites bandes dépend de l'espèce. Si des produits de poids moléculaire inférieur sont observés, leur présence doit être confirmée par les deux paires de substrats.

Il est important de se assurer que les substrats de CER sont exempts de PrPres endogènes par le traitement de substrats avec PK (Figure 2). Si la PrPres est présent, l'animal utilisé pour substpréparation de taux peut avoir été TSE-infectés ou subclinique infectées. En variante, la PrP C dans le substrat peut-être mal repliées dans un état ​​de PK-résistant pendant les procédures de dénaturation ou de précipitation. Indépendamment de la raison, substrat CER contenant la PrPres est pas acceptable pour une utilisation dans le test de conversion.

Des souris de laboratoire sont l'un des animaux les plus fréquemment utilisés dans la recherche TSE expérimentales; en tant que tels, leur sensibilité à la plupart des EST est bien caractérisée 8, en fournissant une référence in vivo contre pour tester la fidélité de l'analyse de CER. La figure 3A présente les résultats de conversion de dosage CER de la PrP C de souris (souche CD1) substrat de PrP res par 1) la souche RML de la tremblante de souris à des passages, un agent adaptés à l'hôte de la souris 18, 2) le mouton domestique tremblante classique, un agent qui peut transmettre à des souris après une longue période d'incubation de 18, et 3) WHIcerfs te de Virginie (Odocoileus virginianus) MDC et la souche 263K de la tremblante de hamster des passages, agents auxquels souris sont peu ou pas sensibles 19,20. Résultant niveaux de PrPres ont été variables dans les substrats de souris dénaturés à pH 7,4 et ensemencées avec les différents agents de l'EST en PrPres a été trouvé dans tous les substrats dénaturé à pH 3,5 et ensemencé avec un agent de l'EST. les taux de conversion de comparaison des niveaux de la PrP dans les pH 7,4 et 3,5 ont été calculés indépendamment des substrats au moins trois fois et les moyennes ± SD sont montrés sur la figure 3B. Pour les réactions ensemencées par RML, les taux de conversion entre pH 7,4 et 3,5 substrats ont été d'environ 100%. Pour ceux ensemencés par la tremblante du mouton, de la conversion dans le substrat à pH 7,4 était d'environ 75% de celle dans le substrat de pH 3,5. CWD ou la conversion induite 263K-du substrat pH 7,4 a été minime. Une analyse unidirectionnelle de la variance ne pouvait pas distinguer une différence dans les ratios de RML et de conversioncrapie ou CWD et 263K, cependant ratios de RML et la tremblante conversion étaient significativement différents de ceux de la MDC et 263K.

Le dosage de la CER peut être adapté pour une utilisation avec les tissus humains ou avec des espèces animales où des essais biologiques sont trop difficile ou non la production éthique et souris transgénique ne est pas souhaitée. Nous avons utilisé cet essai pour caractériser la sensibilité des diverses espèces de la faune à l'encéphalopathie des cervidés. Comme un exemple de l'utilisation de ce test, nous présentons quelques résultats préliminaires sur la figure 4. Brains de lynx des chasseurs pris au piège (Lynx rufus) se sont révélés contenir encore des niveaux détectables de PrP C et produits de dégradation PrP ne sont pas nombreuses, ce qui suggère que ces tissus pourraient être une source acceptable pour le substrat de CER (figure 4A). paires de substrat générés par bobcat cerveau ont montré PrP immunoréactivité d'un poids moléculaire appropriée et ne contiennent pas de PrPres endogènes (figure 4B). Lorsque des paires de substrat bobcat CER générés à partir de deux animaux séparés ont été incubées avec le même cerf de Virginie agent de l'encéphalopathie des cervidés utilisé dans l'essai de CER de la souris décrit dans la figure 3, nous avons trouvé des substrats préparés à pH 7,4 ont des niveaux de PrPres par rapport aux substrats préparés à pH 3,5 (figure 4C), indicative d'une barrière des espèces minimale de bobcat PrP C à la conversion par CWD. Le CER pour la conversion de cerf de Virginie PrP C par le même CWD isolat utilisé pour convertir bobcat PrP C ici, comme un contrôle positif, a été précédemment rapporté que 95,2 ± 18,4% en Morawski et al. (2013) 15.

Figure 1
Figure 1:. Aperçu expérimentale de l'essai de CER Deux supports d'analyse sont préparés en dénaturant partiellement la PrPc non-prion dans le tissu cérébral infecté wième solutions de chaotropiques à pH soit 3,5 ou pH 7,4. Substrats sont ensemencés avec PrP TSE de l'agent prion d'intérêt et échantillons expérimentaux sont soumis à 24 h d'incubation avec agitation pour permettre PrP C à la conversion de la PrP EST à la fois 3,5 et pH 7,4 substrats. Après incubation, la conversion est évalué par SDS-PAGE et immunoblotting. Les densités de signaux sont lus par densitométrie et le CER est calculé par le rapport entre pH 7,4 à pH 3,5 densités de signaux pour chaque échantillon expérimental.

Figure 2
Figure 2: Contrôle de la qualité sur des substrats de CER. (A) avant leur utilisation dans le dosage de la CER, des substrats de souris préparées soit à pH 7,4 ou 3,5 sont analysés par immunoblot en l'absence 1) de traitement PK pour évaluer la PrPc contenu de chaque paire de substrat (niveaux PrP C devrait être équivalent entre pH 7,4 et 3,5 SUBSTRA tes pour une utilisation dans le dosage de CER) et 2) la présence de PK (100 pg / ml) de traitement pour tester préexistante PrPres dans les tissus utilisés pour préparer des substrats (des substrats qui affichent PrPres pré-existants ne sont pas adaptés pour une utilisation dans le dosage de CER). (B) Pour tester pour la formation PrP res non spécifique pendant le test de conversion, souris PrP C substrats préparés soit à pH 7,4 ou 3,5 sont ensemencés avec un tampon de conversion, secoué pendant 24 heures à 1000 tours par minute, 37 ° C et par la suite PK-traitée (100 ug / ml) et testées pour la PrPres par immunotransfert (à droite deux voies). Non secoué, substrats de souris non-traitées représentent PK teneur totale PrP C dans les réactions de dosage (à gauche deux voies). Pour (B), les voies non pertinents ont été coupées pour plus de clarté, mais chaque panneau d'immunotransfert dérive de la même gel, la membrane et l'exposition. Immunoblots dans tous les panneaux utilisés anticorps monoclonal SAF 83.

"> Figure 3
Figure 3:. Dosage de CER utilisant substrat laboratoire de la souris substrat d'essai (A) Souris CER préparé soit à pH 7,4 ou 3,5 a été incubée avec RML tremblante adaptée à la souris, intérieur tremblante du mouton classique, le cerf de Virginie maladie débilitante chronique (MDC) ou 263K souche de tremblante du hamster adapté dans l'essai de CER. Les échantillons de contrôle (portant la mention «néant») contenaient uniquement une quantité égale d'agent infectieux et aucun substrat de la souris. Les échantillons ont été analysés pour la présence de la protéine prion PK-résistant (PrPres) par immunoempreinte avec un anticorps monoclonal SAF 83 premières valeurs densitométriques pour chaque échantillon sont affichées en dessous de chaque voie. (B) graphique à barres indiquant les rapports moyens (± écart type) entre pH 7,4 et 3,5 substrats de souris pour chaque agent infectieux à base d'au moins trois séries d'essais indépendantes. Lettres minuscules se réfèrent à statistiquementsous-ensembles homogènes (analyse de variance avec la méthode de Tukey-Kramer différences de signification minimum; p <0,05). Ce chiffre a été modifié depuis Morawski et al., 2013 15.

Figure 4
Figure 4: Exemple d'utilisation dosage de CER d'enquêter bobcat susceptibilité à CWD Bobcat homogénat de cerveau (A) et le substrat de dosage de CER (B) a été testé par immunotransfert en l'absence et la présence de PK (100 ug / ml) pour évaluer existante PrP C. les niveaux et la présence de la PrPres pré-existants, respectivement. (C) substrats Bobcat ont été ensemencées avec le tampon de conversion et dosé dans le dosage de CER d'évaluer la formation de PrP non spécifique (de gauche deux voies). Non secoué, substrats de lynx roux non-PK traités représentent la teneur totale PrP C dans les réactions de dosage (à droite deux voies).Substrat (D) de Bobcat préparé soit à pH 7,4 ou 3,5 a été incubé avec queue blanche MDC de cerfs en utilisant le test de CER. L'échantillon de contrôle (marqué "none") contenait un montant égal d'agent CWD mais aucun substrat de lynx roux. Des valeurs densitométriques premières pour chaque échantillon sont affichées ci-dessous chaque voie. Des immunotransferts dans tous les panneaux anticorps monoclonal 3F4 utilisée, qui réagit avec la protéine prion félin 21.

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Discussion

Pour la réussite de ce protocole, l'attention devrait être accordée aux niveaux PrP C dans le tissu cérébral infecté utilisé pour la préparation du substrat (étape 2.1.2) et la semence au substrat ratio pour les réactions de conversion (étape 4.4.2). Dans notre expérience, le cerveau peuvent être extraites pour une utilisation comme substrat de CER après un post-mortem de longue période, aussi longtemps que la PrP C est présent par immunoblot (Figure 4). En fait, certains autolyse a été observée dans les cerveaux des lynx roux utilisés pour les études de CER. Néanmoins, l'incubation de substrats issus de ces cerveaux encore abouti à la formation de la PrPres. Nous pensons que, en partie, la robustesse de l'analyse de CER est dérivée de la dénaturation de substrats dans 1,5 M CER GdnHCl qui inactivent plusieurs protéases.

Seed au substrat ratios peut besoin d'être déterminée empiriquement pour obtenir le signal de PrP acceptable par immunoblot. Trop ou trop lPrPres ittle pour effectuer densitométrie, bruit de fond élevé les niveaux de PrPres dans les échantillons de contrôle manquent substrat et des ratios de conversion incompatibles sont autant de raisons pour optimiser semences: ratios de substrat. Variations de maintenir un volume réactionnel total de 100 pi et pi comprennent 1:99, 2:98 et 5:95 ul ul. Dans presque toutes les occasions, nous avons constaté que les semences 5:95 ul: rapport en volume de substrat est optimal. Peu importe ce rapport est utilisé, des quantités égales de agent de l'EST sont utilisés et le dosage est une cohérence interne. Toutefois, la concentration des semences de l'homogénat de cerveau infecté par prion utilisé pour des réactions de modèle affecte probablement le résultat de l'essai de CER en ce que des titres ou des dilutions variables de semences peut entraîner des niveaux de conversion de PrP C -à-PrP variable. Cet effet a été démontré in vitro dans d'autres essais de conversion du prion 22 et peut compliquer la comparaison des différents isolats de prion. Pour résoudre ce dans le dosage de CER, graines could être titré dans chaque substrat PrP C préparé à pH 3,5 et 7,4 pour identifier une gamme de dilutions ce modèle PrP C conversion. Dilutions de semences Idéal éviter de saturer la solution avec prions de semences excédentaires et pourtant donnent un aperçu de la sensibilité de la réaction de conversion. Alternativement, la conversion de PrP C -à-PrP dans les réactions de dosage CER pourrait être mesurée à multiple, timepoints réguliers pendant toute la durée de l'essai et de tracé comme taux de conversion courbes, semblables à des lectures en temps réel la réaction en chaîne de la polymérase ( qPCR) 23 et en temps réel trembler la conversion induite (RT-QuIC) 24 essais. Ces lectures peuvent permettre des interprétations plus complètes de la barrière des espèces et sont un point intéressant du développement futur de cette méthodologie.

Dans le protocole présenté ici, nous utilisons des tubes de liaison faible, à paroi mince PCR, mais nous avons également utilisé standards tubes de 1,5 ml dans un thermo-agitateur équipé pource type de tube. Aucune autre modification du protocole sont nécessaires pour utiliser les tubes de plus grande taille. Dans notre expérience, cependant, nous avons eu la production de plus de PrP et des résultats plus reproductibles dans des tubes de faible liaison PCR, comparativement à 1,5 ml tubes. Alors que des explications pour l'amélioration des performances de l'essai dans des tubes PCR ne sont spéculative à ce moment, en fonction des résultats indiquant que l'interface air-eau est critique pour PrP fibrillisation 25, nous émettons l'hypothèse que les petits tubes fournissent une tension de surface plus optimale de la PrP conversion.

Peut-être la principale limite à l'utilisation de l'essai de CER est à comprendre ce que les taux de conversion représentent en termes de barrières d'espèces déterminants in vivo, comme pénétrance ou la longueur de la période d'incubation maladie. Alors que le moment inconnue, la traduction entre in vitro et dans les facteurs de barrière des espèces vivo devrait devenir plus claire avec l'utilisation continue de l'essai de CER dans les tests suppional EST barrières d'espèces qui ont déjà été établies in vivo et aideront à qualifier les résultats dans les espèces où les données ne sont pas disponibles essais biologiques. Un avantage de l'essai de CER par rapport à PMCA est la présence d'un contrôle interne pour la conversion de la PrP, à savoir le substrat pH 3,5, qui peut être converti par un agent de la TSE. Ce contrôle est de la valeur quand il ne est pas claire, le cas échéant, des agents d'EST devraient provoquer un mauvais repliement de la PrP C d'un hôte exotique. L'incapacité d'un substrat hôte donné pour amplifier un agent de l'EST spécifique dans PMCA pourrait être interprété comme la preuve d'une barrière d'espèce ou pourrait être dû à une défaillance technique. Inconvénients de l'essai de CER par rapport à PMCA comprennent l'amplification de la PrPres, des étapes supplémentaires dans CER préparation du support et aucune infectivité connue dans les PrP res produites par des réactions de CER limités. Il est à noter que dans une étude précédente, cependant, nous avons trouvé le dosage de la CER a abouti à un schéma similaire de la PrPres formation que celle de PMCA 15. Les résultats présentés ici indiquent également que le dosage de CER prédit correctement les barrières d'espèces pour la transmission de différentes EST à des souris de laboratoire (figure 3) et suggèrent que le lynx roux peuvent avoir la sensibilité à l'encéphalopathie des cervidés (Figure 4), en accord avec les rapports que les chats domestiques (Felis catus) peut acquérir la maladie à prion après la provocation de CWD expérimentale 26,27. Des études utilisant le test de CER pourraient compléter les efforts de séquençage PrP pour comprendre la faune susceptibilité à la MDC 28.

Le test permet de CER, à faible coût rapide, l'évaluation fiable de la Bourse de Toronto les barrières d'espèces in vitro. Bien que pas un remplacement complet pour la «norme d'or» de l'expérimentation animale, le dosage de CER peut être utilisé comme une évaluation initiale de l'existence d'une espèce barrière TSE qui peuvent justifier ou éviter d'autres études sur des animaux vivants. Pour cette raison, et parce que l'essai se appuie uniquementsur les tissus du cerveau qui peut être acquis à partir d'animaux non-expérimentales, le CER est en harmonie avec les efforts visant à remplacer, réduire et affiner les procédures expérimentales animales 29. En plus d'évaluer la barrière des espèces, le dosage de la CER peut également fournir une plate-forme simplifiée avec lequel pour étudier les mécanismes de l'événement fondamental définissant la biologie des maladies à prions: la conversion de la normale, fonctionnelle PrP C à une forme mal repliée.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

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