Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

Immunology and Infection

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Assadian, F., Sandström, K., Laurell, G., Svensson, C., Akusjärvi, G., Punga, T. Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils. J. Vis. Exp. (105), e53374, doi:10.3791/53374 (2015).

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Abstract

Protocol

El protocolo describe el aislamiento de células linfoides de material de paciente humano y por lo tanto requiere una aprobación ética. El trabajo realizado en el presente estudio fue concedida por el Comité de Revisión Ética de Uppsala (. Dnr 2013/387).

1. Aislamiento de células mononucleares (CMN) desde Humanos Palatine amígdalas

PRECAUCIÓN: Todo el material no apantallado de origen humano como la sangre, tejidos o fluidos corporales debe considerarse como material potencialmente infectado. Por lo tanto, se deben seguir las prácticas de bioseguridad recomendadas para el manejo de los tejidos humanos.

Nota: Para evitar la contaminación, todas las soluciones y equipos de cultivo de células deben ser estériles. Todos los tampones y soluciones deben ser pre-enfriados y se mantuvieron en hielo. Tejidos de amígdalas y células aisladas se deben mantener y manipulados en hielo.

  1. Obtener amígdalas frescos de los pacientes sometidos a amigdalectomía o amigdalotomía (Figura 2). Sumérgete la Clum tejidops en un tubo de centrífuga de 50 ml lleno de solución salina enfriada con hielo estéril Hanks equilibrada (HBSS) suplementado con suero bovino fetal 5% (FBS), mM glutamina 10, 0,05 mg / ml de gentamicina y 1% mezcla de antibiótico-antimicótico (penicilina, La estreptomicina y anfotericina B).
  2. Mantenga los tubos con las muestras de tejido de las amígdalas sumergidas en todo momento en el hielo. Trate de procesar las amígdalas tan pronto como sea posible, y no más tarde de 3 horas después de la extirpación quirúrgica.
  3. Coloque la amígdala en una placa de cultivo celular de plástico de 60 mm en el hielo y mantener el tejido humedecido con HBSS. Retire los coágulos sanguíneos visibles, grasa y tejido conectivo con un limpio fórceps de la superficie de las amígdalas.
  4. Utilice una nueva placa de cultivo celular de 60 mm que contiene 5 ml de HBSS. Cortar el grupo tejido de las amígdalas en fragmentos 3-10 mm utilizando un par de tijeras estériles y / o un escalpelo.
  5. Prepare una nueva placa de cultivo celular de 60 mm que contiene 10 ml de HBSS y colocar un filtro de células de plástico de 100 micras en la solución de HBSS.
  6. Transfiera los dissfragmentos de amígdalas ejadas en el filtro de células con unas pinzas esterilizadas. Usando el extremo del émbolo de una jeringa de plástico, sin problemas exprimir los fragmentos de tejido a través del filtro de células. Asegúrese de que los fragmentos de amígdalas están totalmente inmersos en la HBSS.
  7. Desechar el filtro de células con los restos de tejido y transferir la suspensión de células resultante de la placa de cultivo celular 60 mm en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml. Deje el tubo en hielo mientras se procede con los pasos 1,8 y 1,9.
  8. En el caso de grandes amígdalas, de más de 2 cm de tamaño (Figura 2), apretar los fragmentos de la amígdala en dos coladores celulares para evitar la obstrucción de la malla en el colador.
  9. Obtener el volumen final de 35 ml de la suspensión celular.
    Nota: En este paso es posible preparar la suspensión de células para la crioconservación (ver sección 2).
  10. Añadir 10 ml de solución de gradiente de densidad de Ficoll como en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Superponer suavemente los suspens celularesion (paso 1.9) en la parte superior de la solución de gradiente de densidad. Evitar la mezcla de la suspensión de células y la solución por gradiente de densidad.
    Nota: La solución de gradiente de densidad tiene que ser calentado a la temperatura ambiente.
  11. Centrifugar la suspensión de células en un rotor oscilante a cabo a 700 xg durante 20 min a TA. No active la función de freno de la centrífuga como el frenado rápido puede perturbar el gradiente. Asimismo, el uso de la función de aceleración más bajo disponible en la centrífuga.
    Nota: Después de este paso de centrifugación, observe MNCs como una capa esponjoso blanco en la interfase, y los glóbulos rojos (GR), los fibroblastos y los restos celulares como el sedimento en el fondo del tubo.
  12. Recoger cuidadosamente la capa multinacionales utilizando una pipeta de 10 ml. Coloque la suspensión de células en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
  13. Añadir 25 ml de helado de PBS a la suspensión celular y hacer girar el tubo a 300 xg durante 5 min en un rotor basculante a 4 ° C.
  14. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta de 25 mly repetir sedimento celular lavado paso dos veces más. Finalmente resuspender el botón celular en 15 ml de PBS.
    Nota: Después de la etapa de lavado final, es posible criopreservar la suspensión de células (véase la sección 2).
  15. Aplicar 10 l de suspensión celular en la celda hemocitómetro cámara de recuento y contar el número de células bajo un microscopio. Dispensar la cantidad apropiada de células (por ejemplo, 2-3 de 7 x 10) en un tubo de centrífuga de 15 ml para la posterior separación de perlas magnéticas. Mantenga esta alícuota en hielo hasta el paso 3.2.

2. La criopreservación de células amigdalares

  1. Preparar medio de congelación (90% de SFB y 10% DMSO) y mantenerlo en hielo. Para el almacenamiento a largo plazo mantener a los medios de congelación a -20 ° C.
  2. Determinar el número total de células utilizando una cámara de recuento celular hemocitómetro (paso 1,15). Calcular la cantidad necesaria de medio de congelación de acuerdo con la densidad celular congelado deseado (por ejemplo, 10 7 célulass / ml de medio de congelación).
  3. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min. Decantar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y resuspender el sedimento celular en medio de congelación enfriado con hielo (del paso 2.1).
  4. Dispensar alícuotas de 1 ml de la suspensión celular en viales estériles diseñados para almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. Congele los viales en una cámara de isopropanol y almacenar a -80 ° CO / N. Para la conservación a largo plazo la transferencia de los viales en un nitrógeno líquido que contiene el tanque de almacenamiento o una C congelador celular -140 °.
  5. Para descongelar viales con células congeladas, calentarlas rápidamente en un 37 ° C baño de agua. Inmediatamente cuando se descongela, dispersar la suspensión celular en 10 ml de HBSS precalentado (con suplementos, paso 1,1) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar el tubo a 300 xg durante 5 min, eliminar HBSS y resuspender el sedimento celular en la densidad celular deseada en HBSS (con suplementos, paso 1.1).
    Nota: La viabilidad del af multinacionalesdescongelación ter es de importancia, ya que la presencia de células muertas disminuirá el rendimiento final de B y los linfocitos T purificados.
    Nota: De acuerdo a nuestra experiencia, la viabilidad celular a menos de 80% reducirá la eficiencia de aislamiento de células.

3. Selección positiva de linfocitos T Población de amigdalares multinacionales

Nota 1: Este protocolo se basa en la selección positiva de linfocitos humanos T CD3 + de MNCs amígdalas usando perlas magnéticas acopladas al anticuerpo CD3. Es posible iniciar esta sección de frescos (Sección 1) o los (Sección 2) las multinacionales congelados.

Nota 2: Comience con 3 x 10 7 multinacionales. No exceda este número de células, ya que las columnas de separación pueden obstruir y esto reducirá la eficiencia de aislamiento. Utilice columnas más grandes si se manejarán más células. Los volúmenes utilizados en este protocolo han sido experimentalmente optimizado para el número de células con nosotrosed en nuestra configuración experimental.

  1. Preparar el tampón de separación [PBS (pH 7,2), 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM]. Filtrar el tampón de separación a través de un filtro de 0,45 micras y almacenar a 4 ° C.
  2. Haga girar la suspensión multinacionales (paso 1,14) a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el sedimento resultante de células en 240 l (80 l por cada 10 7 células) de tampón de separación enfriado con hielo. Transferir la suspensión celular en un tubo de 2 ml estéril.
  3. Añadir 20 l de anticuerpo CD3 magnético a la solución de células. Incubar los tubos durante 1 hora a 4 ° C con mezclado suave continua para mantener las células en suspensión.
  4. Transferir todo de la suspensión celular en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de tampón de separación enfriado con hielo para lavar las células.
  5. Centrifugar el tubo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C en un rotor basculante.
  6. Mientras tanto configurar el separador y la columna magnética. Coloque el separador magnético para el soporte y colocar la columna en la SEPARator. Lavar la columna mediante la aplicación de 500 l de tampón de separación enfriado con hielo. Deseche el flujo a través.
  7. Coloque un nuevo tubo de extracción de 15 ml por debajo de la columna. Mantenga el tubo de recogida en el hielo.
  8. Descartar el sobrenadante (paso 3.5) mediante la pipeta y resuspender suavemente el sedimento celular en tampón de separación l 500. Aplicar la suspensión de células en la parte superior de la columna de pre-lavado y se deja correr a través.
    Nota: grupos de células pueden obstruir la columna y por lo tanto reducir la tasa de flujo. Para evitar este problema, coloque un filtro de células de plástico 40 micras en la parte superior de la columna. Pasando a través de las células esta malla será altamente mejorar la eficiencia de este método.
  9. Lavar la columna 4 veces con 1,5 ml de tampón de separación (500 l para 10 7 células). Esperar a que el depósito de la columna a estar vacía (sin líquido debe ser observado en la columna) antes de aplicar la siguiente etapa de lavado.
    Nota: Obtener las células no marcadas CD3, considerados como fracción de linfocitos B, ya que soneluyó en el tubo de recogida.
  10. Retire la columna del separador y el lugar en un nuevo tubo de extracción de 15 ml. Pipetear 2 ml de tampón de separación en la columna. Utilizando el émbolo suministrado con la columna eluir los linfocitos T seleccionados positivamente, que se consideran como la fracción de linfocitos T.
  11. Determinar el número de células purificadas (paso 1,15) si es necesario. Las suspensiones celulares están ahora listos para experimentos posteriores.

4. Análisis de citometría de flujo aislada amigdalar linfocitos B y T

PRECAUCIÓN: solución de paraformaldehído es irritante y carcinógeno. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección para los ojos / la cara.

Nota 1: Este protocolo describe el método para la tinción directa de las células T y B aislado por fluorescencia análisis de clasificación de células activadas (FACS). El propósito principal de este paso es evaluar la pureza de la célula aislada poblaciones after CD3 anticuerpo separación magnética. Para este propósito B establecido y marcadores de células T, los anticuerpos monoclonales CD20 conjugado con fluoróforo-FITC y CD2-APC, se utilizan. También la inclusión de anticuerpos de control de isotipo es muy recomendable para distinguir el "fondo" la unión no específica de los anticuerpos CD2 y CD20 (véase el paso 4.8).

Nota 2: Es posible para mantener las fracciones de células purificadas en una solución de paraformaldehído al 1% (PFA) en la oscuridad a 4 ° C hasta el momento de tinción (por ejemplo, día siguiente,.). También el mismo procedimiento es aplicable si hay un intervalo de tiempo entre la tinción y análisis FACS. Recuerde que en ambos casos las células deben lavarse adecuadamente con PBSA (PBS que contenía 0,2% de BSA) tampón, antes de la tinción o análisis FACS.

  1. Saque 6 x 10 6 células de las multinacionales del paso 1,15 (antes de aplicar a la columna), fracción de linfocitos B desde el paso 3.9 y fracción de linfocitos T a partir del paso 3.10.
  2. Haga girar la célulasuspensiones a 300 xg durante 5 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante.
  3. Eliminar el sobrenadante con pipeta y se lava el sedimento celular una vez con 1 ml de helado PBSA. Haga girar las suspensiones de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender el células en 600 l de tampón PBSA helada.
  4. Añadir 100 l de la suspensión celular a la parte inferior de un tubo de FACS.
  5. Añadir 100 l de PBS que contiene 10% inactivado por calor suero humano a cada tubo, mezclar bien e incubar durante ~ 1 min a RT o 20 min en hielo.
    Nota: los linfocitos B llevan receptores Fc. Con el fin de bloquear la Fc de receptores de células purificadas las fracciones se incuban con 10% inactivado por calor suero humano. El suero humano es inactivado por calor mediante incubación a 56 ° C durante 1 hr. Divida el suero inactivado por calor en pequeñas alícuotas y almacenar congelados a -20 ° C.
  6. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C en un swing de salida del rotor.
  7. Eliminar el sobrenadante con pipeta y se lava el sedimento celular con 1 ml PBSA. Repetir la centrifugación (300 xg durante 5 min a 4 ° C).
  8. Añadir 100 l PBSA en cada tubo en hielo. Añadir la cantidad apropiada de anticuerpo monoclonal conjugado con fluoróforo, de acuerdo con la recomendación del fabricante (por ejemplo, 20 l de anti-CD20 y / o 5 l de anticuerpos anti-CD2 en 100 l de PBSA). Nota: No se olvide de asignar tubos de control suficientes para el análisis FACS. En este protocolo los siguientes controles deben incluir: 1) células teñidas con los anticuerpos anti-CD2 y anti-CD20 de forma individual, 2) células teñidas con los anticuerpos anti-CD2 y anti-CD20 de control de isotipo de forma individual y, 3) células sin adición de anticuerpos.
  9. Brevemente vórtice del tubo y se incuba durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
  10. Lavar 2 veces con PBSA. Añadir 2 ml de solución de PFA al 1% a las muestras. Deje que las células permanecen en la solución de PFA al 476; C en la oscuridad hasta el momento del análisis FACS.
  11. Inmediatamente antes de ejecutar las muestras en la máquina de FACS, se lavan las células 2 veces con PBSA (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Resuspender las muestras en 1 ml de PBS y mantienen a 4 ° C (o en hielo), protegido de la luz, antes de la separación en el citómetro de flujo.
  12. Hacer la clasificación FACS siguiendo el protocolo del citómetro de flujo fabricante.

5. La detección por PCR de ADN Adenovirus en aislada amigdalar linfocitos B y T

Nota 1: Los hexón de adenovirus cebadores de genes son AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') y AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') 11. Estos cebadores generan un amplicón de 139 pb. El gen 18S rRNA anfitrión puede ser detectada con los cebadores tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') y tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). El tamaño de amplificación esperado es 300 pb.

Nota 2: Cada PCRplazo incluye un control negativo (destilada H 2 O) y un control positivo de ADN obtenido a partir de la línea de células B humanas (BJAB) infectados con adenovirus humano tipo 5 12.

  1. Extraer ADN (de al menos 1 x 10 6 células, paso 3.11), utilizando el método de purificación de columna basada membrana de sílice. Extracto de ARN usando fenol y solución de isotiocianato de guanidina 13.
  2. Añadir 100 ng de ADN de linfocitos B y T a una mezcla de reacción que contenía tampón 1x HF, 0,2 mM de mezcla de desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 0,25 M de cada cebador y 1 U de alta fidelidad de ADN polimerasa en un volumen total de 20 l.
  3. Realizar la amplificación por PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 30 seg de desnaturalización a 98 ° C, seguido por 30 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) durante 30 seg y 72 ° C durante 30 s. La reacción de PCR se terminó con una etapa de extensión final de 7 min a 72 ° C.
  4. Separar el amplif PCR resultanteicación productos en un gel de agarosa al 1,5% en 1x tampón TBE y visualizar las bandas esperadas por tinción con colorante de ácidos nucleicos.

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Representative Results

Una separación eficiente de las multinacionales tonsilares resultados en subpoblaciones altamente purificadas de los linfocitos B y T. Esto fue confirmado por análisis de FACS usando anticuerpos anti-CD2 anti-CD20 y para detectar linfocitos B y T poblaciones, respectivamente (Figura 3A). Por el contrario, una separación ineficiente de MNCs resultados en las fracciones celulares que son una mezcla de células de ambas subpoblaciones de linfocitos B y T (Figura 3B).

El aislado amigdalina B y linfocitos T (Figura 3a) son de una calidad suficiente para los análisis posteriores como el aislamiento de ácido nucleico. En el protocolo actual, el ADN y el ARN extraído de la linfocitos B y T se utilizan para la detección de ADN y ARN adenovirus celular. Los resultados muestran la detección específica de ADN de adenovirus en los linfocitos T de las amígdalas (Figura 4). También aislado ARN de amigdalar linfocitos B y T es de calidad y cantidad suficiente para downstrea aplicaciones m (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Descripción general del procedimiento de aislamiento de linfocitos amigdalar. Muestras de amígdalas palatinas son procesados ​​y multinacionales amígdalas están aislados de suspensión celular por gradiente de densidad de centrifugación. Linfocitos B y T se purifican en subpoblaciones por una selección positiva de la fracción de linfocitos T con anticuerpo magnética CD3 humano. Esta etapa de purificación permite evaluar más a fondo las fracciones de células aisladas; por ejemplo, para determinar si algunas especies virales se enriquecen dentro de cualquiera de las subpoblaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. removido quirúrgicamente amígdalas palatinas. Amígdalas eliminadas por la amigdalectomía (izquierda) y amigdalotomía (derecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Representante resultados FACS de las fracciones de células enriquecido. (A) hacia adelante frente a la dispersión lateral que muestra parcela B (CD20) y T (CD2) poblaciones de linfocitos en las amígdalas MNCs, los linfocitos T y las fracciones de efluente. La pureza de los linfocitos T y B en fracciones celulares enriquecidas es más de 90%. Puesto que las células B comprenden 92% de las células efluente total, esta fracción se denomina como la subpoblación de linfocitos B. (B) parcelas FACS que muestra la separación ineficiente de B y subp células Topulations, debido al número de no-optimizada de las multinacionales aplicadas a la columna y las etapas de lavado insuficientes. Aparte de la necesidad de células activadas por la clasificación magnética optimización, existe un alto fondo de CD2 - / CD20 -. Las células, lo que demuestra que la tinción FACS no está bien optimizado favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. PCR detección de ADN de adenovirus en las fracciones de linfocitos tonsilares. El ADN total se extrae de la linfocitos B y T aislado de la las amígdalas izquierdo y derecho de un paciente sometido a amigdalectomía. End-punto de PCR se lleva a cabo con 100 ng del ADN purificado. Carril 1: fracción de linfocitos B (B) de la amígdala izquierda; carril 2: fracción de linfocitos T (T) de la left amígdalas; carril 3: fracción de linfocitos B (B) de la amígdala derecha; carril 4: fracción de linfocitos T (T) de la amígdala derecha. ADN adenovirus (Ad) sólo es detectable en los linfocitos T aislados fracción. Celular 18S rRNA gen actúa como un control interno para mostrar la misma cantidad de ADN se utiliza para la reacción de PCR en todas las muestras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. ARN extraído de alta calidad aislado B y subpoblaciones de células T. El ARN total extraído de la citoplasmática B aislados y los linfocitos T se separó en un gel de agarosa al 1%. Carril 1: fracción de linfocitos B (B) de la amígdala izquierda; carril 2: fracción de linfocitos T (T) de la amígdala izquierda; carril 3: fracción de linfocitos B (B) de la amígdala derecha; carril 4:Fracción de linfocitos T (T) de la amígdala derecha. Patrón de migración de 28S rRNA, 18S rRNA y pequeños ARN se indica. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Uno de los factores más importantes que afectan a los resultados de este protocolo es el uso de material amigdalar fresco como el material de partida. Por lo tanto, las muestras de amígdalas deben procesarse dentro de 3 horas después de la cirugía. Las amígdalas pueden ser obtenidas de adultos y niños. El material amigdalar de los hijos es generalmente más pequeño debido a la extirpación quirúrgica parcial de las amígdalas (amigdalotomía). Por lo tanto, el número de MNCs obtiene a partir de muestras de amigdalotomía (1 x 10 7 10 8 -1 x) es menor en comparación con muestras de amigdalectomía (1 x 10 8 x 10 -2 9). Sin embargo, el proceso de aislamiento de células sería el mismo independientemente del tipo de cirugía.

Maximizar la pureza de las subpoblaciones de células obtenidas a partir de células magnético activado método de clasificación requiere un poco de optimización. La cantidad y el tiempo de incubación con anticuerpo CD3 magnético y el número de MNCs aplicó a la columna son los principales factores que deben ser optanimized. La aplicación de demasiadas células dará lugar a la obstrucción de la columna y el enriquecimiento ineficiente de las subpoblaciones de células. Durante la optimización de este protocolo, se encontró que la aplicación de más de 3 x 10 7 MNCs en la columna de separación causará una obstrucción de la columna y las siguientes fracciones de células impuras (Figura 3B). Por lo tanto, comenzando con 3 x 10 7 MNCs da fracciones de linfocitos así enriquecido con calidad y cantidad suficiente para la extracción de ADN y ARN (Figuras 4 y 5). Se espera que el número final de aislados linfocitos B y T para ser 1/2 x 10 5/7 x 7 y 10 6, respectivamente. Por lo tanto, el uso de 20 l de anticuerpo CD3 magnética por cada 3 x 10 7 MNCs parece ser óptimo para B éxito y de separación de linfocitos T (Figura 3A).

Un informe anterior ha establecido que los linfocitos B y T comprenden el 60-70% y el 30-40% de las multinacionales tonsilares respectivamente, mientras que otrostipos de células como los macrófagos, células asesinas naturales y células dendríticas constituyen el 1-8% de las MNCs amigdalina 14. Proporciones de células similares se obtuvieron con nuestro protocolo de aislamiento como se muestra por la inmunotinción de los linfocitos B y T con la técnica FACS (Figura 3A).

El número de etapas de lavado y el volumen de tampón de lavado son parámetros críticos para un buen resultado. Por consiguiente, el lavado excesivo hará que las células T CD3 de anticuerpos asociados magnético para terminan en el flujo a través, mientras que el lavado insuficiente reducirá la pureza de la fracción de células T.

Una vez que los pasos críticos en el protocolo están optimizados para el tipo de tejido y los análisis posteriores esperados, este método es simple, eficiente, sencillo y ahorra tiempo. Sin embargo, una limitación de este método es un costo relativamente alto de los reactivos de clasificación de células magnéticas asociado comerciales, lo que podría limitar la purificación a gran escala de tonsillar linfocitos B y T.

En resumen este protocolo proporciona una estrategia para la obtención de B y T subpoblaciones de las amígdalas palatinas y podría modificarse para aislar fracciones de células de otros tejidos como el bazo, el timo, ganglios linfáticos y sangre. Aplicamos aún más este método para demostrar que detectamos una infección por adenovirus específicamente en la fracción de células T amigdalar (Figura 4). Por lo tanto, este protocolo debe ser útil para una amplia área de aplicaciones, incluyendo estudios sobre las interacciones huésped-patógeno, citotoxicidad de células T, la activación de las células T, señalización celular y B y T de la superficie celular de expresión del marcador.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)  Gibco 14175-053 Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium 90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA  PBS containing 0.2% BSA
PFA PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix Gibco 15240-062
60 mm Petridish Nunc 150326
Dissecting foreceps Fisher Scientific 1381241
Straight iris scissors  Fisher Scientific 12912055
disposable scalpels Swann-Morton REF 0501
100 μm plastic cell strainer Corning Life Sciences 352360
40 μm plastic cell strainers  Corning Life Sciences 352340
2 ml plastic syringe BD Biosciences  300185
15 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62554502
50 ml conical centrifuge tubes SARSTEDT 62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque Sigma-Aldrich F5415-50ML Ficoll solution
Fetal calf serum Biological industries 040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO) SIGMA D2650-5X5ML
MACS MS columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-092-881
MACS separator (Octo MACS) Miltenyi Biotec 130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA) Merck Millipore 1120180100
EDTA AnalaR NORMAPUR 20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)  BD Biosciences  560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)  BD Biosciences  556632
Human serum  Rockland Immunochemicals D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F-530L
FACS tubes BD Falcon 352003
Cryotube SARSTEDT 72379
BD LSRII flowcytometer BD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 software BD Biosciences 
Nucleospin Blood  Macherey-Nagel 740951.50 DNA isolation kit
TRIzol  reagent Life technologies 15596 RNA isolation reagent
Hemocytometer The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030 cell counter device
GelRed Biotium 41003 Nucleic acid gel stain 

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References

  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

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