Una piattaforma per l'elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
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Bioengineering
 

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Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

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Abstract

Un vantaggio importante di dispositivi microfluidici è la capacità di manipolare piccoli volumi, riducendo così sprechi di reagente e conservazione del campione prezioso. Tuttavia, per raggiungere robusta manipolazione campionatura è necessario affrontare l'integrazione dei dispositivi con l'ambiente macroscala. Per realizzare ripetibili, la separazione di particelle sensibili con dispositivi microfluidici, questo protocollo presenta una completa piattaforma microfluidica automatizzata e integrata che consente l'elaborazione precisa dei 0.15-1.5 ml campioni utilizzando dispositivi microfluidici. Aspetti importanti di questo sistema comprendono struttura modulare dispositivo e infissi robusti conseguente mondo affidabile e flessibile di chip connessioni, e la gestione dei fluidi completamente automatizzata che compie campionario circuito chiuso, sistema di pulizia e adescamento misure per garantire il funzionamento ripetibile. Diversi dispositivi microfluidici possono essere usati in modo intercambiabile con questa architettura. Qui incorporiamo un dispositivo acoustofluidic, particolare la sua characterizzione, ottimizzazione delle prestazioni, e dimostrare il suo uso per dimensioni-separazione dei campioni biologici. Utilizzando feedback in tempo reale durante gli esperimenti di separazione, la raccolta dei campioni è ottimizzato per conservare e concentrare campione. Sebbene richiede l'integrazione di più apparecchiature, i vantaggi di questa architettura includono la capacità di trattare i campioni sconosciuti senza ulteriore ottimizzazione del sistema, facilità di sostituzione del dispositivo, e preciso, campione di trasformazione robusto.

Introduction

Separazione del campione e frazionamento è una delle aree di applicazione più promettenti per le tecnologie microfluidici. Tali fasi di manipolazione del campione sono parte integrante per la diagnostica clinica, lo sviluppo efficaci terapie, gli sforzi Biosurveillance e progressi nella ricerca delle scienze della vita e della tecnologia. Una miriade di strategie di separazione microfluidica sono state dimostrate per il particolato e colloidi fluide in sospensione, così come per le specie chimiche e biologiche; diverse recensioni forniscono una panoramica delle recenti progressi e gli sviluppi in questi settori 1 - 9. Anche se molte di queste tecnologie di separazione microfluidica (di seguito denominati "Core Devices") sono stati ampiamente caratterizzato, pochi studi hanno preso in considerazione il problema di separazione del campione a livello di sistema. I dispositivi core sono in genere singoli chip centimetri scala, interfacciati a tubi fluoropolimero, con fluido erogato da una pompa o pressione.Tuttavia, se la promessa di microfluidica - tra cui una maggiore automazione, affidabilità e riduzione dei volumi di campione - è di diventare realtà, almeno uno sforzo equivalente deve essere dedicata alla progettazione di un sistema di separazione completa in cui è integrato il dispositivo del centro .

Inoltre, una grande sfida per gli approcci alla microfluidica biorilevazione è il macro al micro interfaccia. Questo si riferisce non solo alle connessioni fisiche "mondo-truciolo" di un dispositivo a microfluidi ai componenti macroscala, e per la mancata corrispondenza tra tipici volumi di campione clinico o analitico (~ 0,1-10 ml) e il volume interno di chip microfluidica (~ 0,01-10 microlitri), ma anche le limitazioni di campionamento statistico derivanti da colmare queste scale dimensionali. Questi problemi contribuiscono alla percezione che la pre-elaborazione e preparazione del campione sono il "anello debole" della biorilevazione. 10 La piattaforma descritta in questo lavoro taKES grandi passi verso affrontare queste sfide.

In una prospettiva a livello di sistema, i dettagli di questo protocollo il trattamento affidabile di precisione-misurate volumi analitico scala (che variano da 0,15 a 1,5 ml) su scale temporali ~ 10 min. Si tratta di una operazione "un solo pulsante": una volta che la fiala sorgente contenente le fiale di campione e di destinazione per la raccolta delle frazioni vengono inseriti nel sistema, il comando "Esegui" avvia la procedura, e tutte le fasi sono controllati dal computer. Alla fine di una corsa, le fiale di raccolta possono essere rimossi dal sistema di analisi valle delle frazioni separate.

Il Device Core in questo sistema è un chip acoustophoresis che estrae (5-20 micron) particelle di cellule di mammifero dimensioni dal campione. Separazione Acoustophoretic è scelto qui soprattutto perché è high-throughput (fino a 100s di microlitri / min), senza etichetta e senza contatto, offrendo così vantaggi nel separare viru praticabileses dalle cellule che poche altre tecniche microfluidici possono eguagliare. La fisica della particelle acustico messa a fuoco sono stati ampiamente descritti, 11 - 13 e non sono il focus di questo protocollo, ma un breve riassunto dei concetti di base segue per aiutare a comprendere l'applicazione alla separazione microfluidica.

Ultrasuoni onde stazionarie risonanti in microcanali piene di liquido producono campi di pressione, che danno origine a forze che guidano le particelle verso i nodi di bassa pressione. La grandezza forza dipende dal volume della particella, e su un fattore di contrasto acustico derivante dai relativi densità e compressibilities della particella e il fluido di sospensione. 14 In quanto tale, concentrandosi acustico è ideale per la separazione delle cellule di dimensioni (~ 7-15 micron) da (~ 50-200 nm) particelle virus-dimensioni. Le particelle più grandi migrano verso un nodo di pressione; tuttavia, poiché l'intensità della forza è molto piccolo perparticelle di dimensioni inferiori a 2-3 micron, queste piccole particelle o specie disciolte difficilmente muoversi. La nostra implementazione specifica di separazione acustica, come precedentemente descritto, 15 incorpora una parete sottile per suddividere il canale del fluido e permette sintonizzabile, posizionamento asimmetrico della posizione di messa a fuoco. Questo aggiunge flessibilità nella progettazione di dispositivi, e dei benefici, tra cui una maggiore qualità delle prestazioni di separazione e la velocità sono perfettamente descritte altrove. 16,17

Tuttavia, uno dei principali vantaggi del metodo di progettazione a livello di sistema descritto in questo lavoro è che è adattabile ad una grande varietà di dispositivi microfluidici core. Ad esempio, la maggior parte delle altre modalità di separazione a flusso continuo, tra cui inerziale, flow-campo di frazionamento, spostamento laterale deterministico (DLD), e vari tipi di dispositivi elettrocinetiche possono essere facilmente incorporati, con opportuni aggiustamenti fatti per tener conto delle variazioni nella configurazione di ingresso / uscita , portate,e volumi di campione. I dispositivi con vari tipi di campi on-chip (elettrico, magnetico) o gradienti (termici, chimici) possono richiedere ulteriori collegamenti al chip, o l'integrazione di hardware aggiuntivo, che questa piattaforma può ospitare.

Questo protocollo definisce i passaggi indispensabili per la progettazione di un dispositivo di separazione microfluidica, e per fabbricare chip di silicio di vetro da una profonda ion etching reattiva (DRIE, un processo al plasma etch disponibili in molte strutture di microfabbricazione, che utilizza cicli di incisione e passivazione alternati per raggiungere in profondità caratteristiche con pareti laterali verticali 18). Successivamente, descriviamo la caratterizzazione del dispositivo acoustofluidic per determinare i parametri di funzionamento ottimali per la separazione, e infine dettaglio il sistema di separazione completamente integrato e la procedura per il trattamento di campioni biologici. Risultati caratterizzazione dispositivo tipici e l'elaborazione dei dati del campione vengono poi presentati e discussi, ed i vantaggi di questo approach sono evidenziati, tra cui la modularità, robustezza, precisione e automazione.

Protocol

1. Acoustophoretic Device Design e Layout Photomask

NOTA: Considerazioni generali e le linee guida per la progettazione di processo microfabbricazione e il layout maschera può essere trovato in testi di microfabbricazione e tutorial di progettazione fotomaschera 19-21.

  1. Lay out Maschera 1, lo strato fluidico (lato anteriore), utilizzando appropriati software CAD. Scegliere una geometria che permette di iniezione del campione e separazione appropriate per l'applicazione desiderata.
    1. Per acustica focalizzazione, impostare la larghezza del canale fluidico w per fornire una frequenza di risonanza f n maggiore di 1 MHz secondo l'equazione f n = NC / 2w, dove c è la velocità del suono nel fluido rilevante e n è il numero di nodi standing-onda (ad esempio, per un canale largo 900 micron, il due nodo di risonanza è previsto a f 2 = 1.65 MHz).
      NOTA: Particles occupano posizioni laterali distinte verso la fine del canale di separazione dovrebbe uscire dalle prese distinte. In questo protocollo, le particelle sono separate da dimensioni, in modo che i punti sono designati SPO e LPO, per piccole particelle e outlet grandi particelle, rispettivamente, come mostrato in Figura 1.
    2. Impostare la lunghezza di canale del fluido per controllare la lunghezza del tempo particelle sono esposti al campo di separazione ad una portata specifica. Più lungo tempo di permanenza on-chip per le particelle di migrare a causa di forze di separazione deve essere scambiato off contro il più grande circuito integrato impronta richiesto.
      NOTA: i nostri dispositivi acustici di messa a fuoco, il canale di flusso fa tre passaggi verso il basso il chip per aumentare il tempo di permanenza (Figura 2a). Ad una velocità tipica flusso totale di 200 microlitri / min, particelle che attraversano il 300 x 200 micron sezione trasversale, 117 mm canale di separazione lungo spendere in media 2,1 sec nel campo acustico.
  2. Includere porti fluidici in Layo mascheraut per connessioni a tubi standard disposti su una griglia standardizzata (5-mm pitch). Includere punti di riferimento idonei per l'allineamento delle maschere tra loro durante la fabbricazione e tagliare a cubetti dei singoli dispositivi.
  3. Lay out Mask 2, la Via Layer (lato posteriore), che include solo i porti fluidici. Includere punti di riferimento per l'allineamento alla Maschera 1.

Figura 1
Figura 1. Dispositivo Acoustofluidic. Schizzi schematici dell'architettura dispositivo acoustophoretic. (A) Vista dall'alto, che mostra la configurazione complessiva H-filtro (non in scala). (B) Schema della sezione trasversale del canale nella posizione contrassegnata dalla linea nera tratteggiata in (a), che mostra il campo di pressione (tratteggiata blu), e il senso delle forze acustici primari radiazione (PRF) che guidano le particelle verso piani nodali (frecce rosse). La sezione del canaleè 900 × 200 micron con una parete di circa 10 micron di spessore che separa la principale (300 micron di larghezza) e canali di bypass. (C) Rappresentazione 3D di separazione delle particelle. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Cleanroom Fabbricazione di chip microfluidici per Acoustophoresis

  1. Motivo le porte del fluido di back-side utilizzando Mask 2 su un doppio lato lucido 0,5 mm di spessore, 100 mm di diametro <100> wafer di silicio da fotolitografia positivo-resistere standard. Etch questa geometria da profonda attacco con ioni reattivi (DRIE) ad una profondità di 350-400 micron.
  2. Ruotare il wafer sopra, e la geometria dei canali fluido modello lato anteriore utilizzando Mask 1 dalla norma positivo-resistere fotolitografia sull'altro lato del silicio. Quindi, montare il wafer dispositivo ad un secondo (in bianco silicio) porta-wafer con photoresist.
  3. Etch i canali, anche DRIE, ad una profondità di 200 micron, attraverso-attacco del silicio nelle posizioni delle porte (wafer portante protegge la superficie dell'utensile DRIE). De-montare il wafer dispositivo dal vuoto di Si wafer da immersione in soluzione di resistere-stripping.
  4. Pulire il wafer dispositivo e un informe wafer vetro borosilicato 0,5 mm di spessore con soluzione Piranha (acido solforico e perossido di idrogeno in un rapporto 3: 1).
  5. Sigillare i canali in liquidi anodicamente incollaggio del vetro e silicio wafer utilizzando i seguenti parametri: pressione della camera a 3 mTorr, pressione pistone a 1000 N, temperatura a 350 ° C, e applicare 750 V fino la corrente scende sotto 0,2 mA.
  6. Tagliare i singoli chip a parte con una lama di diamante su una sega a dadi.

3. Dispositivo di assemblaggio finale

  1. Piezo trasduttore Allegato
    NOTA: ultrasuoni viene generato nel chip microfluidico da un trasduttore piezoceramico attaccato al lato di silicio.
    1. Da awo-componente del kit epossidico a bassa viscosità, pesare il rapporto consigliato di entrambi i componenti e mescolare accuratamente.
    2. Dispensare la miscela epossidica con una pipetta e distribuiti in modo uniforme attraverso un titanato zirconato di piombo (PZT) piezoceramico per creare un sottile e uniforme strato (circa 10 ml di miscela epossidica per un piezo con dimensioni di 37,5 × 10 × 0.5 mm).
    3. Utilizzando una maschera o dispositivo che consente, allineare il lato epossidica del piezoceramico con il chip microfluidico, fornendo un'area sporgente su un lato per il successivo fissaggio del filo (vedi figura 2a), e portare i due componenti in contatto. Bloccare il gruppo in morsa, facendo attenzione a non rompere qualsiasi dei componenti, e curare alla temperatura e la durata raccomandata dal produttore epossidica.
    4. Dopo che la resina epossidica ha curato, fissare bene-sezione del cavo porta ad ogni lato del piezoceramico, saldando con un saldatore messa a punta, rendendo più breve contatto possibile con il piezo per evitare thermally de-polarizzante esso. In alternativa, utilizzare un adesivo conduttivo per incollare fili al piezo.

Figura 2
Figura 2. Fluidic tagliere, Chip di montaggio, e World-a-Chip Interface. Foto di (a) il chip microfluidico acustica (dimensioni esterne di 70 × 9 × 1 millimetro) con cavi di legare piezoelettrico trasduttore collegato, che mostra tre passaggi della separazione canale giù il circuito, (b) raccordi fluidici personalizzate e componenti dei tubi lavorati per l'interfaccia chip-to-mondo, (c) il chip montato alla parte inferiore della basetta fluidico con staffe, attraversa un'apertura nella basetta per consentire ventola di raffreddamento, (d) una vista dall'alto della basetta con connessioni tubi collegati e ventola di raffreddamento, e (e) una schematica in sezione trasversale dei raccordi che interfaccia il tubing con il chip microfluidico montato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Dispositivo di montaggio e World-To-Chip Interfacciamento
    1. Attaccare chip al "basetta fluidico" (un piatto con una griglia di regolarmente distanziati filettati fori passanti) con staffe. Allegare una ventola di raffreddamento per la basetta di regolare la temperatura nel corso di esperimenti acustici (vedi figura 2).
      NOTA: funzionamento senza ventola di raffreddamento a tensioni tipiche unità aumenta la temperatura del dispositivo a 70-80 ° C. Questo sposta notevolmente la frequenza di risonanza a causa della velocità del suono modificato nel liquido, e può avere un impatto negativo sulla capacità vitale delle particelle biologiche in corso di elaborazione.
    2. Avvitare connettori truciolo-mondo, precedentemente descritto altrove 22 e mostrato nella figura 2. Unire questi itubi nterface per tubi aggiuntivo alle entrate e le uscite che utilizzano standard di ¼ "-28 sindacati per 1/16" tubazioni.

4. Caratterizzazione di Acoustic performance messa a fuoco

NOTA: Componenti del sistema necessari per la caratterizzazione acustica messa a fuoco sono raggruppati nella lista dei materiali. I passi 4.1 e 4.2 di seguito si riferiscono a tutto il dispositivo di base utilizzato con questa piattaforma, che i passi successivi descrivono operazioni specifiche per il dispositivo acoustofluidic discusso qui.

  1. Configurazione di sistema
    1. Montare il chip microfluidico utilizzando connessioni mondo-to-chip sulla basetta fluidica, come descritto nella Sezione 3. Effettuare i collegamenti utilizzando tubi (ad esempio 1/16 "tubo fluoropolimero diametro esterno) ad una pompa e di raccolta del fluido fiale. Montare la basetta sul palcoscenico di un microscopio in grado di imaging di fluorescenza dotato di una fotocamera CCD.
    2. Collegare lunghezze di piccolo diamete internar (ID) tubo (0,006 "è consigliato) immediatamente dopo il chip (vedere Figura 4) per servire come limitatori di flusso, che stabilizzano il sistema e controllano la scissione flusso tra i punti di chip. Utilizzare tubi ID più grandi, come 0.01 "o 0,03", per tutti gli altri collegamenti.
      1. Stima il flusso idrodinamico resistenza R h di ciascun pezzo di tubo di lunghezza L e diametro interno D usando l'equazione R h = 128 ml / πD 4, dove μ è la viscosità dinamica del fluido. La caduta di pressione Δ P a causa di ogni tratto di tubo ad una data portata Q è dato da Δ P = QR h.
      2. Scegliere un rapporto di lunghezze limitatore per dividere il flusso tra le prese come appropriato per essere utilizzato il metodo di separazione. Separazione ottimale con i chip acustiche a questo protocollo richiede un SPO: rapporto tra il flusso di LPO approssitamente 65: 35%.
      3. Scegliere la lunghezza dei limitatori di flusso di uscita in modo tale che la loro resistenza fluida è almeno 3-4 volte più grande della resistenza totale nel resto del sistema (opportunamente riassunta in serie o in parallelo). Per il dispositivo acoustophoresis utilizzato in questo lavoro, le lunghezze dei tubi di 35 e 65 cm per la LPO e SPO sono adatti.
        NOTA: Una particolare attenzione deve essere data alla R h di qualsiasi Device Core microfluidica. Per il nostro acustica concentrandosi circuito integrato in questo lavoro, R h è bassa a causa delle sue dimensioni relativamente grandi canali, così le resistenze dei tubi collegati facilmente superi esso. Per i dispositivi con dimensioni di canale più piccole, la resistenza del chip può dominare il resto del tubo sistema, nel qual caso progettazione e controllo di on-chip canale R h è una considerazione aggiuntiva durante il Passo 1 di questo protocollo. Principi di progettazione dettagliati e linee guida sono disponibili in letteratura. 23,24
  2. Verifica del sistema
    1. Controllare eventuali perdite per verificare che il dispositivo a microfluidi non ha difetti e tutti i collegamenti dei tubi sono sigillati. Erogare acqua attraverso i tubi di ingresso, se necessario con una siringa e monitorare qualsiasi fuoriuscita di fluido nel canale principale.
    2. Erogare un volume noto attraverso il chip, e misurare i volumi raccolti dalle uscite per garantire che il rapporto di flusso è come previsto. Deviazioni dal rapporto di volume previsto possono indicare blocchi nel uno dei punti vendita o connessioni perdite.
      1. Per mantenere la pulizia del sistema e prevenire l'intasamento a livello dell'intero sistema (tubi fluidica e chip) con soluzioni detergenti appropriati (ad esempio, candeggina, etanolo, acqua) prima e dopo l'esecuzione qualsiasi esperimenti.
      2. In caso di zoccoli o blocchi in uno dei punti vendita, lavare l'impianto, mentre collegando la chiara presa di corrente per eliminare il blocco. Se ciò non dovesse funzionare, invertire la direzione del flusso durante il lavaggio,applicando opzionalmente rapidi impulsi di flusso inverso (utilizzando una siringa ad azionamento manuale). Infine, se il blocco ancora non può essere rimosso, sostituire il tubo o chip, come necessario.
  3. Frequenza Impostazione scansione per messa a fuoco Acoustic
    1. Riempire il canale di bypass (vedi figura 1) con liquido come acqua deionizzata, etanolo, o tampone fosfato salino (PBS) per iniezione manuale con una siringa. Si noti che questo fluido non viene a contatto con il campione in lavorazione. I dettagli di regolazione della posizione di nodo utilizzando diversi fluidi di bypass sono descritte altrove 16,17. In breve, se il nodo deve essere più vicina alla parete divisoria, utilizzare un fluido bypass bassa densità, come etanolo; per il posizionamento di nodo più vicino al flusso di campione di ingresso, scegliere un fluido più denso, come ad esempio una soluzione di glicerolo.
    2. Fare una soluzione perlina di circa 0,01% (w / v) 5-8 micron perle di polimero fluorescenti sospesi in tampone PBS con quali0,05% Tween-20 e riempire la siringa ingresso del campione con la soluzione tallone. Riempire la siringa ingresso buffer con lo stesso tampone (questo non deve essere lo stesso fluido nel canale di bypass). Si noti che, in generale, il buffer è scelto in funzione dell'applicazione (vedere il punto 5.1).
    3. Con la basetta fluidico sul palco microscopio, concentrarsi approssimativamente a metà strada nella profondità del canale in una regione di canale rettilineo appena prima la presa con entrambi i canali (separazione e bypass) nel campo di vista. Un angolo obliquo fonte di luce esterna supplementare può essere richiesto di rendere le pareti del canale visibile, per il post-trattamento di successo dei dati di immagine.
  4. Frequenza automatica Scansione e Acquisizione Immagine
    1. Effettuare i collegamenti elettrici utilizzando cavi schermati (ad esempio, RG-58 dotato di connettori BNC) ad un generatore di funzione con radiofrequenza (RF) amplificatore per fornire il segnale di eccitazione al trasduttore piezoelettrico. Facoltativamente, collegare un oscilloscopio al'uscita del generatore di funzione per monitorare la tensione effettiva applicata al trasduttore.
    2. Accendere la ventola di raffreddamento, e impostare il generatore di funzioni tale che l'uscita dell'amplificatore RF al trasduttore piezoelettrico è nella gamma di 12-25 volt picco-picco (Vpp).
    3. Impostare entrambi siringhe a parità di portata tra 50 e 200 microlitri / min. Utilizzando una pompa singola siringa per guidare entrambe le siringhe con lo stesso motore si consiglia di ridurre al minimo le perturbazioni al flusso.
    4. Eseguire una procedura di scansione delle frequenze specificando le frequenze di inizio e fine, la dimensione del passo tra i valori di frequenza e la tensione di sistema piezoelettrico con un laboratorio di automazione toolkit come LabVIEW di National Instruments.
    5. Ad ogni passo di frequenza, applicare la tensione per 15 secondi per consentire al sistema di equilibrare, quindi acquisire 10 immagini di perline che scorrono attraverso il chip per la successiva analisi (tempi di esposizione tra 10 e 100 msec sono raccomandati).
    6. Tra each applicato passo di frequenza, spegnere la tensione per circa 20 secondi per lasciare le perline ridistribuire in modo uniforme attraverso il canale e rimuovere pregiudizi nella messa a fuoco dal passo di frequenza precedentemente applicato.
  5. Image Analysis per determinare la frequenza di risonanza e di messa a fuoco di posizione
    1. Eseguire uno script di analisi di immagine (come lo script AF_freqScanPlotter.m MATLAB fornito con questo protocollo) e immettere le informazioni richieste ai prompt: selezionare l'elenco dei file di immagine generati al punto 4.4, inserire l'avvio della scansione e smettere di frequenze e dimensione del passo, l'intera larghezza del canale, la posizione della parete, e infine selezionare l'area di immagine di analizzare, comprendente sia la separazione e canali di bypass.
    2. Osservare la media sceneggiatura analisi l'insieme delle immagini catturate ad ogni passo di frequenza, e la media i valori di intensità lungo la direzione del flusso. Ciò si traduce in una sezione trasversale a scansione lineare di intensità di fluorescenza.
      NOTA: La frequenza corrispondente alla highe intensità st è definita come la frequenza di risonanza (Figura 3, riga centrale), e la posizione nel canale in cui si verifica la massima intensità è la posizione di messa a fuoco (figura 3, riga inferiore).

Figura 3
Figura 3. Scansione Frequenza Rappresentante. Esempio di dati di scansione di frequenza per ben accoppiato (A) e mal accoppiati (B) piezo e chip. Riga superiore: intensità fluorescente perline (rosso rappresenta alto, e blu rappresenta bassa intensità). Fila centrale: la massima intensità ad ogni frequenza. Fila inferiore: posizione di massima intensità, dove la linea tratteggiata rossa indica predisse la posizione di messa a fuoco, e diamanti rossi indicano frequenza di risonanza, come determinato dal l'intensità massima.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. separazione automatizzata

NOTA: L'esperimento di separazione automatizzata viene eseguito per separare le particelle più grandi da piccole particelle a causa delle acustiche focalizzazione forze dipendenti dalle dimensioni applicate nel chip microfluidica. I componenti del sistema richiesti sono raggruppati nella lista dei materiali.

  1. Configurazione del sistema e preparazione del campione
    1. Collegare il chip microfluidico alla pompa a siringa, valvole di selezione multi-porta computer controllati, flussometri PC interfacciato, e tubi, come mostrato nella figura 4. Questa configurazione consente di automatizzare l'elaborazione dei campioni attraverso il chip di separazione microfluidico, nonché automatizzate passi pulizia tra esperimenti per rimuovere la contaminazione incrociata e campione riporto.
    2. Utilizzare un tampone campione adatto per le cellule o particelle da separare, o come richiesto dal saggio di analisiessere utilizzato dopo la separazione. Come nel passaggio 4.3.2, il buffer di recupero (ma non necessariamente il fluido bypass) devono corrispondere il fluido campione.
      NOTA: Eventuali tamponi acquosi tipicamente usati con campioni biologici (ad esempio, PBS) hanno proprietà acustiche simili all'acqua e non apprezzabilmente modificare le prestazioni del dispositivo acustico. È possibile l'utilizzo di fluidi campione con densità e viscosità significativamente diverso da acqua, ma consigliato solo per gli operatori con una significativa esperienza acoustophoresis.


Figura 4
Figura 4. Acoustic configurazione del sistema per esperimenti di separazione automatizzati. Le linee blu risalire al canale di flusso principale attraverso il sistema. Tutte le linee verdi e nere sono 0,03 "di diametro interno (ID) tubi, e tutte le linee blu e di colore grigio-sono 0.01" tubi ID, con l'exception delle bobine in possesso, che sono 0,03 "ID, ed i limitatori di flusso, che sono 0.006" ID. Le siringhe sono riempite con tampone, e le bobine di tenuta avere un volume sufficiente (550 ml) per prevenire l'assorbimento di eventuali campioni o reagenti di pulizia nelle siringhe. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Separazione Procedura
    1. Stato pre-run. Prima di eseguire la separazione, in modo che i contenitori per reagenti pulizia (candeggina, etanolo, tampone) hanno sufficiente liquido, i serbatoi dei rifiuti non sono pieni, e le linee fluide sono pronti (cioè riempita di soluzione). Se quest'ultima condizione è incerta, o se il sistema viene eseguito per la prima volta dopo minimo (ad esempio, la prima volta in un dato giorno), eseguire un procedimento di pulizia automatica (vedi punto 5.3). Set Valvole 3 e 4 presso i punti di chip a scorrere sprecare Reservoirs inizialmente.
    2. Accendere la ventola di raffreddamento, e impostare il generatore di funzioni alla frequenza di risonanza per il chip acustico utilizzato, come determinato nel passo 4.5. Regolare il set di tensione punto sulla generatore di funzioni in modo che le uscite degli amplificatori RF tra i 12 ei 25 V pp, a seconda dei casi per la separazione desiderata.
    3. Collegare l'ingresso fiala del campione, buffer di ingresso Vial, ed appropriate fiale di raccolta per il sistema. Appena prima di fissare la fiala di input di esempio per i suoi tubi pick-up, vortex brevemente fiala di ri-sospendere eventuali particelle che possono essere regolati. Quindi, fissare il flaconcino e avviare la procedura di separazione senza indugio.
      ATTENZIONE: Se il campione da trattare contiene agenti potenzialmente infettivi, i flaconcini devono essere di tipo vite-top, a mantenere un sistema sigillato e prevenire campione aerosol. Inoltre, quando si lavora con materiali a rischio biologico, gestire tutte le fiale e tubi mentre indossa la dispositivi di protezione necessari e con il reqControlli pericolo uired e le procedure per il Gruppo Rischio Biologico e biosicurezza livello adeguato al materiale. Consultare le politiche e protocolli istituzionali in caso di incertezza.
    4. Utilizzare un programma in un toolkit automazione di laboratorio per controllare le valvole, sensori di flusso e pompa per effettuare la procedura completamente automatica di separazione.
      NOTA: La routine commuta le valvole, aziona il ritiro pompa a siringa e di infusione, e monitora il flusso dati del sensore per temporizzare correttamente la raccolta di frazioni campione di uscita. I passi principali sono riassunti qui di seguito in 5.2.4.1 attraverso 5.2.4.3, come se effettuata manualmente.
      1. Primo il tubo pickup. Prelevare circa 15 microlitri dall'ingresso Sample Vial per riempire completamente il tubo di collegamento alla valvola 1. Contemporaneamente, il primo il tubo di collegamento Vial buffer di ingresso alla valvola 2. In modo simile, l'ingresso dell'aria primaria di valvola 1 per garantire che essa non contiene fluido. Infine, passare Valvole 1 e 2 di espellere perdere altroliquidi in eccesso o l'aria che è entrato nella bobina di carico.
      2. Caricare la bobina di esempio, come illustrato nella figura 5a. Una sequenza di carico tipico per l'elaborazione di un campione di 250 microlitri è di ritirare 25 microlitri di aria a 50 microlitri / min, quindi 250 ml di campione a 200 ml / min, seguiti da 35 ml di tampone di primo piano a 200 microlitri / min, ed infine altri 25 ml di aria a 50 ml / min.
        NOTA: Tutti i volumi e le portate sono selezionabili dall'utente. Si noti che questa sequenza di caricamento è in ordine inverso di come i tappi fluido fluirà attraverso il dispositivo di separazione.
      3. Iniziare l'infusione del campione. Impostare le pompe a siringa per infondere i tappi dei fluidi caricati alla velocità desiderata (in genere 100 l / min). Monitorare le portate del SPO e LPO con sensori di flusso per garantire che il flusso è costante e nel rapporto determinato al punto 4.1, e non si è verificato che l'intasamento.
      4. Raccogliere le frazioni separate. Quando i sensori di flusso rilevano un picco di velocità di flusso, indicando paSsage del primo traferro, commutare la valvola di uscita corrispondente dai rifiuti (dove è iniziato nel passaggio 5.2.1) in una fiala campionario.
      5. Dopo passaggio del campione dal chip, osservare il sensore di flusso rileva la seconda traferro. A questo punto, cambiare le valvole d'uscita di nuovo per i rifiuti. Dopo il volume pieno caricato dal punto 5.2.4.2 viene erogato, interrompere l'infusione pompa a siringa e terminare la routine di automazione quando la portata raggiunge lo zero.
    5. Dopo l'esperimento di separazione è completa, scollegare il SPO e fiale di raccolta dei campioni LPO e conservarli in modo appropriato per successive analisi.
  2. Automated Pulizia e decontaminazione
    NOTA: Prima di lavorare ogni campione, filo e decontaminare l'intero sistema fluidica con la seguente procedura automatizzata.
    1. Fissare la SPO e tubi di raccolta fiala LPO, così come la provetta di prelievo in flaconi vuoti per raccogliere soluzioni di pulizia in eccesso che saranno svuotate through i tubi.
    2. Avviare la routine di pulizia del sistema automatizzato. Come per la procedura di separazione automatizzata nel passo 5.2, il programma dovrebbe controllare le valvole e pompa a siringa in modo sequenziale caricare la bobina tenuta con reagenti di pulizia, e lavare attraverso il sistema.
    3. Eseguire la seguente procedura di pulizia: a filo con il 10% di candeggina, poi con il 70% di etanolo, e terminare con acqua o un buffer salino appropriato (ad esempio, 1x PBS o buffer utilizzato per l'elaborazione del campione). Utilizzare i seguenti volumi: a filo 450 microlitri di candeggina e l'etanolo, e 1.000 microlitri per acqua / buffer.
    4. Durante le fasi di scarico, lavare ogni reagente in SPO mentre la valvola di scarico LPO è impostata su una porta bloccata, poi viceversa, per rimuovere eventuali ostruzioni potenziali nei restrittori di flusso di uscita. Mantenere ritiro e portate infusione tassi di 300-500 ml / min per ridurre al minimo la generazione bolla nel tubo e contropressione accumulo quando sia SPO o il LPO è bloccato.
    5. DISCArd le soluzioni di lavaggio in eccesso e le fiale in cui essi raccolti seguendo procedure appropriate per la gestione dei rifiuti biologici o chimici.

Representative Results

Le caratteristiche principali del disegno dispositivo acustico-microfluidica sono evidenziati in Figura 1, e descritte dettagliatamente altrove. 15 In breve, side-by-side due correnti di fluido flusso in un canale di separazione, separato da un canale di bypass in parallelo da una parete sottile di silicio. Poiché il primario forza di radiazione ampiezza scale con volume di particelle, le particelle più grandi migrano dal flusso di input mista campione verso il nodo di pressione acustica situata nella corrente fluida recupero adiacenti, mentre le piccole particelle rimangono nel flusso originale (Figura 1B, C). Il suddivisa architettura a due canali migliora separazione delle particelle 17 e permette la regolazione della posizione nodo utilizzando diversi fluidi canale di by-pass. 16 Il tagliere fluidica e infissi fornisce una solida piattaforma per mondo a scheggiare le connessioni, e il design modulare consente un rapido cambio tra i chip fluidici (Figura 2). Questo cONFIGURAZIONE permette altresì collegamenti del fluido reversibili, che sigillano fino a 1000 psi, da effettuare in modo rapido e affidabile (Figura 2B, E).

I risonanti res frequenza f di un chip può essere stimata utilizzando semplici calcoli analitici 1D (fare riferimento al punto 1.1.1). Da un modello più completo 2D agli elementi finiti del nostro dispositivo sezione 16, la posizione del fuoco previsto per 2 nodi risonanza è 225 micron dalla parete e la frequenza attesa è 1.68 MHz. Tuttavia, res f di dispositivi reali può variare di ± 100 kHz, a seconda della temperatura di funzionamento e l'accoppiamento di risonanze longitudinali e laterali. Pertanto, dopo il montaggio del dispositivo, res f devono essere verificate empiricamente a portate rilevanti e le tensioni di unità piezoelettrica, come descritto al punto 4 del protocollo. La figura 3 mostra le scansioni di frequenza rappresentante prese a 200 ml / min, con acqua in principali e bypass canali, e 20 V pp fornita al piezo. Quando l'accoppiamento tra il dispositivo e piezo microfluidi è buona, particelle si concentrano strettamente alla frequenza di risonanza, causando un picco dell'intensità fluorescente e migrazione verso la posizione di messa a fuoco atteso (Figura 3A). Al contrario, quando vi è scarsa accoppiamento, particelle si concentrano bene ei risultati di scansione di frequenza saranno simili alla Figura 3B. In tali dispositivi, il trasduttore piezoelettrico può essere necessario ri-montato, se è stato usato un adesivo reversibile; altrimenti il ​​dispositivo non è adatto quando l'alta qualità di messa a fuoco o flusso veloce sono fondamentali per l'applicazione richiesta. I dati della figura 3 informano la scelta della frequenza di funzionamento per esperimenti successivi, e la tensione e campo di portata disponibili per la separazione di particelle efficiente.

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Figura 5. di trattamento automatizzato di Campione. (A) Schema di campione caricato nella bobina campione. (B) profilo del flusso Rappresentante di un esperimento di successo di separazione. (C) Portata profilo da una separazione eseguire durante il quale l'uscita SPO intasato a circa 220 secondi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo aver identificato chip che sono separatori efficaci, sono incorporati nel sistema illustrato nella figura 4. Totale sistema cilindrata viene minimizzato usando tubi con 0.01 "diametro interno lungo il percorso di flusso principale (linee blu). Figura 5A illustra il make-up una spina di campione tipico infuso attraverso il sistema. Una piccola quantità di "leader cuscinetto" (~ 35 ml) è necessario per precede il campione nel flusso per eliminare fluttuazioni di flusso mentre il campione si muove attraverso il chip di separazione. La figura 5B mostra i dati di flusso risultanti da un esperimento separazione acustica automatizzato successo. Caratteristiche principali di una corsa di successo includono: (1) un aumento transitorio della portata sia nel LPO e SPO come pressione aumenta e fluido inizia a fluire attraverso il sistema, (2) un picco tagliente che indica il passaggio di una bolla d'aria (il inserto mostra un profilo esteso di una singola bolla), che dovrebbe raggiungere la SPO prima della LPO dovuta al flusso disuguale dalle due uscite, (3) stabile flusso attraverso entrambe le uscite tra le due bolle di aria mentre il campione si muove attraverso il sistema, e (4) una graduale diminuzione della portata in entrambe le uscite dopo che il volume totale del campione viene consegnato al sistema. Piste problematici sono immediatamente evidenti dai profili di flusso simile alla Figura 5C, qualora risulti che la SPO diventato intasato dopo circa 220 secondi. In thi s caso, una procedura di pulizia simile a quello descritto nella Fase 5.3 deve essere eseguito per sbloccare il canale.

Figura 6
Figura tunability 6. Dispositivo: dimensione delle particelle ed effetti di tensione. Percentuale di microsfere di polistirene estratti nel LPO dipende dalla dimensione delle particelle e la tensione fornita al piezoceramico. Ogni riga corrisponde ad una tensione di esercizio diverso alla frequenza di risonanza, determinato come descritto al punto 4. portata totale attraverso il dispositivo è di 200 ml / min, con frequenze di trasmissione applicata tra 1,62 e 1,64 MHz. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di almeno tre esperimenti separati. Riprodotto e modificato con il permesso di The Royal Society of Chemistry da http://pubs.rsc.org / it / Contenuti / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La figura 6 mostra compilati separazione è il risultato utilizzando varie granulometrie polistirolo e piezo guida tensioni che dimostrano i parametri di funzionamento necessari per la separazione efficiente. In generale, tensioni superiori (cioè maggiori forze acustici) sono necessari per estrarre le particelle più piccole, come previsto. Tensioni unità non può essere a tempo indeterminato aumentati, però, a causa di una maggiore dissipazione del calore e crescenti effetti di streaming acustico. 13 La trama serve come guida generale per particelle dimensioni separazione delle particelle che mostrano il recupero significativamente diversa ad una tensione un'unità specifica (ad esempio, 10- e le particelle a 2 micron a 8.8 V pp) si separeranno bene. In generale, le popolazioni di particelle con una grande differenza di dimensioni, come ad esempio i virus (~ 100 nm) e le cellule (~ 10 micron) possono essere separati rapido ed efficiente, così come le cellule di diffdimensioni erenti (ad esempio, 6-8 micron eritrociti discoidali e 8-15 micron leucociti). Le condizioni specifiche necessarie per lavorare con altri tipi di cellule devono essere determinato empiricamente, come forma delle cellule, densità e compressibilità influenzare il contrasto acustica, oltre alla dimensione della cella. A tal fine, le procedure nel passaggio 4 sono utili per determinare condizioni di separazione utilizzabili per qualsiasi nuovo tipo cellulare o particelle, e non solo per valutare la qualità di un particolare dispositivo acoustophoresis.

Figura 7
Figura 7. La separazione efficienza di Cell-Virus campioni addizionati. Separazione è il risultato di (A) Raji cellule addizionati con il virus Dengue (DENV) e (B), le cellule Raji e cellule renali Boa a spillo con il Golden Gate Virus (GGV). Percentuali raccolti sono definiti come la frazione di virus o cellule in uscita da una specificaoutlet rispetto alla quantità totale in uscita dal chip. Le barre di errore per (A) sono la deviazione standard di 3 studi, mentre i campioni in (B) sono stati trattati solo una volta a causa delle basse quantità disponibili. 1x PBS è stato usato come fluido tampone campione e recupero, con acqua nel canale di bypass per tutti gli esperimenti. Frequenze di funzionamento di chip erano compresi tra 1,60 e 1,64 MHz, con tensioni di unità tra i 16 ei 20 V pp. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Per dimostrare l'utilità di questa piattaforma per la separazione di particelle biologiche, in primo luogo abbiamo usato per processare campioni biologici ben caratterizzati: cellule Raji umane (10 5 cellule / ml, diametro medio 8-10 micron 25) narcotizzati dai virus della dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diametro approssimativo di 50 nm 26). Figura 7A mostra la percentuale di cellule Raji e DENV raccolti sia nel SPO e LPO (definito come la frazione di ciascun tipo di particella raccolti da ogni uscita rispetto alla quantità totale di ciascuna particella raccolti dal chip). L'esperimento è stato ripetuto in triplicato, e cellule Raji sono stati quantificati usando un contatore Coulter, mentre DENV stata quantificata utilizzando una trascrizione inversa polymerase chain reaction quantitativa (RT-qPCR).

Successivamente, le prestazioni del sistema è stato testato in uno scenario che è più realistico per la lavorazione di campioni clinici, in cui le caratteristiche fisiche delle particelle esatte possono essere sconosciuti, e le quantità di campione disponibili sono inferiori. Qui, abbiamo valutato la separazione del virus golden gate recentemente identificati (GGV), un serpente patogeno di infettare cellule renali boa constrictor. 27 La dimensione della particella virale GGV non è ancora stata misurata, ma dal momento che GGV appartiene alla famiglia Arenaviridae, esso è probabile di undimensioni simili, tra 100 e 150 nm. 28 Abbiamo elaborato campioni GGV spillo (10 4 pfu / ml) in cellule Raji umane (e non un obiettivo di infezione per il virus), e le cellule boa renali (bersaglio dell'infezione per GGV, dimensione approssimativa 10 27 micron), con entrambi i tipi di cellule a 10 4 cellule / ml. Poiché questi campioni erano disponibili in piccole quantità, separazione è il risultato di un solo periodo sperimentale sono riportati in questo lavoro. La figura 7B mostra la percentuale di cellule Raji, cellule Boa, e GGV raccolti da SPO e LPO. Le cellule sono state quantificate in questi esperimenti contando su un emocitometro e virus sono stati quantificati mediante RT-qPCR.

Discussion

Questo protocollo presenta l'integrazione a livello di sistema di dispositivi microfluidici per attrezzature macroscala per eseguire l'elaborazione automatizzata campione biologico. La modularità di questa piattaforma permette di essere adattabile a qualsiasi dispositivo flusso continuo, e, come esempio, il protocollo presentato concentra sulla caratterizzazione e ottimizzare le prestazioni di un dispositivo di separazione delle particelle acoustofluidic. Tre grandi vantaggi di questo protocollo sono evidenziati: (i) la modularità e chip-to-mondo interfacciamento, (ii) caratterizzazione affidabile di prestazioni del dispositivo, e (iii) il trattamento automatizzato dei volumi di campione precisamente misurate per la separazione di particelle.

io. Modularità e chip-to-mondo interfacciamento

Come mostrato in Figura 2, il chip microfluidico è montato su una basetta per misura facilmente su un palco microscopio per l'osservazione diretta. Il tagliere contiene # 6-40 fori filettati UNF su una griglia di 5 mm a passo, enabling il chip da fissare, e le connessioni del fluido da effettuare. Le connessioni del fluido sono PEEK tubi con estremità lavorate, che tenuta contro il chip fluidico con una gomma faccia guarnizione di tenuta e un collare di acciaio inossidabile. Questo schema interfaccia rende per una facile sostituzione di chip e rapida riprogettazione dispositivo, che richiedono poche o nessuna modifica al altri componenti del sistema, impronte di chip forniti conformi al formato griglia. Ad esempio, abbiamo utilizzato questa piattaforma con chip microfluidici per elettroforesi a flusso continuo, lisi cellulare termico, 29 rapida miscelazione di reagenti per la sintesi chimica, e la cattura cella singola e interrogatori.

ii. Caratterizzazione robusta di prestazioni del dispositivo

Per ottimizzare le prestazioni di qualsiasi dispositivo di separazione microfluidi, il suo funzionamento deve prima essere accuratamente caratterizzata. Il sistema qui descritto supporta lo sviluppo di protocolli rapidi e automatici per farlo. Per il examp specificale di dispositivi acustici di messa a fuoco, la qualità di messa a fuoco, la frequenza di funzionamento, e la posizione delle particelle focalizzate nel canale microfluidica deve essere misurato per ogni singolo dispositivo. Queste misure richiedono spazzare attraverso una gamma di frequenze di trasmissione piezoceramico, tensioni e portate, per identificare le combinazioni ottimali dei parametri per la separazione di alta qualità. Il protocollo presentato varia automaticamente questi parametri sintonizzabili e cattura pertinente Data-ie, immagini fluorescenti di particelle che scorre nel canale che sono post-elaborati per generare le misure delle particelle richiesti focalizzazione qualità, frequenza, e la posizione (figura 3).

Caratterizzazione completa delle prestazioni del dispositivo acustico richiede passaggi ripetuti 4.4 e 4.5, se necessario in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, la posizione di messa a fuoco assoluta di un chip è trovato eseguendo la scansione di frequenza a portate relativamente bassa e alta tensiones per garantire una completa migrazione alla posizione di nodo. Inoltre, tali scansioni frequenza possono valutare la qualità del montaggio del dispositivo (quando eseguito con perle di polistirene di dimensioni note), o per determinare come un tipo di particelle precedentemente sconosciuta si comporterà nel sistema (dopo un chip è stato caratterizzato con perline). Un chip con buon trasferimento di energia dal piezoceramico al canale microfluidico comporterà stretto focalizzazione a portate elevate (> 1 ml / min) e bassa tensione (12-15 V pp), mentre quelli con scarso trasferimento di energia non si concentrerà anche a basse portate (<100 l / min) e tensioni elevate (> 20 V pp). Abbiamo scoperto che il contatto intimo tra il chip microfluidica e piezoceramico è fondamentale per un efficiente trasferimento di energia nel fluido. Ulteriori analisi del metodo ottimale incollaggio del chip microfluidico e piezoceramico consentirà produzione affidabile di dispositivi ad alte prestazioni.

Infine, un completoimmagine di funzionamento di un dispositivo acoustophoretic può essere ottenuto combinando le misurazioni di scansione di frequenza basati su immagini di Fase 4 (e figura 3) con numeri di particelle raccolte dalla SPO e LPO come funzioni dei parametri operativi relativi, da esperimenti di separazione effettuate con microsfere , come descritto nel passaggio 5. Come mostrato in figura 6, una tale serie di esperimenti automatizzate può rapidamente caratterizzare le prestazioni di un singolo dispositivo e sintonizzabilità, informare l'utente dello spazio ottimale parametro per azionare il dispositivo per la separazione di particelle.

iii. Di trattamento automatizzato di piccolo-campione per la separazione di particelle

Per l'elaborazione del campione di successo e preciso basato su chip microfluidica, è fondamentale in modo affidabile e preciso metro, carico, consegnare, e raccogliere le quantità di liquidi che passano attraverso. Questa precisione è particolarmente importante quando il volume del campione è piccola(~ 0,1-1 ml), che è comune in laboratorio clinico o di ricerca. 30 precisa manipolazione del campione è impegnativo in esperimenti tradizionali microfluidici che impiegano ritiro manuale del campione in una siringa e l'infusione in un dispositivo senza valutazioni di quando il campione è stata separata e quando devono essere raccolti. Il protocollo presentato impiega automatizzato campione bobina di carico e erogazione accoppiato con feedback in tempo reale da sensori di flusso per consentire separazioni riproducibili di piccoli volumi di campione.

La Figura 5 mostra i profili di flusso misurata in SPO e LPO da un tipico esperimento separazione. Innanzitutto, portando tampone di almeno 35 microlitri viene caricato per garantire un flusso stabile prima che il campione raggiunge il chip acustica. Volumi di campione inferiori 100 pl non sono raccomandati per questa configurazione del sistema, perché diluizione del campione dovuta al buffer principale diventa eccessiva. Una spina di aria viene utilizzata all'inizio del the iniezione prima che il buffer porta per separare la spina campione dal fluido che segue, impedendo la miscelazione e la diluizione del campione e servire come indicatore per i sensori di flusso. Dopo un transitorio iniziale come fluido comincia a muoversi attraverso il sistema, segnali spike taglienti in entrambe le uscite indicano il passaggio del primo bolla d'aria. Questi transitori sono seguiti da un lungo periodo di flusso stabile come il campione scorre attraverso il sistema, poi un'altra punta quando la seconda bolla d'aria passa, e infine un eventuale calo di portata a zero dopo la pompa si ferma siringa.

Il passaggio delle spine aria attraverso i sensori di flusso viene utilizzato come punti di innesco per commutare le valvole per avviare e arrestare la raccolta del campione, riducendo così al minimo campione perduta e diluizione con volumi di fluido non-campione. Ciclo chiuso misurazione di volumi di campione trasformati elimina la necessità di riprogrammare questi valori prima dell'inizio dell'esperimento ogni campione in ingresso viene cambiato. Questa caratteristica èparticolarmente importante quando il volume del campione è limitato, per esempio nel caso di molti campioni clinici. Monitoraggio del flusso in tempo reale aiuta anche nella risoluzione dei problemi; una cattiva esecuzione (ad esempio, uno zoccolo formando in uno dei punti vendita) è immediatamente evidente dai profili di flusso risultanti, come nella figura 5b.

Per dimostrare la flessibilità e l'efficacia della separazione acoustofluidic utilizzando l'architettura del sistema presentato, DENV purificato e le riserve di virus GGV sono stati aggiunti in azioni di celle e separate da lavorazione attraverso il chip microfluidico. Figura 7a mostra che le cellule Raji erano ben separati-da virus, come 97 % di cellule Raji escono chip sono risultati essere in LPO, lasciando così un campione altamente arricchito di DENV nel SPO. In confronto, l'efficienza della separazione DENV era inferiore, con il 70% di DENV uscita del chip trovato nel SPO. Ciò può essere attribuito alla leggera miscelazione convettiva indotto dalle spire della Separatisul canale, ma più probabile che alcune particelle DENV migrano insieme con le cellule Raji nel LPO. Cellule che migrano lateralmente attraverso linee di corrente trascinano un fluido con loro, anche a basso numero di Reynolds. Con questo meccanismo, così come aspecifico adsorbimento superficie, particelle virali trasferire nella LPO. Tuttavia, il campione altamente arricchito di DENV nel SPO è un vantaggio significativo, per esempio quando de novo sequencing è utilizzato per rilevare e identificare i virus.

Figura 7b mostra che in una prova sperimentale, solo circa il 70% delle cellule Boa escono chip sono stati trovati nella LPO, rispetto a quasi il 100% di efficienza di separazione per cellule Raji. La differenza di prestazioni di separazione tra i due tipi di cellule può essere attribuibile a una dimensione più piccola o media densità inferiore di cellule Boa rispetto alle cellule Raji, quindi con conseguente forze acustiche più piccole. Per confermare o smentire queste ipotesi, le dimensioni, la densità e la morfologia di Boale cellule in sospensione (che normalmente crescere aderenti) di cellule Boa devono essere misurati con precisione, uno sforzo per ulteriori indagini. Negli stessi esperimenti, analogamente agli esperimenti con DENV, il grosso del GGV recuperato uscita dal SPO, indicando un arricchimento della frazione virale.

I dati presentati evidenziano le sfide inerenti di ingegneria piattaforme di ampia applicazione per l'elaborazione di una serie di campioni biologici. È importante sottolineare che le interazioni biologiche può cominciare a giocare come un grande ruolo gli effetti fisici e meccanici. Tuttavia, questi esperimenti preliminari dimostrano anche la potenza e la promessa di utilizzare questo sistema per la trasformazione dell'architettura campione applicazioni cliniche e di ricerca. Come un robusto sistema progettato, ben caratterizzato, questa piattaforma offre la possibilità di cercare le risposte alle nuove questioni scientifiche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

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References

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