Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Moorthy, S. D., Mitchell, J. A. Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (110), e53552, doi:10.3791/53552 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Transkriptionella regulatoriska element är avgörande för spatiotemporala finjustering av genuttryck under utveckling en och modifiering av dessa element kan leda till sjukdom på grund av avvikande genuttryck 2. Många sjukdomsassocierade regioner som identifierats av genomet breda associationsstudier är i icke-kodande regioner och har funktioner för transkriptionsförstärkare 3-4. Identifiera förstärkare och matcha dem med de gener som de reglerar kompliceras eftersom de ofta ligger flera kilobaser bort från de gener de reglerar och kan aktiveras på ett vävnadsspecifikt sätt 5-6. Enhancer prognoser är vanligen baserade på histon modifiering märken, medlare-cohesin komplex och bindning av celltyp-specifik transkriptionsfaktorer 7-10. Validering av förväntade förstärkare oftast sker genom en vektorbaserad analys i vilken förstärkaren aktiverar uttrycket av en reportergen 11-12. Dessa data ger valuable information om reglerings potential förmodade förstärkarsekvenser men inte avslöja deras funktion i sin endogena genomiska sammanhang eller identifiera de gener som de reglerar. Genome redigering fungerar som ett kraftfullt verktyg för att studera funktionen av transkriptionsreglerelement i deras endogena sammanhang med förlust-of-funktionsanalys.

Senaste framstegen inom genomet redigering, nämligen crispr / Cas9 genomet redigering system, underlätta undersökningen av genomet funktion. Den crispr / Cas9 systemet är enkelt att använda och anpassningsbar för många biologiska system. Den Cas9-proteinet är riktad till ett specifikt ställe i genomet av en styr RNA (gRNA) 13. Den SpCas9 / gRNA komplexet söker genomet för sitt mål genomsekvensen som måste vara 5 'till en protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens, NGG 14-15. Basparning av gRNA till sitt mål, en 20 nukleotid (nt) sekvens komplementär till gRNA, aktiverar SpCas9 nukleasaktivitet resulterar i en dubbee strängbrott (DSB) 3 bp uppströms om PAM-sekvensen. Specificitet uppnås genom fullständig basparning i gRNA såddregionen, den 6-12 nt intill PAM; omvänt, inte stämmer överens 5 'av fröet vanligtvis tolereras 16-17. Den införda DSB kan repareras antingen av icke-homolog sammanfogning (NHEJ) DNA-reparation eller homologi riktad reparation (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-reparation skapar ofta införing / deletion (InDels) av ett fåtal bp vid målstället som kan störa den öppna läsramen (ORF) av en gen. För att generera större deletioner i genomet två gRNAs, som flankerar regionen av intresse, kan användas 18-19. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbart för studier av transkriptionella enhancers klustrade i locus kontrollregioner eller super-förstärkare som är större än konventionella förstärkare 9,18,20-22.

Monoallel deletioner är en värdefull modell för att studera cis -Förordning av transkription. Den observerade change i avskrift nivå efter monoallel radering av en förstärkare korrelerar till den roll som förstärkare i genreglering utan störande effekter som kan uppstå när transkription av båda allelerna påverkas potentiellt påverka cellulär kondition. Utvärdera reducerad uttryck är svårt men utan förmåga att skilja bort från vildtyp allelen. Vidare genotypning deletioner vid varje allel utan förmåga att skilja mellan de två allelerna är en utmaning, särskilt för stora deletioner av> 10 kb till 1 Mb 23, i vilken det är svårt att amplifiera hela vildtyp region genom PCR. Användningen av F1 ES-celler som genereras av korsning Mus musculus 129 med Mus castaneus tillåter de två alleler som skall differentieras genom allelspecifik PCR 18,24. Hybrid genomet i dessa celler underlättar allelspecifik radering screening och expressionsanalys. I genomsnitt finns det en SNP varje 125 bp mellan dessa två genomen, Vilket ger flexibilitet i primer design för uttryck och genotypning analyser. Förekomsten av en SNP kan påverka primer smälttemperaturen (Tm) och rikta specificiteten i realtid kvantitativ PCR (qPCR) förstärkning möjliggör diskriminering av de två alleler 25. Vidare en felpassning inom 3'-änden av primern påverkar i hög grad förmågan hos DNA-polymeraset att sträcka sig från primern förhindra amplifiering av den oönskade allelen målet 26. Beskrivs i följande protokoll är användningen av F1 ES-celler för allelspecifika förstärkare strykningar som är större än 1 kb och efterföljande uttryck analys med hjälp av crispr / Cas9 genomet redigering system (Figur 1).

Figur 1
Figur 1. Enhancer radering med crispr / Cas9 att studera cis -reglering av genuttryck. (A) F1 ES-celler genererade av en korsning mellan Mus musculus 129 och Mus castaneus används för att möjliggöra för allelspecifik radering. (B) Två styr RNA (gRNA) används för att inducera en stor Cas9-medierad deletion av förstärkarregionen. (C) primeruppsättningar används för att identifiera stora mono- och bi-alleliska deletioner. De orange primers är insidan primers, lila primers är de yttre primers och de gröna primers är gRNA flankerande primers. (D) Förändringar i genuttryck övervakas med hjälp allelspecifik qPCR. RFU betecknar relativa fluorescensenheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion och tillverkning av gRNA

  1. För att ta bort transkriptionella förstärkarregioner använda två gRNAs, en 5 'och en 3' av regionen av intresse. Använd musen UCSC genomet webbläsare spår som genereras av Zhang laboratorium för att identifiera unika gRNA sekvenser (http://www.genome-engineering.org 15). Nästa kontrollera dessa gRNAs och deras angränsande PAM för SNP och InDels använder online-verktyg som tillhandahålls av Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. Om du vill rikta båda alleler med samma effektivitet, undvika gRNA / PAM-sekvenser som innehåller en SNP eller Indel.
    1. När du väljer den gRNA, kontrollera möjligheten att utforma allelspecifika primers för genotypning raderingen. Se avsnitt 5 för allelspecifik primer design.
  2. Montera de två gRNA plasmider baserade på det protokoll som beskrivs i Mali et al. 2013 15. Införliva den valda unika 20 bp målsekvensen into de 61mer oligonukleotider som visas i tabell 7 (sekvenser visas i 5 'till 3'-orientering, och i fetstil baser är den 20 bp målsekvensen som är omvända komplement av varandra).
    1. Blanda 10 | il av 10 | iM gRNA Primer_F och 10 | il av 10 | iM komplementär Primer_R i ett rör.
    2. Annelera primrarna genom inkubering av sprängämnesblandningen vid 100 ° C under 5 min och sedan kyla en ° C / sek till 25 ° C. För detta steg, använda en PCR-maskin eller placera röret i kokande vatten och låt det svalna till RT.
    3. Till glödgade sprängämnesblandningen, tillsätt följande reaktionsblandning och inkubera vid 72 ° C under 30 minuter för att förlänga varje primer: 18,5 pl vatten, 10 mikroliter av 5x HF buffert, 1 mikroliter av 10 mM dNTP-blandning och 0,5 pl av hög- fidelity-DNA-polymeras.
    4. Springa 10 ul av mål-fragmentet på en 2% agarosgel för att bekräfta de 100 bp styr fragment har producerats.
    5. Linjärisera gRNA vektorn (en gåva från GeoRGE kyrkan; Addgene plasmid # 41824) 15 med Afl II med hjälp av följande reaktion inrättas: 5 pl gRNA vektorryggraden (2-4 mikrogram), 5 pl 10x buffert, 3 pl Afl II (20 enheter / pl) och 32 pl av vatten. Inkubera reaktionsblandningen under 3 h vid 37 ° C.
    6. Köra den digere produkten på en 1% agarosgel och rena DNA-bandet som motsvarar de 3,5 kb linjäriserad gRNA vektor med användning av ett gelextraktionskit genom att följa tillverkarens instruktioner.
    7. Inrätta Gibson monterings reaktioner 29-30 med hjälp av arise gRNA vektor och rikta fragment från steg 1.2.3 enligt följande: 1 pl linjär gRNA vektor (50 ng / l), 1 pl målfragment, 10 pl 2x Gibson montering masterblandning och 8 yl vatten. Inkubera reaktioner vid 50 ° C under 60 min.
  3. Transformation av E. coli-celler med Assembled gRNA vektor.
    1. Blanda 1 pl av den sammansatta gRNA vektorn från 1.2.7och 50 | il av DH5a (E. coli-stam) celler i ett rör. Omvandla DH5a-celler genom värmechock-metoden genom att exponera cellerna till 42 ° C under 45 sek.
    2. Snäpp kyla rören på is under 5 min; tillsätt sedan 400 | il av SOC-medium och inkubera vid 37 ° C under 45 min i en skakinkubator.
    3. Sprid 100 pl av de DH5a-celler på en LB-kanamycin (50 | ig / ml) platta för positiv selektion av transformerade celler och inkubera O / N vid 37 ° C.
  4. Screening Positiva E.coli kolonier för gRNA Infoga.
    1. Plocka en kanamycin-resistent koloni och återsuspendera i 3 ml LB innehållande 50 | j, g / ml kanamycin. Upprepa samma för 6-8 kolonier och inkubera alla rör vid 37 ° CO / N i en skakinkubator.
    2. Utdrag plasmider från O / N vuxen kultur med hjälp av plasmid mini prep kit genom att följa tillverkarens manual.
    3. Förbered en EcoR I uppslutning reaktionsblandning för att kontrollera gRNA sekvens insatsi plasmiden. För varje prov, Bered reaktionsblandningen enligt följande: 2 | il av enzymbuffert, 1 | j, l av EcoR I, 15 | il vatten. Alikvot av reaktionsblandningen i 1,5 ml rör och tillsätt 2 pl av plasmiden. Inkubera rören vid 37 ° C under 2 h.
    4. Köra den digere produkten på en 1,5% agarosgel.
      Obs: Proven med insatsen kommer att visa en 475 bp band storlek som är 100 bp högre än klonerna utan skär.
      Obs: Alternativt kan de positiva klonerna screenas med en koloni PCR med användning av Sp6 (framåt) och T7 (bakåt) primers (Tabell 7) som binder till vektorsekvensen för att ge en 642 bp storlek fragment i närvaro av en gRNA insats. Kolonin PCR tillvägagångssätt är fördelaktigt när det finns ett EcoR I-restriktionsställe inom den gRNA sekvensen.
  5. Bekräfta Sekvensen för gRNA in genom DNA-sekvensering med hjälp av T7 Primer.

2. Transfektion

Notera:Elektroporation är en effektiv metod för att transfektera plasmider i ES-celler. Den metod som beskrivs här använder mikroporator transfektion teknik.

