Storstilet Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) af Sund og Tilskadekomne Zebrafisk Brain

1Cell Biology, UMC Groningen, 2Clinical Genetics, Erasmus MC Rotterdam
* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Storstilet 2D elektronmikroskopi (EM), eller nanotomy, er vævet-bred anvendelse af nanoskala elektronmikroskopi. Andre, og vi tidligere anvendte skala EM store til human hud pancreas-øer, vævskultur og hele zebrafisk larver 1-7. Her beskriver vi en universelt anvendelig metode til væv-skala scanning EM for saglig påvisning af sub-cellulære og molekylære funktioner. Nanotomy blev påført undersøge den sunde og en neurodegenerativ zebrafisk hjerne. Vores metode er baseret på standardiserede EM prøveforberedelse protokoller: Fiksering med glutaraldehyd og osmium, efterfulgt af epoxy-harpiks indlejring, ultratynd sektionering og montering af ultratynde-sektioner på én-hullers net, efterfulgt af indlæg farvning med uranyl og bly. Store 2D EM mosaik billeder har erhvervet under anvendelse af en scanning EM forbundet til et eksternt stort område scan generator i scanning transmission EM (STEM). Stor målestok EM billeder er typisk ~ 5 - 50 G pixels In størrelse, og ses bedst ved hjælp zoomable HTML-filer, som kan åbnes i en webbrowser, svarende til online geografiske HTML maps. Denne metode kan anvendes på (human) væv, tværsnit af hele dyr samt vævskultur 1-5. Her blev zebrafisk hjerner analyseret i en ikke-invasiv neuronal ablation model. Vi visualiserer inden for en enkelt datasæt væv, cellulære og subcellulære ændringer, som kan kvantificeres i forskellige celletyper, herunder neuroner og mikroglia, hjernens makrofager. Desuden nanotomy letter korrelationen af EM med lysmikroskopi (CLEM) 8 på det samme væv, som store overfladearealer tidligere afbildes med fluorescerende mikroskopi, kan efterfølgende underkastes stort område EM, hvilket resulterer i nano-anatomi (nanotomy) af væv. I alt nanotomy tillader uvildig detektion af bekvemmeligheder på EM-niveau i et væv-dækkende kvantificerbar måde.

Introduction

Den seneste tekniske udvikling har forbedret alsidighed, anvendelighed og kvantitativ karakter af EM, hvilket fører til en genoplivning af ultrastrukturelle analyse. Fremskridt omfatter 3D EM, storstilet 2D EM og forbedrede fremgangsmåder og reagenser til korreleret lysmikroskopi og elektronmikroskopi (CLEM) at sammenligne andre former for mikroskopisk analyse direkte til EM niveau 8-10. Storstilet 2D EM er særligt velegnet til at kvantificere eller identificere (nye) sygdom funktioner til menneskelig patologi, studere dyremodeller for sygdom og vævskultur modeller. På grund af den typisk lille synsfelt er det svært at korrelere ændringer ved stor forstørrelse til et væv bred skala, samt at unbiasedly og kvantitativt analysere ultrastrukturelle træk.

For patologisk analyse af humant væv eller vurdering af patologi i dyremodeller, hæmatoxylin og eosin (H & E) farvede sektioner af formaldehyd fast paraffin indstøbt (FFPE) tissagsøge er standarden. Udover simple H & E farvning immunolabeling også udføres for at identificere patologiske abnormiteter. Hvis sådanne væv kunne analyseres på EM-niveau, specifikke celletyper, og kunne identificeres subcellulære ændringer. Den objektiv karakter skala EM stort tillader at finde uventede og hidtil ukendte træk ved sygdommen. Ved storstilet kan visualiseres EM områder op til kvadratmillimeter. Vi og andre tidligere har anvendt nanotomy at rotte pancreas-øer 4, cellekultur 2, rotte hjerne 3, hud og slimhinder 7 og hele zebrafisk larver 1,5 (www.nanotomy.org). Zebrafisk er særdeles egnede til in vivo-billeddannelse, i særligt at visualisere celletyper, som er vanskeligt tilgængelige i mammale væv, herunder hjerne immunceller 11. Her proceduren nanotomy er beskrevet detaljeret, påført på koronale sektioner af zebrafisk hoveder undergår betinget neuronal ablation ved omdannelse af metronidazol ved neuronaludtrykt nitroreduktase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle rådata præsenteres som zoomable HTML-filer, visualisering molekylær væv omfattende ændringer. Præsentationen af ​​de rå data tillader upartiske analyser af datasæt fra andre vinkler af eksperter verden over.

Protocol

Alle eksperimenter med zebrafisk larver blev godkendt af dyreforsøg udvalg fra University of Groningen i henhold til nationale og EU-direktiver.

1. Prøvefremstilling

  1. Fiksering og Indlejring
    1. fiksering
      1. Bedøve fiskelarver i tricaine (0,003%) tilsat til E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) zebrafisk vand og test for dybden af bedøvelse ved at stikke forsigtigt med en 200 pi pipettespids under dissektion mikroskop indtil bevægelse ikke længere detekteres (figur 1A).
      2. Ved behandling af prøver til korrelativ EM efter at erhverve in vivo imaging data ved hjælp af konfokal eller to foton billedbehandling i 1,8% agarose som beskrevet, 5,15 fix larver i agarose hjælp 4% PFA i PBS indeholdende Triton-X-100 (0,05%).
      3. Skåret larver fra agarose og fremgangsmåde tilstorstilet EM 5.
      4. Fix larver i frisk 4% paraformaldehyd i PBS indeholdende Triton-X-100 (0,05%) i 2 timer ved stuetemperatur i plastrør.
        Bemærk: Celler dyrket i kultur (in vitro) kan fastgøres direkte i glutaraldehyd, som beskrevet i det næste trin (1.1.1.5).
      5. Fjern opløsning og tilsæt 100 ul 0,5% PFA, 2% glutaraldehyd (GA) og 0,1 M natriumcacodylat (pH 7,4). Opbevar natten over ved 4 ° C. Skyl prøver to gange i 0,1 M natriumcacodylat.
      6. Skær larval hoveder rostrally til baghjernen at lette penetrering af osmium. Brug fine sprøjter / pincet.
      7. Postfix larver i 1% osmiumtetroxid (OSO 4) /1.5% kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6]) i 0,1 M natriumcacodylat på is i 2 timer og skyl 3 x 5 min i dobbelt destilleret H2O
      8. Dehydrer i ethanol ved 20 min inkubationer i stigende ethanol-koncentrationer (50%, 70%, 3 gange 100%).
    2. indlejring
      1. Forbered epoxyharpiks ifølge standardsammensætninger, der anvendes EM labs.
        Bemærk: Vi anvender epoxyharpiks som følger: bland 19,8 g glycid ether 100, 9,6 g 2-dodecenylravsyre anhydrid og 11,4 g methylnadic anhydrid under anvendelse af en magnetisk omrører. Tilsæt 0,5 g DMP-30 (tris- (dimethylaminomethyl) phenol) og blandes igen.
      2. Inkuber larver natten over i 50% epoxyharpiks i ethanol (v / v) under rotation (RT).
      3. Erstat fortyndet epoxy-harpiks med ren harpiks. Inkuber i 30 minutter, tilsæt frisk harpiks igen og inkuberes i yderligere 30 minutter. Igen opdatere harpiksen og derefter inkuberes 3 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af 15 minutter ved 58 ° C og yderligere 1 time ved stuetemperatur under lavt tryk (200 mbar).
      4. Orientere hoveder i kommercielt tilgængelige silicium flad indlejring forme under et dissektionsmikroskop under anvendelse af en nål eller tandstikker med fremad vendende side af formen eller efter behov (Figur 1B).
      5. Polymerisere epoxy resi natten over ved 58 ° C. Hvis epoxyharpiks stadig er for blød tillade en anden dag til at polymerisere og hærde ved 58 ° C. Test stivhed ved at anvende pres med en pincet. Hvis dette let efterlader en fordybning tillade en anden dag til at polymerisere og hærde ved 58 ° C. Når modellen er fuldt hærdet videre til trimning og skæring.
      6. Skær overskydende harpiks fra stub hjælp barberblade (figur 1B).
  2. Sektionering, Kontrasterende og Montage
    1. sektionering
      1. Afsnit epoxyharpiks blok under anvendelse af en ultramikrotom.
      2. Brug et glas kniv eller en diamant histoknife at skære semithin sektioner (500 nm) i toluidinblåt / basic fuchsin (figur 1D) farvning til påvisning af højre positionering.
      3. Overfør semi-tynde sektioner på mikroskopiske dias ved at samle dem op med et glas Pasteur-pipette, hvis spids er blevet lukket ved smeltning i en flamme. Tørre på en varmeplade until ingen vand er tilbage. Farv i 10 sek med 1% toluidinblåt i vand på en varmeplade og efter skylning med vand, plet i 10 sek med 0,05% basisk fuchsin i 1% natriumtetraborat. Undersøg med en normal lysmikroskop ved 10X til 40X.
      4. Når den korrekte site / orientering i hjernen er nået, fortsætter sektionering epoxyharpiksen blok med en diamant kniv til at skære ultratynde sektioner (~ 70 nm; Figur 1E)
      5. Brug let identificerbare anatomiske strukturer i og omkring hjernen, herunder olfaktoriske gruber, øjne, grå-hvid substans grænser, for at identificere området af interesse under ultratynde sektionering og for at justere skære- vinkel, når prøven er vippet.
      6. Mount afsnit om enkelt slot L2 x 1 kobber gitre (figur 1F), for at muliggøre erhvervelse afbrudt af gitter barer. Brug Formvar coatede gitre til at understøtte sektionerne.
    2. kontrasterende
      1. Stain ultratynde afsnittene om grids i 2 min i 2% uranylacetat i methanol efterfulgt af Reynolds blycitrat i yderligere 2 min 16.

2. Image Acquisition

  1. Large Scale STEM
    Bemærk: Vi bruger scanning EM med en ekstern scanning generator i stand til at erhverve flere store synsfelter ved høj opløsning 3,5,7,17 ​​hjælp STEM afsløring. Typisk, et billede genereret på denne måde svarer til de for udsyn ~ 100 Transmission Electron Microscope (TEM) billeder, væsentligt reducere mængden af ​​syning.
    1. Montering Prøve i mikroskop
      1. Placér gitter med sektion i holderen multiple gitter prøven og overføre ind i kammeret af SEM.
    2. Justering af STEM Detector
      1. Sæt nettet med prøven under bjælken og flytte det op, så det bliver ca.. 5 mm fra linsen pol. Anskaf et billede ved 20 kV ved hjælpin-linse detektor.
      2. Fokus på nettet kant og tilpasse arbejdstiden afstand til 4,0 mm.
      3. Flyt holderen prøven til et sikkert sted og bringe i STEM-detektor.
      4. Centrer hullet i STEM detektor i billedet-feltet ved at dreje reguleringer skruer mens billeddannelse ved maksimal hastighed med i-linse detektor.
      5. bringe forsigtigt tilbage prøven holder, som bare vil passe mellem linsen stang og detektoren.
      6. Anskaf et billede med i objektivet detektor at være sikker på at være på afsnittet området.
      7. Skift til STEM detektion (gain medium, og alle kvadranter sat på "minus") og erhverve et billede og vælge det område, der skal scannes.
      8. Hæv acceleration spænding til 21 kV og vente på stabilisering af bjælken (stabilt billede igen) og derefter gå til 29 kV i trin på 2 kV.
    3. Erhvervelse billeder
      1. Pre-bestråle prøven (for at forhindre lysstyrke ændringer forårsaget af e-stråle) ved at zoomeud, så den fuldstændige område, der skal scannes passer dokumentvinduet.
      2. Skift blænde til 120 um (for at holde den korrekte dynamikområde detektorens gevinster skal reduceres ét trin).
      3. De-fokus, så billedet er uskarpt.
      4. Gør det scannede område så stram som muligt ved hjælp af scanning valgmulighed reduceret areal.
      5. Indstil scanningshastighed sådan at en ramme scannes i ca.. 1 - 2 ud sek.
        Bemærk: Afhængig af størrelsen og væv dette tager typisk ½ time (100 x 100 um FOV) til op til 3 timer (1000 x 500 um).
      6. Zoom ind mindst 100X og scanne et lille område i 10 sek.
        Bemærk: Når dette område ikke ændrer lysstyrke i forhold til det omgivende, præ-bestråling er tilstrækkelig.
      7. Bringe tilbage den 30 um blænde (og STEM gevinst på medium)
      8. Fokus prøven.
      9. Juster blænde med svingeorganet (på ~ 40,000X forstørrelse).
      10. Mens i fokus vælge den letteste område / funktion, sæt scanningshastighed således at detaljerer synlige.
      11. I mikroskopet software justere lysstyrke og kontrast ved omhyggeligt at se histogrammet til at holde alle pixels i den dynamiske område. Gør det samme for de mørkeste område / funktioner.
      12. Gå tilbage til den lyse område og tjek igen. Vær på den sikre side, så der er plads på begge sider af histogrammet.
      13. Zoom ud, så hele området, der skal scannes passer den billeddannende vindue, og starte den store erhvervelse området program.
      14. Brug guiden mulighed for at oprette en mosaik ved at vælge et område fra skærmen. Brug pixelstørrelse 2. - 5. nm afhængigt af, hvad detaljerne er nødvendige. Brug opholdstid 3 mikrosekunder for STEM.
      15. Vælg option "autofokus på tidligere flise", bruge den store erhvervelse skala software autofokus med standard virksomhedsindstillinger, afkrydsningsfeltet "kontrollere indstillingen før udførelse" og definere, hvor at gemme dataene.
      16. Tryk på "optimere" for at kontrollere mikroskop indstillinger.
        Bemærk: Nu den nødvendige tid vil være shegen. Dette kan være op til 72 timer for 1 x 0,5 mm områder.
      17. I vinduet "maksimal flise opløsning" type vil 20.000 så enkelte fliser ikke være større end 20k x 20k, forhindrer stump kant effekter. Tryk på "udføre".
      18. Adspurgt til kontrol fokus og lysstyrke / kontrast (B / C), slukke ekstern scanning generator og omhyggeligt justere fokus og bygningsfejl i mikroskopet software. Du må ikke ændre B / C.
        Bemærk: Scenen kan flyttes og forstørrelse ændret sig, men forstørrelsen skal sættes tilbage til den ønskede pixelstørrelse.
      19. Tænd ekstern scanning generator igen, og tryk på "Fortsæt".

3. Data Analysis

  1. Åbn storstilet EM fil viewer program og åbne filen "mosaik info". Dette vil åbne alle flisebelagte tif-filer. Dette fortrinsvis udføres på en anden arbejdsstation til ikke hindre nye opkøb.
  2. Vælg option 'auat sy hele mosaik (parametre overlapper mode på halvdelen, syning tærskel 0,90, støjreduktion automatisk. Hvis syning kriterier ikke kan opfyldes, zoome ind og manuelt placere fliser i position og klik på 'fortsætter som er ").
  3. Eksporter som en html-fil, eller alternativt som en enkelt TIF.
    Bemærk, at for TIF eksportere kan være behov for en nedskalering. Medtag den endelige pixelstørrelse i filnavnet muliggør målinger senere.
  4. Udfør anmærkninger i TIF-fil ved at åbne den i et billedredigeringsprogram. Samtidig åbner zoomable html-fil i en webbrowser for optimal opløsning observation.

Representative Results

Storstilet EM datasæt af koronale sektioner af lederen af ​​en uger gamle zebrafisk larver viser mange væv og cellulære funktioner i en enkelt skala billede store (www.nanotomy.org).

Nanotomy af kontrol- hjernesektioner afslører typiske ultrastrukturelle træk af neuralt væv i rostralt forhjerne herunder olfaktoriske fiberbundter, neuronale kerner og neuronale undersektioner herunder synapser (figur 2A, www.nanotomy.org). Celletyper i hovedet, der kan skelnes omfatter chondrocytter med store vakuoler i underkæbe osmiophilic myelin af de olfaktoriske nerveceller, endotelceller af en lille beholder, strukturer omfatter Meninx (zebrafisk modstykke af meninges, den membranøs lag indkapsling den mammale hjerne). Subcellulære strukturer omfatter glycocalyx af epidermis, forskellige nukleare morfologier og foci i forskellige cel l typer og organeller herunder Golgi-apparatet, endoplasmatisk reticulum (ER), mitochondrier og synaptiske vesikler og post-synaptiske densiteter.

Uventet kernerne i celler, der beklæder ventrikel er meget elektron tætte forhold til andre celler dispergeret mere lateralt i hjernen. Derudover disse ventrikulære kerner viser mørk foci, der er fraværende i andre celler i hjernen og vises forskellige i størrelse og struktur fra heterochromatin, som findes i kerner af fagocyterende mikroglia (figur 2). Celler foring ventrikel i udviklingen zebrafisk omfatter det meste radiale gliaceller og neurale stamceller, som kan afspejle en ændret kromatin tilstand end mere differentierede celler. Som stamceller i væv er generelt ret sjældne, at nanotomy korrelere væv mærkning for stamcelle markører med væv skala EM kunne derfor anvendes til at identificere ultrastrukturelle træk af stamceller.

ve_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Storstilet EM (www.nanotomy.org) af en koronale sektion i en zebrafisk larve gennemgår neuronal ablation afslører mange specifikke væv og cellulære og molekylære funktioner ikke findes i kontroldyr. Cellular funktioner omfatter fagocytiske mikroglia og vakuoler størrelsen af celler, sandsynligvis repræsenterer døende celler (figur 2B, www.nanotomy.org). Tidligere EM undersøgelser har identificeret mikroglia i hvirveldyr 18,19. Karakteristiske træk ved mikroglia omfatter langstrakte kerner , klumper af pletvis kromatin siden af ​​nukleare kuvert, fremtrædende Golgi apparatet, gratis polyribosomer, kornet endoplasmatiske reticulum (ER) med lange smalle cisterner, relativt mørkt / tætte cytoplasma, og mange indeslutninger, såsom fagosomer, lipid dråber og lysosomer. Alle disse kendetegnende, tilskrives mikroglia i mammale væv, blev også fundet i disse celler i zebrafisk hjerner (figur 2B, www.nanotomy.org).

<p class = "jove_content" fo: holde-together.within-side = "1"> figur 1
Figur 1: Workflow af Storstilet Tissue Electron Microscopy på zebrafisk Brains. (A) 7 dage gamle zebrafisk larve. (B) zebrafisk larval hoveder indlejret side om side i epoxyharpiks. (C) Glas kniv til semi-tynde sektionering og orientere prøven. (D) repræsentant semithin toluidinblåt farvede snit, der viser to side-by-side indlejret zebrafisk larver. (E) Diamond kniv til at skære ultratynde (70 nm) sektioner. (F) Redigeret billede i (D) af hele zebrafisk larve hjerne afsnittet om med et hul gitter for at indikere positionering. (G) Mikroskopi, der anvendes til storstilet 2D EM i denne undersøgelse. (H) Flow af billedbehandling. klik herfor at se en større version af dette tal.

Figur 2
. Figur 2: Nanotomy Resultater:. Fra makromolekyle til Tissue (A) Nanotomy af hjerner af 7 dage efter befrugtning kontrol og (B) behandlet (neuronal ablation, figur 1), der viser de særlige træk ved neuronal ablateres degenerative hjerne (B) Disse omfatte fagocytiske mikroglia, mørke celler, der undergår celledød og svampet udseende neuralt væv ((A) og (B)). Øvre paneler (tilpasset fra 5): 10X forstørrelse af regionen er angivet i midterste paneler. Middle paneler: 10X forstørrelse af regionen angivet i lavere paneler. (A, midterste panel) Høj forstørrelse af neuropil viser synapser i (A, lavere panel), synaptiske vesikler (SVS), ogpostsynaptiske densitet (PD). (B, midterste panel) Stor forstørrelse visning af amoeboid mikroglia eller eventuelt en makrofag (midterste panel, M), der viser typiske amoeboid microgliale funktioner (nederste panel), herunder fremtrædende Golgi-apparatet (G), lunker herunder lysosomale vakuoler (L). Scale bars: 50 pm (øverst), 5 um (midterste) og 0,5 um (nederst). Dette tal er blevet ændret fra 5. Klik her for at se en større version af dette tal , eller besøg den fulde data online (nanotomy.org).

Discussion

EM tillader analyse af cellulær sammenhæng med høj opløsning billeddannelse af makromolekyler i biologiske sammenhæng. Men dette typisk begrænser synsfeltet. Større skala 3D EM er særligt velegnet til kortlægning neuronal konnektivitet ved at skabe nanoskala resolution 3 dimensionelle rekonstruktioner, der kræver kompleks databehandling 10. I modsætning hertil 2D stor skala EM kræver kun et enkelt afsnit og syning af billeddata, og vurdering af data er muligt af alle med adgang til en Internet browser. Vi og andre tidligere anvendte skala EM stor til at analysere væv og hele dyr. Som for de fleste tilgange, TEM og SEM-baserede syning har deres egne fordele. Her blev scanning transmission EM (STEM), der anvendes, der tillader dannelsen af ​​et stort synsfelt ved høj opløsning. Typisk en STEM billede svarer til de synsfelter på ca. 100 TEM billeder, en markant reduktion af mængden af ​​syning, når billeddannelse stor fields synspunkter i høj opløsning. Hvis der er behov højere opløsning, kan TEM være fordelagtig. STEM har den fordel i forhold TEM, at ikke-kontrast prøver kan anvendes med god ultrastrukturel kontrast 6.

Derudover kan den her beskrevne fremgangsmåde kan simpelthen tilpasses til anvendelse med tilbagespredt elektrondetektion (BSD) på Section monteret på silica wafers, udvidet brug til flere mikroskopsystemer. HTML-zoomable væv EM-filer er meget nyttige for kvantificering, deling af data, der ikke kan have været analyseret til sin fulde indhold, der kombinerer LM og EM data (Clem) 8, præsentationsformål i videnskabelig forskning, at analysere patientdata, og for uddannelse. Alternativt i stor skala EM i et SEM, men ikke i en TEM, silica vafler kan anvendes, som har to fordele kan anvendes BSD, som er mere generelt tilgængelige på scanning-elektronmikroskop end STEM detektion. For det andet, montering af store dele (> 1 mm 2 områder irenter) er ligetil. Montering på enkelt slidsede gitre er arbejdskrævende og teknisk udfordrende. Detaljeret sammenligning mellem TEM, SEM og STEM er detaljeret andetsteds 6. En ulempe ved BSD billeddannelse er, at i forhold til STEM, billeder har øget støj. Dette kan delvis kompenseres ved at forøge pixel opholdstid, hvilket resulterer i meget længere indfangningstider.

Selv for prøveforberedelse relativt standard EM behandling (fiksering, indlejring og sektionering) er nødvendig 5-7, det er teknisk udfordrende at skære store ultratynde sektioner helt blottet for artefakter. Sektioner er meget skrøbelige og kan nemt knække, fold eller ødelagt under billedbehandling, hvilket typisk tager flere timer pr datasæt. Men på grund af den online deling af de rå uvildige data, hvis det bliver muligt lettere at sammenligne med offentliggjorte data, og bruge offentliggjort datasæt i det åbne område som kontroller. I øjeblikket få EM-enheder i stand til laRGE-skala-analyse er i brug, og derfor adgang til denne teknik er noget begrænset, selvom de fleste billeddannende centre velkomne fælles indsats.

For store sektioner skal være ordentligt fast i hele prøven vævet. Derfor er en blanding af den hurtige, men moderat fiksativ PFA anvendes i kombination med den langsomme, men stærk fiksativ GA. Skæring og picking up store dele uden artefakter er vanskelig. Arbejde med vafler i kombination med BSD er lettere i forhold til at samle sektioner på enkelt hul net. Heavy metal efter farvningen er mere kritisk i forhold til klassisk EM. Da hele afsnittet afbildes hver artefakt vil være synlig. TEM-brugere typisk har svært ved at skifte til en SEM, på grund af forskellen i mikroskop drift.

Kvantificering og datadeling - Kvantificering subcellulære funktioner er svært i enkelte EM billeder. Muligheden for at zoome ind og ud af storebilleder let identifikation af celler af interesse, som kan følges af nanoskala målinger inde i cellerne. Disse datasæt viser, at bestemte celletyper hurtigt kan identificeres og kvantificeres i en fordomsfri måde i disse store vævssnit, baseret på funktioner påviselige i forskellige målestoksforhold. For eksempel mikroglia kan identificeres på grundlag af deres morfologi og tætte cytoplasma. Efterfølgende ved at zoome ind på de enkelte celler, nanoskala subcellulære og molekylære funktioner i disse celler kan måles i samme datasæt, som vi tidligere viste for ER bredde inden for en storstilet EM vævskultur datasæt 2. En yderligere fordel ved nanotomy er, at hosting af skala datasæt store online vil tillade andre at inspicere data, måske for andre funktioner, og drage deres konklusioner om ny hypotese.

CLEM - Ud over at lette kvantitativ EM, skala EM store gør det nemmere at korrelere lys microscopic mærkning til EM-niveau 8. I det foreliggende eksempel er vist tilstedeværelsen af ​​fagocytiske mikroglia i en zebrafisk ablation model. Et stort spørgsmål i neurovidenskab er, hvad de enkelte funktioner og bidrag er af mikroglia og potentielle andre kilder til fagocyterende og immunceller. Tidlige EM undersøgelser har vist markante subcellulære træk mikroglia i sygdom 18. Desværre er det svært at selektivt mærke mikroglia navnlig i en patologisk indstilling, de udviser stor overlapning med andre immunceller i genekspression, morfologi og funktion. Det er derfor uklart, om og hvornår mikroglia på ultrastrukturelle niveau adskiller sig fra immunceller fra andre kilder, herunder monocytafledt infiltrerende makrofager. Forståelse, om der er ultrastrukturelle forskelle mellem disse celler vil give et udgangspunkt for analyse af funktionelle forskelle. Kombination selektive transgene eller udtryk markører og CLEM tillader itfdeling af ultrastrukturelle funktioner selektiv til specifikke befolkningsgrupper.

Diagnose & præsentation og uddannelse - Ved at visualisere nanoskala til mikroskala inden for en enkelt datasæt EM data lettes meget til et bredt publikum. Med de øgede muligheder og værktøjer til korrelativ og storstilet EM forventer vi en genoplivning af EM i grundlæggende og medicinsk forskning. Vores metode er repræsenteret her påføres en zebrafisk hjerneskade model 5, men har været anvendt på humant væv 7, rottehjerne 3, i en rotte model for diabetes 4 og i cellekultur 2, og kan også anvendes i kombination med et TEM -baseret tilgang 1 viser alsidigheden af denne fremgangsmåde. Mikroskopet operatør ikke længere optagelse højt valgt, og dermed partiske billeder, men alle mange ultrastrukturelle funktioner registreres og åben for verdensomspændende analyse.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Flertal af arbejdet er udført på UMCG og Billeddannelse Center (UMIC), der er sponsoreret af NWO 175-010-2009-023 og ZonMw 91.111.006; STW "Mikroskopi Valley 12718" til BNGG. Dette arbejde blev sponsoreret af en ZonMw VENI tilskud, et Marie Curie karriere integration tilskud (besparelse døende neuroner) og en Alzheimer Nederland stipendium til TJvH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
  2. Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
  3. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
  4. Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
  5. van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
  6. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
  7. Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
  8. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
  9. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
  10. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
  11. Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
  12. van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
  13. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
  14. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
  15. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
  16. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
  17. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  18. Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
  19. Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics