Name: Analizando poblaciones de células sanguíneas de la Drosophila melanogaster Larva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a aislar y cuantificar hemocitos circulantes y residentes de larvas de Drosophila melanogaster mediante sangrado y raspado selectivo. Este protocolo permite estudiar su comportamiento diferencial en inmunidad y desarrollo.

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Agradecemos a Jesper Kronhamn y Dan Hultmark, Michael Galko, y la Bolsa de Centro Bloomington para las poblaciones de la mosca. Un agradecimiento especial a Courtney Onodera de asesoramiento con el análisis estadístico. Damos las gracias a Katrina Oro para la lectura crítica del manuscrito, y Kalpana Makhijani, Katrina Oro, los miembros del laboratorio Derynck, y los miembros del laboratorio Nystul para su discusión y comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de la UCSF Programa para la Investigación Biomédica Breakthrough (pBBR), Broad Center, Fundación Hellman, la Sociedad Americana del Cáncer RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, Institutos Nacionales de Salud y 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (en KB).

1. Hemocyte Bleed / Ensayo Raspe <ol><li> Preparación de diapositivas: <ol><li> Opción 1 para los microscopios de barrido baldosas sin función: Para cada larva a analizar, preparará un portaobjetos de vidrio con cerca de 5 pozos Pap-pluma de 2 mm cuadrados cada una, correspondiente a la zona de visión de campo del microscopio; añadir aproximadamente 5 - 10 l de los medios de comunicación a cada S2 (Figura 1A). Mantenga portaobjetos en cámara húmeda para evitar que los pozos se sequen. </li><li> Opción 2 para microscopios con función de exploración del azulejo: Para cada larva a analizar, preparar una diapositiva de cristal con 3 a 4 pozos Pap-pluma de ~ 3 - 4 mm cuadrados cada uno; añadir aproximadamente 15 - 20 l de los medios de comunicación S2 a cada pocillo (Figura 1B). Mantenga portaobjetos en cámara húmeda para evitar que los pozos se sequen. NOTA: El número de arriba recomendada de pozos es suficiente para los totales de hasta 3.000 hemocitos por larva (finales de larvas 2º, ~ 2,5-3 mm de longitud, transgén etiquetar la mayoría de larval células sanguíneas). Al evaluar el número de células de sangre más grandes, podrían ser necesarios más pozos para evitar el hacinamiento. </li></ol></li><li> Colección de larvas: <ol><li> Aplique agua en un vial que contiene larvas de mosca y larvas a ras en una placa de Petri, o cuchara algo de comida que contiene larvas en una placa Petri y se diluye con agua usando una botella con atomizador. </li><li> Recoger suavemente las larvas de la placa de Petri con un pincel y colocarlos en el agua en un plato de cavidad o en una diapositiva en un bloque frío. NOTA: Las larvas se puede mantener durante un tiempo limitado en el agua o en un bloque de frío; utilizar muestras dentro de 45 minutos o menos para evitar la muerte de las larvas o los efectos no deseados en hemocitos. </li></ol></li><li> Disección: <ol><li> Seleccionar larvas bajo un microscopio de fluorescencia en un bloque de metal frío. Mida tamaños y larvas imagen si lo desea. </li><li> Aislamiento de hemocitos circulantes (&quot;Bleed&quot;): <ol><li> Una vez que se seleccionan las larvas, coloque una larva en el primer Pap-pen así (Figura 1C,2A). </li><li> Utilice 2 agujas limpias o tijeras de disección y pinzas para hacer una incisión en los extremos anterior y posterior de la larva. Para evitar molestar hemocitos residentes, lo mejor es hacer las incisiones en la parte ventral de la larva. Para obtener resultados consistentes, hacer las incisiones en los mismos lugares por cada larva. Por 1ª estadio las larvas, 1 incisión (en el ventral anterior) es suficiente. </li><li> Permita larva a sangrar durante unos segundos y sin ningún tipo de presión o agitación física (Figura 2). NOTA: Si está trabajando en larvas múltiple es mejor hacer estas incisiones para cada uno antes de continuar con el siguiente paso para evitar mantener las larvas en el hielo demasiado tiempo que podría afectar a la integridad de las muestras. </li><li> Levante con cuidado la larva con las agujas o fórceps e introducirlo en el segundo pozo para enjuagar cualquier hemocitos circulantes restantes. Después de eso, siga con el lanzamiento de hemocitos residentes. </li></ol></li><li&gt; El aislamiento de hemocitos residentes (&quot;Raspe&quot;): <ol><li> Transferir suavemente la larva al siguiente pozo (Figura 2C). </li><li> Identificar la glándula de la linfa de la larva, que normalmente se encuentra aproximadamente a un tercio desde el extremo anterior de la larva, y que puede emitir fluorescencia dorsalmente a través de la pared del cuerpo larval. Evite la glándula linfática mientras suelta hemocitos residentes fijando por la larva con una aguja lo más cerca posible a la glándula de la linfa para evitar la punción (Figura 2C). NOTA: Durante el desarrollo normal de la maduración de las glándulas linfáticas hemocitos se retrasa en comparación con hemocitos larvarios, y los reporteros fluorescentes de hemocitos diferenciadas no puede mostrar una señal en la glándula de la linfa de las larvas jóvenes. En estos casos, necesita menos atención a pagar a la glándula linfática como no hay contaminación del diferenciados hemocitos larvales marcados con fluorescencia por hemocitos de las glándulas de la linfa que se espera. </li><li> Suelte glóbulos residentes en un dissectiel proceso de raspado y / o golpeando. Utilice una punta de aguja para fijar de manera efectiva por la larva, cerca de la glándula linfática (ver arriba) u otras áreas del cuerpo como sea necesario. Utilice otra aguja para pinchar en los grupos de hemocitos que son visibles a través de la pared corporal de larvas (Figura 2C, E), con el objetivo de separar los hemocitos. Hemocitos también puede ser liberado en un movimiento de raspado. Sin embargo, rasgando la epidermis temprana puede liberar grandes racimos de células de la sangre, lo que podría hacer el conteo automatizado más difícil. NOTA: Dependiendo de la edad y el genotipo de la larva, el número de hemocitos totales variará. Distribuir el proceso de liberación se ha descrito anteriormente en varios pozos para evitar el hacinamiento de algunos pozos con células de la sangre, lo que podría hacer que el análisis de imágenes de células individuales más difícil. </li><li> Si algunos hemocitos permanecen en la canal final, contar estos hemocitos por observación a través del microscopio y el uso de un contador de conteo manual (Figura 2E). Para facilitar el recuento, pencaje de la carcasa en un área limpia de la misma diapositiva y difundirlo lo más finas posible para reducir el número de planos ópticos. </li><li> Una vez que la disección está completa, espere entre el 5 - 10 min para sedimentar las células (pero no necesariamente se adhieren) antes de la formación de imágenes de los pozos. Incubar el portaobjetos en una cámara húmeda para evitar la desecación, y evitar la manipulación brusca de las diapositivas, que podrían perturbar los hemocitos asentadas. NOTA: Cuando se determinan los recuentos de hemocitos, células liberadas no son fijos y las células deben obtener imágenes poco después de la disección, preferiblemente dentro de 30 minutos después de la liberación de la larva. Dependiendo del volumen de medio y celulares propiedades, la gran mayoría de las células se han asentado dentro de 5 a 10 minutos, que debe ser confirmado por centrarse través de los planos ópticas del medio en el pozo. Sin embargo, sólo una fracción de células de la sangre se han adherido a la superficie de deslizamiento en ese momento, un hecho que debe tenerse en cuenta si la modificación de este protocolo para approache basada fijación de célulass. </li></ol></li></ol></li><li> Cuantificación: <ol><li> Tomar imágenes de los hemocitos asentados bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 2 B, D, F). Siga con cuantificación de hemocitos utilizando el software ImageJ. </li><li> Imagen Prepárese para ImageJ algoritmo de recuento de células: <ol><li> Abrir imagen del bien utilizando ImageJ: Archivo → Abrir → (localizar el archivo y seleccionar). </li><li> Asegúrese de que la imagen (s) es de 8 bits o 16 bits. Ajuste el umbral para la imagen seleccionando Imagen y luego haga clic en Ajustar y seleccione Umbral. Observe la ventana &quot;Umbral&quot; (Figura 3A). </li><li> Marque la opción &quot;Fondo Oscuro&quot;. Seleccione &quot;Red&quot; y aumentar el nivel inferior de umbral (véase la flecha negro) hasta que cada célula en la imagen está marcado con un punto rojo (células que no están siendo cubiertos se verá en escala de grises; Figura 3B). A medida que el umbral inferiorse incrementaron algunas células se convertirán en no marcado. Esto puede ser el indicador de hasta qué punto para establecer el umbral inferior. NOTA: De vez en cuando grupos de células no se pueden resolver y se cuentan como uno por el contador de partículas. En tales casos, el número de células en un clúster se puede estimar mediante el examen de la imagen (zoom si es necesario) y el conteo manual usando un contador de recuento. Alternativamente, el umbral inferior se puede aumentar para resolver grupos de células; las células no marcadas resultantes de esta manipulación se pueden entonces contaron usando un contador de recuento. </li></ol></li><li> Analizar el número de células usando ImageJ: <ol><li> Inicie el Analizador de partículas para contar las células (Figura 3C). Seleccione Analizar y haga clic en Analizar partículas. Opcionalmente seleccione &quot;Overlay contornos&quot; para ver las partículas de la cuenta algoritmo (Figura 3D). Alternativamente, establecer un límite para el tamaño o área de píxeles de una unidad (por ejemplo,., Célula, grupo de células, etc.) para el algoritmo para contar. </li><li> Haga clic en Aceptar. Observar una ventana de resumen con el conde (Figura 3E). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Hemocyte Perturbación Ensayo <ol><li> Para molestar hemocitos, seleccione larvas y colocarlos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con aproximadamente 0,5 g de perlas de vidrio (212 - 600 micras) y añadir 0,5 ml de agua. </li><li> Vortex el tubo, a mano, a la velocidad de 10 durante 1 min. </li><li> Recuperar las larvas de las perlas de vidrio por derramar el contenido del tubo de microcentrífuga en un plato de Petri y elegir las larvas con un pincel. </li><li> Para la fase de recuperación, coloque larvas en platos preparados con anterioridad Petri con pequeñas cantidades de comida mosca. Permitir que las larvas de restablecer su patrón de hemocitos por un período de 45 min o como se desee. NOTA: Deseche las larvas que han dejado de moverse, ya que han muerto en el proceso. Sin embargo, vemos típicamente ldaños oco después de 1 minuto de vórtice (ver a continuación y Suplementario Figura 1). </li><li> Después de que el período de recuperación, continuar con el / Ensayo Raspe Bleed como se ha descrito anteriormente en la Sección 1. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A continuación, describimos el primer método para recuperar cuantitativamente glóbulos residentes y circulantes de larvas de Drosophila sola, y cuantificar estas dos poblaciones de hemocitos. El protocolo comprende la liberación secuencial de circulantes y residentes células de la sangre, seguido por formación de imágenes y el recuento de células automatizado. Hemocitos residentes larvas pueden ser transitoriamente movilizaron en circulación por perturbación mecánica, un proceso que se conoce que se invierta en gran medida dentro de un 30 - período de recuperación min 60 6. En consecuencia, este protocolo se probó en dos formas, (1) mediante la evaluación del número total de hemocitos por larva y la fracción de la circulación de hemocitos en el transcurso de desarrollo de las larvas, y (2) por desalojar experimentalmente hemocitos residentes usando un método automatizado, que confirmó la estrecha correlación de la localización de hemocitos y el número de hemocitos en el residente y poblaciones circulantes. Además, la reproducibilidad del método se demostró por comparing dos conjuntos de datos de réplicas biológicas. En el pasado, los laboratorios han utilizado una serie de técnicas para cuantificar hemocitos larval 6,13,21. Este protocolo establece un estándar común para recuperar y cuantificar las poblaciones de células de la sangre que residan y que circulan a partir de larvas de Drosophila, proporcionando una plataforma fácilmente adaptable. El método descrito es fundamental para los estudios que se centran en el papel de hemocitos residentes y su microambiente, hematopoyético Bolsillos 4-6, y es adecuado para estudiar las cepas transgénicas portadoras de la proteína fluorescente de Drosophila en el tipo salvaje y fondos modificados genéticamente. El protocolo también es relevante para los estudios que se centran en la movilización hemocyte después de la estimulación inmune o lesión, y la señalización genéticamente o ambientalmente inducida que activa movilización de hemocitos residentes o cambios en el número de hemocitos totales (revisado en 4). Cabe señalar que, en los casos de di prematuraferenciación y la liberación de los hemocitos de la glándula linfática, distinguiendo embrionario / larval frente a linajes de glándula de linfa pueden estar limitadas por el patrón de expresión del reportero hemocyte fluorescente usada. El protocolo que aquí se presenta se basa en vivo de formación de imágenes, hemocitos marcados con fluorescencia. En el futuro, puede ser modificado para permitir la detección de células liberadas después de la fijación, por ejemplo, usando inmunocitoquímica. En este caso, puede ser necesario el protocolo que ser adaptado para asegurar la adhesión completa de las células de la sangre, por ejemplo mediante el aumento de los tiempos de incubación de adhesión, y la adición de recubrimiento de deslizamiento adhesivo, tal como concanavalina A. Dado que el método permite la recuperación de hemocitos y su manipulación ex vivo, se beneficiará de una amplia gama de estudios biológicos y bioquímicos de desarrollo, de células. Células residentes y sangre circulante se encuentran en todas las etapas de desarrollo de los postembryonic Drosophila y otros invertebrados 22, suggesting que la adaptación de este método se beneficiará de una amplia gama de estudios más allá del sistema hematopoyético de larvas de Drosophila.

La investigación en el modelo de invertebrados Drosophila melanogaster ha conducido al descubrimiento de la inmunidad innata 1, y ha facilitado la comprensión de diversos aspectos del desarrollo de células sanguíneas 2-4. Drosophila hematopoyesis se puede dividir en el linaje de hemocitos embrionarias / larvales, que se originan en el embrión y expandirse en la larva, y el linaje de los ganglios linfáticos hemocitos 4,5. A continuación, presentamos un protocolo que se centra en el linaje de hemocitos embrionarias / larval, que en la larva de Drosophila comprende principalmente plasmatocitos (macrófagos) y algunas células de cristal 4. En la larva, hemocitos del embrión persisten y colonizan bolsillos segmentally repetidas y terminales hematopoyéticas (HPS), ubicado entre la epidermis y las capas musculares de la pared del cuerpo larval 5,6. Sobre la base de su naturaleza como macrófagos auto-renovación de 6, su residencia predominante en microambientes tisulares locales 6, 7, y su linaje de las células sanguíneas más tempranos emergentes durante el desarrollo 6,8, esta población de células de la sangre se considera similar a los macrófagos del tejido de vertebrados auto-renovación, un linaje mieloide independiente recientemente identificado en una variedad de especies 4,9,10. Sin embargo, en Drosophila, algunas o todas de estas células residentes muestran también la plasticidad para dar lugar a otros tipos de células sanguíneas tales como células de cristal 11,12. Hemocitos larvas son predominantemente residente (sésiles), pero están en un estado de equilibrio dinámico entre varias postas de salud. Se liberan progresivamente en circulación, en particular, como el estadio de larva 3ª acerca pupariation 5-7. Retos inmunes, lesión o perturbación mecánica de plomo a una prematura, en este último caso reversibles, la movilización de hemocitos residentes en la hemolinfa 4,6,13. Estudios previos han sugerido que los residentes y circulanteshemocitos larvas son del mismo linaje, pero difieren en sus propiedades adhesivas o homing 6,7,13,14. Aislamiento selectivo de circulante frente hemocitos residentes reveló niveles elevados de proliferación en la población de hemocitos residente, lo que sugiere su exposición a las señales inductivas de las HPs larvas HPs 6. Drosophila están revestidos por epidermis y las capas musculares y albergar más racimos de neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico (SNP) y la función hepática se asemeja oenocytes 6. Funcionalmente, los experimentos de ablación de células mutantes y genéticos han demostrado que las neuronas sensoriales presentes en los HPs apoyar la supervivencia trófico y localización de los hemocitos de las larvas 6. Aquí se describe un método para el aislamiento específico y cuantificación de residentes y circulantes hemocitos de las larvas de Drosophila sola, y un protocolo para la movilización de hemocitos mecánica. Los métodos se pueden utilizar para la ex vivoestudio de hemocitos y, además se puede adaptar a otras etapas de desarrollo de Drosophila tales como la pupa y adulto, y otros sistemas de invertebrados. Dado que los estudios anteriores no distinguen entre los residentes y los hemocitos circulantes, este protocolo ofrece un estándar común para el estudio de las células sanguíneas residentes y ayudará a aumentar la coherencia de la investigación con células de sangre de invertebrados. En primer lugar, la purga / Ensayo Raspe Hemocyte describe el aislamiento diferencial y cuantificación automática de residente proteína marcada fluorescente y circula poblaciones hemocitos de las larvas de Drosophila sola; el protocolo ofrece dos opciones para microscopios comunes y azulejos equipadas escanear (Figura 1). Como resultado, se obtienen el porcentaje de hemocitos circulantes y el número total de hemocitos por larva. El método se basa en larvas de Drosophila transgénicos que expresan la proteína fluorescente entre sus células de la sangrepoblación. La elección del conductor hemocyte o reportero determina el resultado, es decir, que se visualiza población de células de la sangre y se cuantifica. Para etiquetar principalmente macrófagos (plasmatocitos), que comprenden la gran mayoría de la población residente y de circulación de hemocitos de la larva de Drosophila 6, transgenes adecuados incluyen Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ Gal4 15, Pxn Gal4 16, CRQ-GAL4 (por H. Agaisse 16), o come-GAL4 17; para el etiquetado de la relativamente pequeña población de células de cristal, líneas adecuadas son BcF6-PPC y GFP 18 o lz-GAL4 (por J. Pollock 19); para lamellocytes etiquetado, un tipo de célula especializada inducida principalmente por los retos y las lesiones 13 inmunes, por ejemplo, MSNF9mo-mCherry se puede utilizar 17. Algunos conductores transgénicas se expresan en una amplia gama de sangre diferenciadacélulas y progenitores, tales como He - GAL4 20, que las etiquetas de alrededor del 80% de todas las células de la sangre de larvas 20. Tenga en cuenta que en todos los casos en que se utilizan los conductores GAL4, se requiere combinación con UAS-GFP u otra proteína UAS-transgén fluorescente. En la sección Resultados, este método se utiliza para supervisar el número de células de la sangre y el comportamiento de circulación en el transcurso del desarrollo de las larvas. En segundo lugar, la perturbación Ensayo Hemocyte describe una etapa precedente diseñado para separar los hemocitos residentes por manipulación externa, lo que permite posteriormente la evaluación de la capacidad de los hemocitos de volver a adherirse y el hogar de HPs dentro de un marco de tiempo limitado (30 - 60 min) 6. Típicamente este ensayo es seguido por el / Ensayo Raspe Bleed para determinar el porcentaje de hemocitos circulantes por larva. Se presenta un protocolo simplificado para este ensayo (Figura 1 D), que utiliza la perturbación por el ingenio vórtexperlas de vidrio h, en lugar de manipulación de la larva individual con un cepillo de pintura como se ha descrito previamente 6. En la sección de resultados, este ensayo se usa para demostrar que flotador hemocitos transitoriamente individual en la hemolinfa y puede ser recuperada en la fracción de hemocitos circulantes. El ensayo también es útil para cuantificar las diferencias de hemocitos en su homing / adherencia a los sitios residentes, comparando por ejemplo, los diversos antecedentes genéticos o condiciones de estimulación. Tenga en cuenta que esta manipulación mecánica refleja un proceso reversible y es distinta de la movilización hemocyte residente Infección o inducida por la lesión, que por lo general no son reversibles en un corto período de tiempo 4,13.

<table><tbody><tr>Placas <td></td><td></td> de <td>Petri de 6 cm/9 cm</td><td>Una para cada genotipo a evaluar</td></tr><tr><td>Botella</td><td></td><td></td><td></td>de agua</tr><tr><td>Cuchara/espátula</td><td></td><td></td><td></td>de metal</tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td> fino<td>p. ej., un "liner"</td></tr><tr><td>Plato de cavidad de vidrio</td> Bolígrafo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP: Super PAP PEN IM3580</td><td>Beckman Portaobjetos de Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass</td> Cada diapositiva tendrá 5 o más cuadrados de PAP PEN dibujados en ellas.<td></td><td></td><td> El tamaño de los cuadrados depende del objetivo de la imagen y del aumento de la cámara del microscopio; por ejemplo, cuadrados de de 2 mm.</td></tr><tr><td>Cámara húmeda</td><td></td><td></td><td>Esto se utilizará para evitar que los portaobjetos y los pozos se sequen: recipiente sellado con toallas de papel húmedas que recubren los lados/fondo</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medios de cultivo celular</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloque</td><td></td><td></td> frío <td>Se trata de un bloque metálico (también conocido como bloque calefactor) enfriado en un cubo que contiene hielo; preferiblemente de color negro u otro color oscuro no reflectante</td></tr><tr><td>2 jeringas de 1 ml con agujas (27 G y frac12; </td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Para las disecciones.</td></tr><tr><td>Opcional: Tijeras quirúrgicas de muelle (filo de 2 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de vidrio, 212 - 600 &mu; m</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tubos Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td></td><td>Uno por genotipo evaluador</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Larvas de Drosophila transgénicas con hemocitos marcados con fluorescencia.</td><td></td><td></td><td>Los transgenes adecuados incluyen: Hml&Delta;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP y -GFP (Gajewski et al., 2007), o Hml&Delta;-GAL4 (Sinenko y Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (por H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), o eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combinado con UAS-GFP u otros transgenes de proteínas fluorescentes.</td></tr><tr><td>Microscopio de disección de fluorescencia</td><td>Leica</td><td></td><td>Aquí: Leica M205, opcional con cámara, software de imagen y módulo de medición</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida con accesorio de cámara</td><td>Leica o Keyence</td><td></td><td>Con o sin función de escaneo de mosaicos (p. ej., serie Leica DMI, serie Keyence BIOREVO BZ-9000)</td></tr></tbody></table>

analizando poblaciones de células sanguíneas de la<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

En los vertebrados, la hematopoyesis está regulada por microambientes inductivas (nichos). Del mismo modo, en el modelo de invertebrados organismo Drosophila melanogaster, microambientes inductivos conocidos como bolsillos hematopoyéticas larvales (HPS) se han identificado como sitios anatómicos para el desarrollo y la regulación de la sangre células (hemocitos), en particular del linaje de los macrófagos auto-renovación. HPs son segmentally repetida bolsas entre la epidermis y las capas musculares de la larva, que también comprenden las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. En la larva, residentes (sésiles) hemocitos están expuestos a anti-apoptótica, adhesivo y señales proliferativas de estas neuronas sensoriales y, potencialmente, otros componentes de los hps, tales como el músculo y las capas epiteliales de revestimiento. Durante el desarrollo normal, la liberación gradual de hemocitos residentes de los combustibles HPs la población de hemocitos circulantes, que culmina en la liberación de most de los hemocitos residentes en el inicio de la metamorfosis. Ataques inmunológicos, lesiones físicas o perturbación mecánica desencadenan la liberación prematura de hemocitos residentes en circulación. El interruptor de hemocitos de larvas entre ubicaciones residentes y la circulación plantea la necesidad de una norma / procedimiento común para aislar selectivamente y cuantificar estas dos poblaciones de células de sangre de larvas de Drosophila sola. En consecuencia, este protocolo describe un método automatizado para liberar y cuantificar el residente y hemocitos circulantes de larvas sola. El método facilita enfoques ex vivo, y puede ser adaptado para servir a una variedad de etapas de desarrollo de Drosophila y otros organismos invertebrados.

Para ilustrar los resultados típicos de los métodos descritos, se utilizó por primera vez la purga / Ensayo Raspe Hemocyte para delinear la progresión de números hemocyte larvas y su residencia en el transcurso del desarrollo de las larvas (Figura 4). Residente y circula poblaciones larvarias de hemocitos fueron aisladas de las larvas sola (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Él-GAL4 etiquetar la gran mayoría de los hemocitos de las larvas) y se cuantificó usando ImageJ. Las cohortes de larvas de tamaño 1.2 mm (~ 48 AEL hora o 1 st estadio), 2,5 mm (~ 80 AEL hr o tarde 2º estadio), y 3,5 mm fueron examinados (~ 96 AEL hr o 3er estadio) (Figura 4) . Número de hemocitos se expandieron a lo largo del desarrollo larvario, se correlaciona con y superando las estimaciones previas sobre la base de microscopía de luz de tinte manchado larvas 7 y contando en directo de proteína marcada hemocitos fluorescentes a través de la cutícula larval 6. En 1 ins stlarvas de alquitrán de casi todos los hemocitos fueron residente, mientras que la fracción de hemocitos circulantes aumentó progresivamente durante el curso del desarrollo de las larvas (Figura 4B, C), consistente con las publicaciones anteriores 6,7. A continuación examinamos si el método monitorea fielmente la transición de hemocitos entre el residente y poblaciones circulantes. Tomando ventaja del fenómeno que hemocitos residentes pueden ser transitoriamente individual aislada por la perturbación mecánica y que re-se adhieren a sus sitios residentes espontáneamente 6, nos dispersamos hemocitos residentes por agitación con perlas de vidrio como se describe en el Ensayo de perturbaciones Hemocyte. De hecho, la perturbación mecánica de las larvas condujo a un aumento espectacular en la población de hemocitos circulantes a expensas de hemocitos residentes (Figura 5). Después de un período de recuperación de 45 min, hemocitos habían regresado en gran medida a su estado adherente, tanto por inspección visual y por el comosessed porcentaje de células circulantes (Figura 5D, E). Como era de esperar, el número total de hemocitos se mantuvieron estables en el tiempo, a pesar del cambio de hemocitos entre las que circulan y residentes poblaciones. Varias consideraciones adicionales fueron tomadas en cuenta. Para confirmar que vórtex no causar daños importantes tejido, vórtex con perlas de vidrio se realizó en presencia de azul de tripano (Sigma) durante diversos períodos de tiempo (1, 5, 20 min). Tanto 1 y 5 min vórtex no causó ninguna interrupción del tejido obvia, mientras que 20 min vórtex resultó en pequeñas áreas de daño, se asemeja a los daños causados ​​por puntos de sutura aguja utilizada como control positivo (Figura Suplementaria 1). Mientras que el daño interno de la epidermis o en otros tejidos sin dañar la cutícula no se puede excluir, parece este escenario bastante improbable como hemocitos de 1 min y 5 larvas de re-adherido en el patrón esperado y los plazos min-tratada, lo que sugiere la integridad de las larvas no era de compromisod (Figura Suplementario 1). En contraste, las larvas vórtex durante 20 min sufrido de una falta de re-adherencia, y ni siquiera muestran la unión de hemocitos circulantes a los sitios de heridas epidérmicas, como se ha descrito previamente 14. Por último, para demostrar la reproducibilidad del método, se compararon las réplicas biológicas de 2,5 mm larvas de los dos experimentos anteriores, que se llevaron a cabo por los experimentadores distintas. Como se ilustra en la Figura 2 Suplementario, ambas cohortes mostraron números totales comparables de hemocitos por larva, y el porcentaje de hemocitos circulantes. T prueba de Student no mostró diferencias estadísticamente significativas, lo que sugiere que el método es reproducible y ampliamente aplicables. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Hemocyte Bleed / Raspe y Disturbio Ensayo s<html> etup y esquemática. (A) de una única imagen de instalación de diapositivas: cinco cuadrados de 2 mm para imágenes con un objetivo de 5X (B) Azulejos de configuración de diapositivas Scan:. Cuatro plazas 3 mm para purga de imágenes / raspaduras de ≤2.5 mm larvas con un microscopio de barrido de baldosas. Objetivos recomendados para imágenes son 5X o 10X. (C) Bleed / Raspe ensayo cuantificaciones esquemáticos y resultantes utilizando ImageJ. (D) en el ensayo de perturbación, el patrón de hemocitos se interrumpe mecánicamente por agitación larvas con cuentas de vidrio. Las larvas se les permitió recuperarse durante un período de 45 min durante el cual hemocitos volver a adherirse a los bolsillos hematopoyéticas. Las propiedades adhesivas de hemocitos pueden ser evaluados por este método, cuantificando el porcentaje de hemocitos en circulación después de la perturbación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> formas &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Bleed / Ensayo Raspe para liberar circulante y hemocitos residentes. (A) Para purgar una larva, incisiones ventrales en los extremos anterior y posterior de la larva se hacen (tijeras de símbolos). (B) hemocitos en circulación, que saldrán de las incisiones y asentarse en la superficie de la diapositiva. (C) El ganglio linfático (LG) se encuentra inmovilizado y, sin pincharlo. Hemocitos residentes son liberados por golpeando y / o raspado de la larva con una aguja hemocitos (D) residentes en la diapositiva.. (E, F) El proceso Raspe se repite hasta que todos los hemocitos residentes son liberados. El cadáver de larvas que contiene la glándula linfática intacta se quede atrás. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. automatizado cuantificación de hemocitos usando ImageJ. (A, B) Después de abrir un archivo de imagen de hemocitos en ImageJ, el nivel umbral inferior se ajusta para tener en cuenta todas las celdas de la imagen. (C, D) Analizar partículas requiere establecer el tamaño de píxel de células, la circularidad, y la lectura del resultado formato (por ejemplo, superposición de contornos). (E) ventana Resumen muestra el número de hemocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. Los resultados representativos (1). Número de hemocitos y estado de residencia durante el<html> curso del desarrollo larval. (A) Información general de las etapas larvales utilizados; 1 st estadio (48 hr AEL; ~ longitud 1,2 mm); 2º (AEL 80 h; 2,5 mm de longitud) instar; 3º estadio (96 hr AEL; ~ 3.5 mm de longitud). El genotipo es Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Él-GAL4. Etapas fueron confirmados mediante la evaluación mouthhooks larvales. (B) Diagrama de Abogados de circulante y número de hemocitos residente en las respectivas fases larvarias. (C) Porcentaje de hemocitos circulantes. Tenga en cuenta que la fracción de hemocitos circulantes aumenta desproporcionadamente en el transcurso de desarrollo de las larvas. (D) hemocitos totales, resultante de la suma de circulante y hemocitos residentes por larva. Hemocitos se cuantificaron utilizando el método de purga / Raspe; n ≥ 6 larvas / estado, barras de error muestran la desviación estándar, los hallazgos confirmados en 3 replicar experimentos independientes.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> Figura 5. Los resultados representativos (2). Efectos de la perturbación mecánica en la residencia de hemocitos. (AC) Ejemplo de una larva antes y después vórtex con cuentas de vidrio, seguido por la recuperación de 45 min (A) No hay control de disturbios.; hemocitos se localizan en los bolsillos hematopoyéticas (B) Patrón hemocyte Interrumpió a 0 minutos después de vórtex larvas en una suspensión de cuentas de vidrio y agua (C) Patrón Hemocyte a los 45 min de la recuperación posterior a la perturbación..; muchos hemocitos se han trasladado a los bolsillos hematopoyéticas; nota ampliada dorsal-vasos grupos asociados y rayas dorsales que son sitios predominantes de la acumulación temprana posterior a la perturbación (flechas). El genotipo es Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Él-GAL4 x yw. (D) Porcentaje de hemocitos cuantificados por el método de purga / Raspe circulante. (E) hemocitos totales, resultante de la suma de circulante y hemocitos residentes por larva. n ≥ 4 larvas / estado, barras de error muestran la desviación estándar, los hallazgos confirmados en 3 replicar experimentos independientes. La prueba t de Student para confirmar importancia, NS (no significativo), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las células sanguíneas de Drosophila, o hemocitos, circulan entre los sitios residentes y la circulación. En la larva, los hemocitos residentes (sésiles) se localizan en microambientes inductivos, las bolsas hematopoyéticas, mientras que los hemocitos circulantes se mueven libremente en la hemolinfa. El objetivo de este protocolo es el aislamiento y la cuantificación estandarizados de estas dos poblaciones de hemocitos que tienen un comportamiento distinto pero que se intercambian.

Analizando poblaciones de células sanguíneas de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cuantificar las poblaciones de células sanguíneas circulantes y residentes de una larva individual de Drosophila. Esto se logra primero sangrando suavemente las hemoocitos circulantes mediante incisiones definidas en la pared corporal larval. El segundo paso consiste en liberar la población de células sanguíneas residentes de los bolsillos hematopoyéticos ubicados entre la epidermis larval y las capas musculares, lo cual requiere raspar o pinchar con una aguja u otra herramienta de disección.Se cuentan cualquier hemo cito que permanezca en el cadáver larval y se toman imágenes de las células sanguíneas liberadas en las laminillas de vidrio donde se disectaron las larvas. El paso final consiste en realizar un análisis con Image J para cuantificar las células sanguíneas liberadas. Esto permite calcular el número de hemo citos circulantes y residentes por larva, por ejemplo, comparando larvas de diferentes estadios de desarrollo.La fruta voladora de melón rosala. Augusta ha sido un modelo excelente para comprender los principios generales de la inmunidad y el desarrollo de las células sanguíneas. Las células sanguíneas de los invertebrados también se denominan hemos, que comúnmente se cree que circulan en el hemolinfa.Sin embargo, en muchas etapas del desarrollo y en el adulto, una gran parte de los hemo sots se encuentra realmente en agrupaciones de Cecile que residen en ciertos tejidos. Investigaciones recientes se han centrado en estas poblaciones de hemo sots residentes, sus propiedades y regulación, y hemos desarrollado un método que permite aislar selectivamente las células sanguíneas residentes y circulantes de la larva de Drosophila, en comparación con los métodos existentes que liberan las hecitos de forma no selectiva. Este método distingue entre las poblaciones circulantes y residentes, y proporciona un enfoque automatizado y reproducible para su aislamiento y cuantificación.Desarrollamos este método cuando comenzamos a estudiar las células sanguíneas residentes en los bolsillos hematopoyéticos de la larva de Drosophila. Descubrimos que al aislar selectivamente hemocitos residentes frente a los circulantes, estas dos poblaciones muestran comportamientos diferentes, como en la proliferación. La demostración visual de este método es útil porque es importante familiarizarse con la ubicación de los hemocitos residentes y circulantes y con la forma de liberarlos selectivamente.El método permite abordar preguntas clave en desarrollo, hematopoyesis e inmunidad, por ejemplo, respecto a las señales que inducen las células sanguíneas y promueven su localización en los bolsillos hematopoyéticos y viceversa. Respecto a las señales que movilizan los hemocitos de Cecile hacia la circulación, por ejemplo, tras un desafío inmunitario, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para manipular suavemente las larvas y realizar incisiones precisas en la parte del procedimiento destinada a la extracción de sangre. Estos pasos son fundamentales para asegurarse de que las dos poblaciones no se mezclen ni se liberen al mismo tiempo.Este método es muy útil para drosófilas de diversos tamaños y estadios, y puede adaptarse a otros estadios de desarrollo y potencialmente a otros invertebrados también. Para aislar larvas del alimento de las moscas, rocíe agua dentro del vial y lave las larvas hacia una placa de Petri. Seleccione las larvas de la placa de Petri utilizando un pincel y colóquelas en agua dentro de una placa de cavidad.Transfiera las larvas a una placa sobre un bloque met&aacute;lico fr&iacute;o y seleccione larvas del tama&ntilde;o y genotipo deseados bajo un microscopio de fluorescencia. Las larvas deben portar transgenes que marquen los hepatocitos mediante la expresi&oacute;n de una prote&iacute;na fluorescente u otro marcador visible de hepatocitos. Coloque una larva en el primer lapicero de PAP.Bueno, para aislar los hemocitos circulantes, use disección, tijeras o dos agujas limpias para hacer incisiones en el lado ventral de la larva. Para evitar los hemocitos residentes, haga una incisión en el extremo posterior y otra en el extremo anterior de la larva. Asegúrese de que las incisiones se realicen en la misma ubicación en cada larva.Deje que las larvas sangren durante unos segundos sin aplicar presión ni agitación física. Después de unos segundos, levante suavemente las larvas con las agujas o pinzas y colóquelas en un segundo pocillo para enjuagarlas y liberar los hemocitos residentes.Transfiera suavemente las larvas al siguiente pocillo y sujételas con un punto de aguja. Utilice otra aguja para desagregar los grupos de hemocitos visibles a través de la pared corporal de la larva. Evite la glándula linfática al liberar el tejido residente.He citado las larvas. Elija una parte de las larvas para pinchar en cada pocillo y haga lo mismo con las muestras restantes. Coloque el cadáver final en un área limpia del mismo portaobjetos y extiéndalo lo más finamente posible para maximizar el enfoque en las capas ópticas.Cuente manualmente los eritrocitos restantes con un contador manual. Una vez completada la disección, espere entre cinco y quince minutos para que las células se sedimenten. Antes de la adquisición de imágenes, guarde la placa en una cámara húmeda para evitar que se seque.Las células he asentadas sobre el portaobjetos se examinan mediante microscopía de fluorescencia; se capturan imágenes de fluorescencia de las células he asentadas para el método de un solo pocillo. El campo de imagen debe cubrir todo el pocillo en el método de escaneo en mosaico. Se seleccionan los márgenes de los pocillos y se adquieren imágenes utilizando un microscopio comercial.Las imágenes resultantes del software de escaneo por mosaico se analizan luego para la cuantificación de sitios de hemorragia. Se inicia el software Image J y se abre la imagen del pocillo. Asegúrese de que la imagen sea de ocho bits o de 16 bits.Ajuste el umbral seleccionando la imagen. Luego seleccione ajustar y umbral. Para observar la ventana de umbral, marque la opción de fondo oscuro y seleccione rojo.Luego ajuste el nivel umbral inferior. Esta configuración permitirá al usuario marcar las células con un punto rojo. Las células que no estén cubiertas se verán en escala de grises.Inicie el analizador de partículas para contar las células, seleccione, analice y haga clic en analizar partícula. Seleccione contornos superpuestos para ver el recuento del algoritmo y analizar el número de células, haga clic en aceptar y observe la ventana de resumen con el recuento. Las células residentes pueden perturbarse mecánicamente, lo que provoca un aumento transitorio en la población circulante de células sanguíneas para lograr la perturbación. Las larvas completas se agitan en vórtice con perlas de vidrio y se dejan recuperar durante un período definido, durante el cual las células hematopoyéticas se relocalizan a los bolsillos hematopoyéticos.Esto se ilustra cuantificando la fracción de células sanguíneas circulantes antes y después de la perturbación y tras el período de recuperación para perturbar mecánicamente los hemocitos residentes. Seleccione entre cuatro y ocho larvas y colóquelas en un tubo microcentrífugo de dos mililitros con aproximadamente 0.5 gramos de perlas de vidrio de 600 micrones y 0.5 mililitros de agua. Vortexee el tubo manualmente a velocidad 10 durante un minuto. Recupere las larvas de las perlas de vidrio vertiendo el contenido del tubo microcentrífugo en una placa de Petri y seleccionando las larvas con un pincel para la fase de recuperación.Coloque las larvas en las placas de Petri previamente preparadas con una capa delgada de alimento para moscas. Incube las larvas durante 45 minutos para permitir que restablezcan su patrón de hemocitos tras el período de recuperación. Continúe con las disecciones por raspado para obtener la muestra de hemolinfa, como se describió anteriormente en las larvas control; los hemocitos se localizan en los bolsillos hematopoyéticos, formando parches laterales y franjas dorsales.La perturbación mecánica transitoria de las larvas provoca un aumento dramático en la población de hemocitos circulantes a expensas de los hemocitos residentes. Después del período de recuperación, los hemocitos regresan a los bolsillos hematopoyéticos. Las larvas pueden presentar agrupaciones asociadas al vaso dorsal agrandadas y franjas dorsales, que son los sitios predominantes de acumulación temprana tras la perturbación.Los porcentajes evaluados de hemo cito s circulantes se cuantificaron mediante el método de raspado por sangrado. Este método proporciona un enfoque novedoso para la investigación de células sanguíneas en invertebrados. Permite investigar la población de células sanguíneas residentes autorrenovables y otros hemo cito s con el fin de comprender la regulación por microentornos locales y señales sistémicas.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo aislar y cuantificar selectivamente larvas hemáticas residentes en circulación. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente 15 minutos por larva. Esto incluye la liberación, obtención de imágenes y cuantificación de células sanguíneas. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como inmunoquímica y ensayos biológicos celulares, para abordar preguntas tales como el estado de proliferación, diferenciación, supervivencia o fagocitosis de las células sanguíneas.Al realizar este procedimiento, es importante mantener la calma y liberar los hemocitos circulantes con cuidado, manipulando las larvas suavemente para evitar liberar los hemocitos residentes junto con los circulantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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