  1. Växa F1 ES-celler i en 10 cm gelatin-belagd skål innehållande 10 ml ES-cellmedium (tabell 1) vid 37 ° C / 5% CO2. När cellerna når 85% konfluens avlägsna medierna och tillsätt 2 ml trypsin. Inkubera vid 37 ° C i CO2 inkubator under 5 min.
    Obs: F1 ES-celler erhölls från Barbara panorering 24 och finns tillgänglig på begäran.
  2. Neutralisera trypsin genom tillsats av 10 ml av spinn medium (tabell 2). Pipett upprepade gånger för att lösgöra cellerna fullständigt.
  3. Samla alla celler i ett 15 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Återsuspendera i 3 ml PBS och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
  4. Pellet 1 x 10 6 ES-celler i ett 1,5 ml rör genom centrifugering vid 300 xg under 5 min och återsuspendera i 100 pl R (resuspension) buffert som tillhandahålls av satsen tillverkaren.
  5. Tillsätt 5 mikrogram vardera pCas9_GFP (en gåva från Kiran Musunuru, Addgene plasmid # 44719) 31, 5 'och 3' gRNA plasmider för radering av målområdet och blanda försiktigt med en pipett för att undvika införandet av bubblor.
  6. Använd elektroniska pipettspetsen att aspirera 100 pl av elektro mix, var noga med att undvika en bubbla i spetsen.
  7. Programmera volt, bredd och pulser för elektroporering. För F1 ES-celler, använda 1400 V, 10 ms för 3 pulser.
  8. Medan elektroporering körs observera spetsen att titta på för eventuella gnistor i lösningen. En gnista indikerar närvaron av en luftbubbla och kommer att störa transfektion.
  9. Mata ut de transfekterade ES-celler i en 10 cm gelatin-belagd skål innehållande 10 ml ES-cellmedium (Tabell 1) och inkubera vid 37 ° C / 5% CO2.

3. FACS-sortering transfekterade celler

  1. Efter 48 h, lossa cellerna genom att tillsätta 2 ml av trypsin och inkubera vid 37 ° C i CO2 inkubator under 5 min.
  2. Neutralisera plattan genom att tillsätta 10 ml uppsamlingsbuffert (Tabell 3). Samla upp cellerna i ett 15 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min.
  3. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml sorteringsbuffert (tabell 4). Räkna celler och utspädd baserade på sorterings plattformen. Späd cellerna att 0,5-1 x 10 6 celler / ml för sortering i 15 ml rör och för att sortera enskilda celler direkt in i 96-brunnars plattor, späd cellerna till 2-5 x 10 6 celler / ml.
  4. Sortera Cas9-GFP + ES-celler med användning av en FACS-flödescytometer 32. Samla cellerna i bulk i rör med 2 ml media (Tabell 5) och plattan enligt beskrivningen i 3.5 för koloni plockning, eller sortera enskilda celler direkt in i gelatinbelagda plattor med 96 brunnar innehållande 100 ^ ES-celler media / brunn (
  5. Frö 1-1,5 x 10 4 GFP + ES-celler i en 10 cm gelatinbelagda skål innehållande 10 ml ES-cellmedium (tabell 1). Plätering på denna låga densitet kommer att underlätta att välja individuella ES-cellkolonier.

4. Odling Kloner för genotypning, Expression Analys och Frys Cell Stocks

  1. På dag 4-5 efter sortering, poäng varje brunn i direkt sorterade 96-brunnars plattor med avseende på närvaro av ES-cellkolonier.
    1. Dissociera ES-cellkolonier genom att ta bort media och tillsätta 30 pl trypsin. Inkubera vid 37 ° C under 5 min. Neutralisera trypsin genom att tillsätta 170 pl av ES-cellmedium (tabell 1), och pipettera upp och ner för fullständig dissociering av kolonin in i enstaka celler. Odla cellerna vid 37 ° C / 5% CO2 tills de flesta brunnarna finns över 70% konfluenta (normalt 2-3 dagar).
  2. Alternativt plocka enskilda ES-cellkolonier från 10 cm rätter medett inverterat mikroskop. Efter avsugning kolonin in i pipettspetsen följa steg 4.1.1 placera varje koloni i en brunn i en platta med 96 brunnar, förbehandlas med gelatin och innehållande 30 pl trypsin.
    Obs: Kolonier kan sitta i trypsin vid RT medan en hel rad av kolonier plockas.
  3. När alla kolonier har plockats och dissocieras till media odla cellerna vid 37 ° C i CO2 inkubator tills de flesta brunnarna är över 70% konfluenta (normalt 2 dagar).
  4. När de 96-brunnars plattor är redo för delning, ta bort materialet, tillsätt 30 pl trypsin och inkubera vid 37 ° C under 5 min. Neutralisera trypsin genom att tillsätta 180 pl av ES-celler media (tabell 1) till varje brunn och pipett upp och ner för fullständig dissociation i enskilda celler.
  5. Från den resulterande 210 | il, utsäde 70 | il i tre gelatinbelagda 96-brunnars plattor vardera innehållande 130 | il av ES-cellmedia / brunn (tabell 1). Använd dessa plattor för GEnotyping, expressionsanalys och frysa celllager för varje klon som beskrivs nedan.
  6. När genotypning plattan når 70-85% sammanflödet, behandla plattan som beskrivs i avsnitt 6 "Genotypning rader".
  7. När expressionsanalys plattan når 70-85% sammanflödet, ta bort media, försegla plattan med isoleringstejp och förvara vid -80 ° C tills klonerna har genotypas.
    Obs: Den expressionsanalys plattan är användbar för att analysera förändringar i genuttryck vid tidiga passager av klonerna. Genexpressionsanalys från 96-brunnar är möjlig men eftersom cellantal är låga en RNA-mikro-extraktion kit rekommenderas.
  8. Framställning av 96-brunnar Freeze lager:
    1. När plattan för frysta cellbestånd (stock-1) når 70-85% konfluens, aspirera mediet, tillsätt 30 pl trypsin och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
    2. Neutralisera trypsin genom tillsats av 100 pl av ES-cellmedium (tabell 1) to varje brunn och pipett upp och ner för fullständig dissociation i enskilda celler.
    3. Transfer 15 pl av suspenderade celler från varje brunn till två gelatinbelagda plattor med 96 brunnar, var och en innehållande 185 il ES-celler media (tabell 1) och låt växa vid 37 ° C / 5% CO2.
      Obs: Detta är för lager-2 och -3 plattor som är extra back-up kloner i fall återuppliva cellerna från lager-1 inte lyckas.
  9. Under tiden, till de 100 | il av de kvarvarande cellerna i 96-brunnar (lager-1), tillsätt 100 | il av 2x frysmediet (tabell 6). Förslut plattan med en tätningstejp och snabbt invertera plattan 4-5 gånger för korrekt blandning. Lagra plattan vid -80 ° C tills kloner genotypas.
  10. När lager-2 och lager-3 plattor är redo för frysning aspirera mediet, tillsätt 30 pl trypsin och inkubera vid 37 ° C under 5 min. Neutralisera trypsin genom att tillsätta 70 pl ES-celler media (Tkunna 1) till varje brunn och pipett upp och ner för fullständig dissociation i enskilda celler.
  11. Tillsätt 100 pl av 2x frysningsmedier, försegla plattan med förseglingstejpen och snabbt invertera plattan 4-5 gånger för korrekt blandning. Lagra plattan vid -80 ° C tills dessa plattor behövs.

5. allelspecifik primer design

  1. Design 4 uppsättningar av primers (figur 1C) för att screena kloner för önskad raderings: inside primers, utanför primers och gRNA flankerande primers (för både 5 'och 3' gRNA målställen) som beskrivs nedan.
    1. Skaffa SNP spår som motsvarar de 129 och kasta genotyper på http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Den givna spåret visar bassubstitutioner mellan 129 och kasta på koordinaterna i MM9 musgenomet montering.
      Obs: Länken på ovanstående plats kommer att omdirigera till UCSC genomet webbläsare och lägga till en egen bana innehållande SNP mellan 129 och Cast genomes.
    2. Ange koordinaterna i regionen som ska tas bort. Zooma in på ett område av omkring 500 bp i mitten av den önskade deletionen innehållande> 3 SNPs.
    3. Gå för att visa> DNA i alternativlisten och klicka få DNA att ladda ner målsekvensen i alla versaler format.
    4. Skapa två FASTA sekvenser; en för 129 och en för Cast av bas substitution vid SNP position. Markera SNP av gemener.
    5. Gå till Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) och klistra in SNP ersätta 129 sekvens. Använd standardinställningarna för att utforma primers.
    6. Att utforma insidan allelspecifika primers väljer Primer_List i aktivitets drop-menyn och klicka på Välj Primers. Välj en framåt eller bakåt primer som har en SNP antingen i 3'-änden eller inom 4 baser från 3 'och faller inom regionen som ska tas bort.
      Obs: Primers som har en SNP vid 3'-änden display ökade allel specificitet i qPCR.
    7. För att välja den andra primern återvända till huvudsidan väljer Detection i listmenyn uppgiften och klistra in den första primersekvensen i lämplig ruta längst ned på sidan. På fliken Allmänna inställningar ändra inställningen för produktstorleksintervallet till 80-200 bp och klicka Pick Primers. Välj en primer in från de listade primerpar; dessa kommer att vara 129 inne allelspecifika primers.
    8. Upprepa steg 5.1.5 till 5.1.7 för att utforma primers för Cast-allelen.
    9. Återgå till UCSC genomet webbläsare och ange koordinaterna i regionen som ska tas bort. Gå för att visa> DNA i alternativlisten under Sequence Retrieval Region Tillval 1000 bp uppströms och nedströms klicka få DNA att ladda ner målsekvensen.
    10. Markera gRNA målsekvensen inom parentes. Spara hela denna sekvens innan du fortsätter.
    11. Att utforma de yttre primers bort sekvensen mellan de två gRNA målsekvenserna. Upprepa steg 5.1.4-5.1.8 att utforma utsidan allel-specifik primers men ändra produktens storlek 400-800 bp.
    12. Dela upp den sekvens som erhållits i steg 5.1.10 i två sekvenser, var och en med 500 bp 5 'och 3' om gRNA målsekvensen. Upprepa steg 5.1.5 till 5.1.7 utforma icke-allelspecifika primers för gRNA flankerande regioner men ändra produktens storlek 400-800 bp.
      Notera: För icke-allelspecifika primers, antingen 129 eller Kasta sekvens kan användas och primers bör väljas som inte innehåller en SNP. Det är lämpligt att ange en produktstorlek av 400-800 bp för att utforma utanför och gRNA flankerande primers. Detta gör det möjligt för amplifiering, även om små InDels är närvarande.
  2. Testa insidan primers för allel specificitet genom qPCR hjälp av ren 129 och kasta stam iskt DNA på 2 ng / l. Följ steg 6,2-6,4 för att ställa in qPCR reaktion.
    Obs: Om 129 genotyp i målområdet är densamma som C57BL / 6J, DNA från C57BL / 6J kan användas i stället för 129 DNA. Allelspecifika primrar bör uppvisa minst 5 cyklerskillnaden mellan Ct (cykel tröskel) värde på det korrekta vs. den felaktiga genotyp. De yttre primers kan testas för att säkerställa att de förstärka radering med Cas9 / gRNA transfekterade ES-celler, och F1 iskt DNA respektive som positiva och negativa kontroller. Allelen-specificitet av externa primers kan testas när monoallel kloner har identifierats.

6. Genotypning rader

  1. Utdrag iskt DNA från genotypning 96-brunnar med hjälp av plattan från steg 4,6 som genereras efter koloni expansion.
    1. Förbereda det genomiska DNA-extraktion blandning: 89 | il vatten, 10 fil av 10 x buffert och 1 pl av extraktion reagens (tillhandahålls av tillverkaren). Tillsätt 100 | il av genom-DNA-extraktion blandning till varje brunn och försegla plattan med en tätningstejp.
    2. Inkubera plattan vid 75 ° C under 5 min följt av 95 ° C under 5 min.
    3. Låt plattan svalna genom inkubation på is under några minuter end sedan centrifugera kort att lösa eventuell kondens till botten av brunnen. Detta fungerar som templat-DNA plattan för borttagning screening.
  2. Ställ upp qPCR reaktioner i duplikat för varje klon på följande sätt: 5 pl 2x SYBR qPCR mix, framåt och bakåt primer (3 M) var en l och 1 l vatten. Använda en flerkanalspipett att lägga till 2 | il mall-DNA följt av 8 | j, l av reaktionsblandning till varje brunn i en 384-brunnsplatta.
  3. Förslut plattan med förseglingstejpen och centrifugering vid 600 xg under 2 minuter för att blanda innehållet. Placera 384-brunnar array i realtid cykelapparat.
  4. Programmet realtidscykeln med en 2-stegs PCR följt av smälta kurva analys med detektion på följande: 1 cykel vid 95 ° C under 10 min, 40 cykler av 95 ° C under 15 s, 62 ° C under 30 sek med plattan läs- och 95 ° C under 10 s, 65 ° C till 95 ° C med inkrement av 5 ° C under 5 sek + plattan läsa.
    Obs: Förutom primer design, qPCR mix och cykelparametrar bidrar också till primer specificitet. De parametrar som beskrivs ovan och reagens som räknas upp i de material utbyte oftare allelspecifik amplifiering.
  5. Analysera qPCR Resultat
    1. Kontrollera varje allel för amplifiering med invändiga allelspecifika primers. Ingen förstärkning av en allel eller hög Ct värde skillnader (> 5 cykler) mellan alleler antyder dessa kloner bär en heterozygot deletion av allelen med hög / frånvarande Ct värde. Ingen förstärkning av båda allelerna tyder på att de bär en homozygot deletion.
    2. Kontrollera varje allel för förstärkning med externa allelspecifika primers. När målet borttagningen är större än 1 kb förstärkning med externa primers bara uppstår när en radering är närvarande. En Ct värde av 22-28 bekräftar borttagningen. För mål strykningar mindre än 1 kb, bekräftar amplicon storlek genom elektrofores.
      Obs: Om de yttre primers visar endast måttlig allel-specificitet (se Figure 2), kan amplikoner erhållas med både alleliska primeruppsättningar i monoallel kloner på grund av mål förstärkning av de yttre primers. I det här fallet en Ct Skillnaden mellan de två alleler av åtminstone fem cykler bör bekräfta rätt allelen (lägre Ct värde) tas bort baseras på resultaten från insidan primers. Om på målet kontra utanför mål allel Ct skillnaden är mindre än fem cykler utforma nya allelspecifika utanför primers.
    3. I monoallel deletionskloner kontrollera integriteten hos den icke-raderade allelen med hjälp av sekundär screening, gRNA flankerande primers.
      Obs: InDels av> 25 bp storlek runt gRNA målstället kan identifieras genom att observera en förändring i smältkurvan i qPCR för 400-800 bp amplikoner. Alternativt kan amplikoner från gRNA flankerande primers sekvenseras för att upptäcka små InDels av <25 bp.
      1. Utför qPCR med 2 uppsättningar gRNA flankerande primers dvs, 5 'och 3' gRNA som används för att generera crispr radering. Ingen förstärkning med dessa uppsättningar av primers indikerar InDels större än qPCR amplikon är närvarande vid gRNA målstället på den icke-raderade allel av monoallel deletionskloner. Släng kloner innehållande dessa stora InDels från vidare analys eftersom resultaten kan vara svåra att tolka utan att känna till omfattningen av borttagningen.
  6. Rena erhållna amplikoner från utsidan primer qPCR reaktion med användning av en PCR rensa upp kit efter tillverkarens instruktioner.
  7. Bekräfta sekvensen för den borttagna allelen genom DNA sekvensering av den renade PCR-produkten från föregående steg. Använd qPCR amplifieringsprimrar för framåt och bakåt sekvensering.
    Obs: I detta skede SNP inom amplikonet fungera som en sekundär bekräftelse av genotypen av den borttagna allelen.

7. Analysera Expression med allelspecifika primrar

  1. Tina 96 brunnar cell lager plvid -80 ° C (lager-1 från steg 4,9) åt lagras genom att placera den på en varm pärla bad. När mer än hälften av brunnarna i plattan tinas, centrifugering vid 300 xg under 5 min.
  2. Noggrant, ta bort förseglingstejpen och snabbt överföra celler från deletionsanalogema positiva brunnar i gelatinbelagda, 12-brunnars plattor innehållande 1 ml ES-cellmedium (tabell 1) och inkubera vid 37 ° C / 5% CO2.
  3. När plattan når 70-85% konfluens, passage cellerna och dela upp dem i tre brunnar i en gelatinbelagd, 6-brunnar, vardera innehållande 2 ml av ES-cellmedium (tabell 1). Använd två brunnar för att förbereda 2 injektionsflaskor med frysta celllager för långtidsförvaring i flytande kväve (beskriven i steg 8) och den tredje bra för RNA-extraktion.
  4. Extrahera RNA med användning av ett RNA-extraktion kit.
  5. Konvertera 100-500 ng av RNA till cDNA genom omvänd transkribering (RT) av RNA med användning av cDNA-synteskit efter tillverkarens protokoll. Inkludera en RT negative reaktion för varje RNA-prov för att övervaka mängden av kontaminerande DNA i RNA-proven.
  6. Späd cDNA innan qPCR i ett förhållande av mellan 1: 2 och 1: 4; beroende på expressionsnivån av målgenen i ES-celler.
  7. Ställ qPCR som beskrivits ovan inklusive F1 iskt DNA som standardkurva (5 faldiga utspädningar från 250 till 0,08 ng / l) för absolut kvantifiering av transkriptnivåer. Jämföra uttrycket av varje allel av genen av intresse för varje bekräftad raderas klonen med en lämplig kontroll gen, t ex GAPDH (primrar som anges i tabell 7).
    Obs: Kontroll genen primers behöver inte vara allelspecifik. Allelspecifik primer design är densamma för RT-qPCR primers såsom beskrivits för genotypning primers med undantag av målregionen för amplifiering. Gensekvensen bör användas; om användning av primrar för en enda exon eller en exon-intron gräns (att övervaka primära transkriptet) F1 genom-DNA kan användas förstandardkurvan. För ytterligare information om RT-qPCR hänvisas till Forlenza et al. 2012 33.

8. Freeze Stock Förberedelse för Långsiktig lagring av ES-celler

  1. Tillsätt 300 pl av trypsin till varje 6-brunnars (från steg 7,3) och inkubera under 5 min vid 37 ° C. Tillsätt 2 ml av spinn medium (Tabell 2) för att neutralisera trypsin och pipettera upp och ned flera gånger för att sönderfalla i enskilda celler.
  2. Överföra celler till ett 15 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min.
  3. Aspirera supernatanten och tillsätt 500 pl av ES-cellmedium (tabell 1). Pipettera upp och ner för att återsuspendera cellerna.
  4. Överföra innehållet till en 1,5 ml cryovial rör och tillsätt 500 pl 2x ES-celler frysa media (tabell 3). Blanda väl genom att vända röret och placera röret i ett alkoholfritt cellfrysbehållare. Placera denna cell frysning behållare vid -80 ° C under minst 12 timmar innan transferring i en flytande kväve ackumulatortank.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet som beskrivs här använder F1 ES-celler för att studera cis -Förordning av genuttryck i monoallel förstärkare bort celler som genereras med hjälp av crispr / Cas9 genomet redigering (Figur 1). Den gRNA och allelspecifik primer design för genotypning och genuttryck är de viktigaste faktorerna i detta tillvägagångssätt. Varje allel-specifik primer set måste godkännas av qPCR att bekräfta allelen specificitet. Allelspecifika primrar som amplifierar endast deras respektive genom-DNA-mål är idealiska (Figur 2). Idealt är dessa primers har en SNP vid deras 3'-ände. Primers med mindre allel-specificitet kan användas om de visar minst 5 Ct värde skillnad i deras förstärkning av rätt kontra fel genotyp 25. Primers som bär en SNP mer 5 'än den 4: e bas från 3' änden misslyckas vanligen att uppvisa allelen specificitet och förstärka båda genotyper med samma effektivitet,avslöjar betydelsen av SNP position i primern 34. Dessutom en purin / purin eller pyrimidin / pyrimidin substitution har visat sig ha en större inverkan på Tm skillnaden mellan två primers jämfört med en purin / pyrimidin substitution 25.

Primär screening av ett 96-brunnars platta av DNA som isolerats från ES-cellkloner genomförs med allelspecifika inuti primrar för att identifiera kloner som bär en deletion på en eller båda allelerna. Dessa raderade kloner ytterligare screenas med utomstående allelspecifika primers för att bekräfta varje borttagning. Exemplet här är från en effektiv gRNA par som resulterade i 46% av kloner som bär en deletion på 129, Cast eller båda allelerna (Figur 3). Sekundär screening görs för bekräftade monoallel deletionskloner att identifiera InDels runt gRNA målplatser på den icke-raderade allelen som frekvensen av Indel occurrhet på gRNA målstället är hög 23. InDels runt gRNA inte identifieras i den första undersökningen, eftersom dessa kloner visar ingen strykning med inre primers och inte förstärka med de yttre primers (Figur 4). Monoallel deletionskloner som ger amplifiering med båda uppsättningarna av vänster och höger gRNA flankerande primrar har sina andra allelen i stort sett intakt, eftersom de inte innehåller en deletion större än den 5 'eller 3' gRNA flankerande amplikoner. Sekvensering av amplikoner från gRNA flankerande primers kommer att identifiera InDels mindre än gRNA flankerar amplikoner som kanske inte märks i qPCR. De monoallel deletionskloner som inte ger förstärkning vid båda regionerna i sekundär screening ingår inte för vidare genuttryck analys. Som gRNA målregioner väljs utanför regionen som misstänks ha förstärkningsfunktion, InDels mindre än gRNA flankerar amplikoner sannolikt inte kommer att påverka förstärkningsfunktion och kloner conlande dessa kan inkluderas i ytterligare analys.

Att begränsa en stor deletion till en allel en gRNA kan väljas som överlappar en SNP i såddregionen eller PAM. Beskrivs här är ett exempel på en deletion högeffektiv (53%) på 129 allel på grund av en SNP i PAM för 3 'gRNA på Cast-allelen (figur 5). Denna deletion avlägsnade SCR, en nyligen beskriven Sox2 specifik förstärkare i ES-celler 18,22. Även om införandet av den stora deletion minskat kraftigt på Cast-allelen har tre kloner (1, 11, 75) identifieras med en stor deletion på Cast-allelen (figur 5). Av dessa tre kloner två (1, 11) innehöll 3 'brytpunkter inom 50 bp av 3' gRNA målregionen. För det tredje klonen var vi inte kunnat identifiera den 3 'brytpunkten och drog slutsatsen att strykningen var större än 11 kb 18. Deletioner med en eller båda avir brytpunkter ligger> 100 bp från antingen 5 'om 3' gRNA målregion är svåra att genotyp, i allmänhet svarar för 15-30% av alla kloner, och förblir ej karaktäriserad i den primära screeningen som strykningen inte amplifierats med utsidan primrar.

När kloner med monoallel deletion har identifierats de analyseras för allelspecifik genuttryck med användning av absolut kvantifiering genom omvänd transkription qPCR. Genuttryck från kloner som bär en monoallel deletion av kritiska Sox2 förstärkarregionen, SCR, visas här jämfört med expression i vild typ F1 ES-celler (Figur 6). Specifikt kloner som bär en deletion av enhancer region på 129 allel uppvisade en minskning i 129-transkriptnivåer medan kloner som bär en deletion på Cast allel uppvisade en minskning i Cast-transkriptnivåer. Allelen specifika genuttryck analys avslöjade thvid denna distala förstärkarregionen, SCR, är en kritisk cis -regulator av Sox2 i ES-celler 18.

figur 2
Figur 2. Test av allel-specificitet 129 och kasta allelspecifika primers. (A) Förstärkning från primers för 129 genotyp. (B) Förstärkning från primers för Cast genotyp. I både A och B linjerna visa förstärkningsprofiler för C57BL / 6 genomiskt DNA som har samma genotyp som 129 DNA vid dessa specifika SNPs; linjerna med öppna cirklar visa förstärkningsprofiler för Cast-genomiskt DNA. Amplifiering resulterande från primeruppsättning med den mest allel-specificitet visas i grönt (allelspecifik primer-1), en primeruppsättning som visar en 5 Ct skillnad visas i lila (allelspecifik primer-2) och en primeruppsättning som visar en minimal skillnad i Ct värde represented i rött (allelspecifik primer-3, primer detaljer i tabell 7). Den röda primeruppsättning inte skulle vara lämplig för allelspecifik screening. RFU betecknar relativa fluorescensenheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Resultat som erhölls efter screening av ett 96-brunnar med allelspecifika inuti och utanför primers. (A) qPCR resultat från skärmen med inuti primrar (Enh_del_IS_F1_129, Enh_del _IS_F1C, Enh_del _IS_R1) B) qPCR resultat från skärmen med utsidan primers (Enh_del_OS_F1, Enh del_OS_R1_129, Enh_del_OS_F2C, Enh_del_OS_R3, primer detaljer i tabell 7). I båda grå staplar representerar förstärkning från Cast-specifika primers och svarta staplar representerar förstärkning från 129-specifika prim ers. Notera att endast kloner med en deletion på en eller båda allelerna screenas med utanför primers. Den relativa förstärkningen av varje allel beräknades med hjälp av två -CT att approximera den ursprungliga koncentrationen och därefter uttrycka varje allel som en procentandel av summan av de två alleler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Kloner med en monoallel deletion screenas för att identifiera stora InDels på gRNA målplatser. Primers som flankerar gRNA målregionerna används för att bekräfta att den icke-raderade allelen är intakt. Endast monoallel kloner utan stora InDels vid målplatser på de icke-raderade allelen används i den efterföljande uttrycksanalys. tp_upload / 53.552 / 53552fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Kloner erhållna från Sox2 SCR radering. Visade är de qPCR resultat från en skärm med inuti primrar (pr111R, pr111F_129, pr111F_Cast, detaljer i tabell 7). Grå staplar representerar förstärkning från Cast-specifika primers och svarta staplar representerar förstärkning från 129-specifika primers. Notera att deletionen är starkt sned mot 129 allelen på grund av närvaron av en SNP i PAM av 3'gRNA målregion på Cast-allelen. Den relativa amplifieringen av varje allel beräknades med användning av 2 -CT att approximera den ursprungliga koncentrationen och därefter uttrycka varje allel som en procentandel av summan av de två allelerna. filer / ftp_upload / 53.552 / 53552fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. SCR deletion minskar dramatiskt uttryck för Sox2. Representativa resultat från 129 eller Kasta SCR bort kloner. Röda staplarna representerar uttryck av Sox2 Medverkande allelen och blå stapel representerar förstärkning av Sox2 129 allelen. Strykning av SCR på 129 allelen minskat uttryck av Sox2 (129) medan deletion av SCR på Cast-allelen minskat uttryck av Sox2 (rösterna). Data som visas är ett genomsnitt av tre tekniska replikat, felstaplar som inte visas. Primrar som användes för Sox2 expressionsanalys [Sox2_F, Sox2 (129) _R, Sox2 (cast) _R] listas i Tabell 7.pload / 53.552 / 53552fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagens förrådskoncentration Volym slutkoncentration
GlutaMAX 200 mM 6 ml 2 mM
2-merkaptoetanol 10 mM 6 ml 0,1 mM
MEM icke-essentiell aminosyror (NEAA) 10 mM 6 ml 0,1 mM
natriumpyruvat 100 mM 6 ml 1 mM
Penicillin / streptomycin 10.000 enheter 3 ml 50 U / ml
FBS 90 ml 15% CHIR99021 * 10 mM 3 ^ M
PD0325901 * 10 mM 1 ^ M
LIF * 10 7 enheter / ml 1000 U / ml
# Att förbereda ES-cellmedia, tillsätt ovanstående komponenter till 500 ml hög glukos DMEM. ES-cellen media bör inte förvaras i mer än 4 veckor och med hämmare * högst 2 veckor.

Tabell 1. ES-cellmedia.

Reagens förrådskoncentration Volym slutkoncentration
GlutaMAX 200 mM 5 ml 2 mM
Penicillin / streptomycin 10.000 enheter 5 ml 100 U / ml
FBS 50 ml 10%
# För att förbereda Spin media, lägga till ovanstående komponenter till 500 ml med hög glukos DMEM.

Tabell 2. Spin media.

Reagens slutkoncentration Volym (50 ml)
1x PBS utan Ca / Mg 2 + 42,0 ml
BSA Fraktion V (7,5%) 15% (volym / volym) 7,5 ml
0,5 M EDTA > 5 mM 0,5 ml

Tabell 3. Insamling buffert.

Reagens slutkoncentration Volym (50 ml)
1x HBSS 47.25 ml
1M HEPES 25 mM 1,25 ml
0,5 M EDTA 5 mM 0,5 ml
BSA Fraktion V (7,5%) 1% (volym / volym) 0,5 ml
FBS 1% (volym / volym) 0,5 ml

Tabell 4. Sorterings buffert.

sätt "> ES-cellmedia 60% FBS 40%

Tabell 5. Media.

ES-cellmedia 60%
FBS 20%
DMSO 20%

Tabell 6. 2x frysmediet.

tabell 7a
tabell 7b
Tabell 7. Förteckning över primers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Crispr / Cas9 förmedlad genom redigering teknik ger en enkel, snabb och billig metod för genomet modifiering. Metoden beskrivs här för att generera och analysera monoallel förstärkare radering för funktionell förstärkare karakterisering utnyttjar SNP i F1 musceller. Fördelarna med denna typ av tillvägagångssätt är: 1) monoallel enhancer strykningar inte ger störande effekter som uppstår när en kritisk förstärkare tas bort från båda alleler, dvs en stor minskning av proteinnivåer av den reglerade genen leder till cell dödlighet eller ändras fenotyp; 2) Om frekvensen av monoallel radering är låg erhålla en homozygot deletion är mindre troligt; dock med användning av allelspecifika primrar i genuttrycksanalys en kan analysera kloner med en monoallel deletion; 3) med fyra uppsättningar av primers för att screena monoallel deletioner tillåter eliminering av kloner innehållande partiella eller stora deletioner som förbryllanedströms analys.

Allelspecifik primer design är kritisk för genotypning mono / bialleliska crispr deletioner och analysera effekten på genuttrycket i en allel-specifikt sätt. Detta är lättare uppnås när F1 celler som används innehåller mer frekventa SNP som tillåter diskriminering av de två alleler. Här ES-celler som genereras från en Mus musculus 129 x Mus castaneus tvär används; dock kan andra celler användas om SNP mellan de två alleler möjliggör allelspecifik radering screening och expressionsanalys, och om tillräckliga uppgifter finns att förutsäga aktiva förstärkare regioner riktas i den valda celltypen. Därför kan denna metod anpassas till varje cellinje där information om allelisk SNP är tillgänglig. En av begränsningarna i protokollet är beroendet av SNP på specifika platser. Vissa målregioner bär färre SNP som gör utforma allelspecifika utanför primers som förstärker en <800 bp fragment utmanande. I sådana fall skulle kunna användas ett PCR tillvägagångssätt som ett alternativ till qPCR screening möjliggör en större amplikon. Dessutom kan det finnas SNP associerade skillnader i fenotypen av F1 ES-celler; för att bekräfta funktionen av särskilda medel i ytterligare genotyper homozygota deletioner kan genomföras i standard ES linjer. Specificitet SpCas9 nukleas är en viktig fråga, särskilt överväger potentiella tillämpningar i kliniska metoder. Utredning SpCas9 specificitet har visat att både 6-12 nt såddregionen av gRNA igenkänningssekvensen och den intilliggande PAM är viktiga för nukleasaktivitet 13-14,17. Från målet mutationer kan minimeras genom att säkerställa att såddregionen och angränsande PAM är unika i genomet modifieras 14,16.

En monoallel tillvägagångssätt deletion som beskrivs här i kombination med allelspecifik RNA-seq kan slutgiltigt avslöja genen eller generna regleras av en specifik enHancer 18. Dessa experiment är viktiga för att förstå genom funktion som radering av ännu reporter-analys validerade förstärkare inte alltid påverka genuttryck 18. Dessutom kan förstärkare inte reglera närmast genen i genomet eller kan reglera mer än en gen 1,20,35. Som ett resultat är förlust-av-funktionsanalys den mest informativa tillvägagångssätt för att bestämma funktionen hos en enhancer-regionen. Detta kan snabbt åstadkommas med hjälp av crispr / Cas9-medierad monoallel radering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har läst Joves politik för intressekonflikt och har inga konflikter att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824 A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFP Addgene 44719 Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflII NEB R0520S
EcoRI NEB R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit Life Technologies MPK10096 Microporator transfection technology
prepGEM ZyGEM PT10500 genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
High-Speed Plasmid Mini Kit Geneaid PD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free  Geneaid PME25
SYBR select mix for CFX Life Technologies 4472942 qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit Bio-rad 170-8891 Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTA Life Technologies 25200072
PBS without Ca/Mg2+ Sigma D8537
0.5 M EDTA Bioshop EDT111.500
HBSS Life Technologies 14175095
1 M HEPES Life Technologies 13630080
BSA fraction V (7.5%) Life Technologies 15260037
Max Efficiency DH5α competent cells Invitrogen 18258012
FBS ES cell qualified FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSO Sigma D2650
Glutamax Invitrogen 35050
DMEM Life Technologies 11960069
Pencillin/Streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360
Non-essential aminoacid Invitrogen 11140
β-mercaptoethanol Sigma M7522
96-well plate Sarstedt 83.3924
Sealing tape Sarstedt 95.1994
CoolCell LX Biocision BCS-405 alcohol-free cell freezing container
CHIR99021 Biovision 1748-5 Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901 Invivogen inh-pd32 Inhibitor for F1 ES cell culture
LIF Chemicon ESG1107 Inhibitor for F1 ES cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132, (4), 797-803 (2005).
  2. Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
  3. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, (7261), 199-205 (2009).
  4. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337, (6099), 1190-1195 (2012).
  5. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459, (7243), 108-112 (2009).
  6. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488, (7409), 116-120 (2012).
  7. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316, (5830), 1497-1502 (2007).
  8. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, (6), 1408-1419 (2011).
  9. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153, (2), 307-319 (2013).
  10. Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13, (1), 152 (2012).
  11. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30, (3), 265-270 (2012).
  12. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30, (3), 271-277 (2012).
  13. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, (6096), 816-821 (2012).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  15. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, (9), 827-832 (2013).
  17. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24, (1), 132-141 (2014).
  18. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, (24), 2699-2711 (2014).
  19. Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41, (20), e187 (2013).
  20. Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (8), 2554-2558 (1989).
  21. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16, (1), 47-57 (2009).
  22. Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9, (12), e114485 (2014).
  23. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289, (31), 21312-21324 (2014).
  24. Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4, (6), e159 (2006).
  25. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59, (10), 1470-1480 (2013).
  26. Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20, (17), 4567-4573 (1992).
  27. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477, (7364), 289-294 (2011).
  28. Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477, (7364), 326-329 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  30. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7, (11), 901-903 (2010).
  31. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12, (4), 393-394 (2013).
  32. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  33. Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
  34. Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77, (3), 267-275 (2009).
  35. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489, (7414), 109-113 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics