Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

Developmental Biology

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Ulm, A., Mayhew, C. N., Debley, J., Khurana Hershey, G. K., Ji, H. Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (109), e53814, doi:10.3791/53814 (2016).

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Abstract

Introduction

Induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen Proben (hiPSCs) sind eine sich schnell entwickelnde Technologie der Stammzellforschung. Sie bieten eine Alternative zu embryonalen Stammzellen (hES) Forschung mit weit weniger ethischen und moralischen Nachteile 1,2. Obwohl sie zu hESCs 3-5 nicht epigenetically identisch sind, bieten eine einzigartige Möglichkeit hiPSCs Entwicklung und Krankheit Phänotypen zu modellieren, und sie können 5-8 aus Geweben mit Bezug auf die Krankheitszustand ableiten. Neue Methoden der Erzeugung von hiPSCs ständig erforscht werden optimale Zelltypen zu identifizieren , als eine Möglichkeit , mit zu beginnen, GMP-Qualität iPSCs für eine Transplantation geeignet, die Vorbereitung und auch 6,9-11 die Aktualität und Effizienz der Reprogrammierung zu erhöhen.

Epithelzellen der Atemwege sind kritisch für die Entwicklung von allergischen Entzündung 12 und das Epithel ist ein Haupttreiber von allergischen Reaktionen und Atemwegs Remodeling durch Interaktion mit Immune und Stromazellen. Das Atemwegsepithel spielt eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Persistenz von Lungenerkrankungen wie Asthma. Jedoch niedriger Epithelzellen der Atemwege sind schwierig in einer klinischen Umgebung, insbesondere von gesunden Kontrollpatienten und Kinder zu erhalten. Daten aus mehreren Studien unterstützen die Annahme , dass Epithelzellen aus Nasenschleimhaut sind ein gültiger und praktische Proxy für niedrigere Epithelzellen der Atemwege 13-20, vor allem , wenn Antworten auf Luftschadstoffe und Allergene zu studieren. Die Nasenschleimhaut besteht aus mehr als 90% ciliated Epithelzellen der Atemwege und Probenahme diese Nasenepithelzellen (NECs) leicht bei Kindern im Alter von vier Jahren oder fünf durchgeführt werden, da sie weniger invasiv als andere Zell- / Gewebeprobenahmetechniken und ist im Zusammenhang mit einem minimalen Risiko von unerwünschten Ereignissen wie Infektionen 20-23. Es bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, sowohl bei gesunden und kranken Kindern ohne lange, unnötige und oft schmerzhaft Bronchoskopie procedu zu probierenres, die Sedierung erforderlich machen. Frühere Studien haben festgestellt , dass Krankheit Asthma Schwere verwandte Subtypen können die Nasenschleimhaut in sowohl als auch Proben bronchial Zelle von asthmatischen Kindern genommen unterschieden werden, und der Genexpression zwischen den beiden Gewebetypen war ähnlich in etwa 90% der nicht-ubiquitären Gene 22 , 24. Als Quelle für iPSCs, NECs bieten Vorteile gegenüber anderen Zelltypen häufig verwendet. Fibroblasten werden häufig für iPSC Erzeugung verwendet, aber obwohl diese Zellen leicht kultiviert, aus einer Hautbiopsie sein kann, dieser Vorgang erfordert typischerweise Lokalanästhesie, einen Einschnitt und Nähten ist und mit einem gewissen Infektionsrisiko verbunden. Daher kann für diese Art der Biopsie von Patienten informierte Einwilligung schwierig sein 25. Eine Alternative zu Fibroblasten ist peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Jedoch kann es schwierig sein, ausreichend Blut für iPSC Generation von pädiatrischen Patienten zu erhalten. Darüber hinaus gibt es Einschränkungen nachgeschalteter apkationen für Fibroblasten und Blutzellen abgeleitet iPSCs, vor allem ihre Differenzierungsfähigkeit auf bestimmte Zelltypen 5,26. Daher die relative Zugänglichkeit und der geringen Gefahr von Nebenwirkungen im Anschluss an ihre Sammlung gegeben, NECs stellen eine ideale Zellquelle für iPSC Generation von pädiatrischen Populationen.

iPS-Zellen haben für das Studium der menschlichen Entwicklung, Herstellung neuer Krankheitsmodelle, und als eine potenzielle Quelle von Zellen für personalisierte Therapien eine Menge Aufmerksamkeit vor kurzem als Plattform erhalten. Bevor das volle Potenzial dieser Technologie realisiert werden kann, müssen die molekularen Grundlagen der Umprogrammierung aufgeklärt werden, aber jetzt dieses Protokoll und die im beschriebenen Verfahren werden die Forschung Studien konzentrierten sich auf Atemwegs Belichtungen aufzuklären, sowie eine Plattform für die Auswirkungen der personalisierten Medizin zu studieren Beteiligung iPSCs.

Die gemeinsame Arbeit von mehreren Labors hat zur gene geführtn für eine erfolgreiche Technik nicht nur für die Nasenschleimhaut Abtastung, sondern auch NECs Züchten und Umprogrammieren diese Zellen zu iPSCs 23. Dieser Artikel gibt einen Überblick über ein Protokoll für eine optimale Probenahme, Züchtung und Neuprogrammierung Bedingungen.

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Protocol

Das folgende Protokoll folgt den Richtlinien der Organe menschlichen Ausschuss Forschungsethik.

1. Probenahme der Nasenschleimhaut

HINWEIS: Sie erhalten Proben von Probanden, die frei von Anzeichen einer Atemwegsvirusinfektion sind.

  1. Bereiten Sie eine 15 ml konischen frisch vor dem Teilnehmer besuchen und 2 ml BEGM (Bronchial Epithelzellwachstum Medium) plus 20 ul sterile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%).
  2. Offene Zytologie Bürste kurz vor der Entnahme der Probe, und achten Sie darauf, Pinsel steril zu halten und berühren Sie es nicht zu irgendwelchen Oberflächen neben den Nasenflächen.
  3. Fragen Sie Teilnehmer, still zu sitzen und den Kopf kippen in Richtung Decke. Haben kleinere oder unruhiger Kinder sitzen auf ihren Händen und / oder Liegen weg swatting Bürste zu vermeiden.
  4. Richten Sie Pinsel auf der Rückseite der Nase, wo der Durchgang (Sieht aus wie ein kleines schwarzes Loch) verengt. Schieben Sie Bürste nach unten und drehen Sie die Handgelenke wie die Bürste aus nostri entferntl.
  5. Legen Sie Pinsel in konisch und versenken in BEGM. Das überstehende Bürste und ersetzen Kappe auf dem Rohr. NICHT VORTEX.
    HINWEIS: Wenn der Teilnehmer bereit ist, eine zweite Bürste in der gleichen Weise erhalten, aber in der zweiten Nasenloch. ein Bürsten der beiden Nüstern Gewinnung führt zu einer höheren Wahrscheinlichkeit zur Folge haben, dass die Probenahme erfolgreich sein wird. die gleiche Nasenloch Probenahme kann zu Blutungen und wird wahrscheinlich nicht um die Probe zu verbessern.
  6. Halten Proben so nahe 37 ° C wie möglich während des Transports einen Becher mit warmem Wasser.

2. Zellzahl und Cytospin

  1. leicht bewegen Sie die Bürste in BEGM und 10 ul der Probe für eine Zellzahl nehmen einen Hemacytometer verwenden. In 10 ul einer Live / Dead-Fleck und zählen nur Zellen unter einem Mikroskop leben.
  2. Bis zu 50 & mgr; l der Probe und mit Wasser auf 200 ul mit 1x PBS. In den Cytospin Trichter an Glasobjektträger und Spin bei 300 Umdrehungen pro Minute für 2 min. Lassen Sie gleiten trocken O / N und Flecken Rutsche following Anweisungen des Herstellers. Erlauben O / N, vorzugsweise im Dunkeln zu trocknen.
  3. Stain Slide mit Hema 3 Stain
    1. Bringen Sie jede Lösung (Hema Fixiermittel, hellblau; Hema 3 Lösung I, rosa und Hema 3 Lösung II, tiefblau) in eine Färbung Schale; Halten bedeckt, wenn sie nicht in Gebrauch ist. Legen Sie Dias in Färbesystems Boot
    2. Dip Slides kontinuierlich in Fixiermittel für 30 Sekunden, dann lassen Überschuss ablaufen lassen. Dip Slides kontinuierlich in Lösung I für 30 Sekunden, dann überschüssiges abtropfen lassen. Dip Slides kontinuierlich in Lösung II für 30 Sekunden, dann überschüssiges abtropfen lassen
    3. Spülen mit VE-Wasser, bis das Wasser klar bleibt. Erlauben O / N, vorzugsweise im Dunkeln zum Trocknen
  4. Schauen Sie sich Schlitten unter dem Mikroskop und Zählen von Zellen bestimmen Prozentsatz von Epithelzellen. Sollte 90% oder mehr, wenn Probenahme gut ist.

3. Seeding Zellen

HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren in einem richtigen und zertifizierten GewebekulturKapuze mit steriler Technik.

  1. Coat-Platten mit Rinderhautkollagen (BDC), Typ 1. In 0,5 ml 3 mg / ml BDC verdünnt in 49,5 ml 1x PBS. Bereiten weniger, wenn nur wenige Platten verwendet. Mantel eine T25-Flasche mit 2 ml BDC und Inkubation in sterile Haube O / N oder bei 37 ° C für 2 Stunden, falls erforderlich.
  2. Nach der Inkubation aspirieren jede verbleibende Flüssigkeit. Expose Flaschen mit UV-Licht für 30 Minuten in sterilen Haube. Shop-Flaschen für bis zu einem Monat bei 4 ° C, aber bringen sie auf RT oder 37 ° C, bevor Zellen Aussaat.
  3. Halten Sie Bürste und Zellen in BEGM bei 37 ° C, bis sie bereit zu säen. Leicht Swish Bürste innen konisch, aber nicht vortexen.
    1. Platte 7 x 10 5 Zellen in einem T25 - Kolben. Wenn es weniger ist, verwenden Sie einen kleineren Behälter, wie eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Diese Größe Platte erfordert etwa 3 x 10 5 Zellen.
      HINWEIS: Wenn es nicht so viele Zellen sind, ist es nicht ratsam ist, fortzusetzen.
  4. Unter einer sterilen Haube nehmen Bürste aus Rohr und gently drehen Bürste auf der Oberfläche des beschichteten Kolben, darauf achten, daß die Beschichtung zu kratzen. Entsorgen Sie Bürste in einem geeigneten Behälter für biologischen.
  5. Langsam Pipette die restlichen Zellen in BEGM aus dem konischen und in den T25-Flasche. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Eine Anzahl von schwimmenden Zellen wird beobachtet werden , und es kann einige Trümmer von der Nase sein, die in dieser Stufe (3A) akzeptabel ist.

4. Zellkultur

  1. Nachdem die Zellen Aussaat, lassen Sie sie für 48 Stunden ohne Unterbrechung (Abbildung 3) zu begleichen. Nach 48 Stunden, fügen Sie langsam und vorsichtig 2 ml warmem BEGM und 20 ul sterile penicilin / Streptomycin / Fungizone (P / S / F).
    HINWEIS: NICHT die ursprünglichen 2 ml Medium absaugen.
  2. Am 4. Tag nach der Aussaat, sorgfältig alle Flüssigkeit absaugen und ersetzen mit 4 ml frisch, erwärmt BEGM und 1x Pen / Strep (Fungizon ist nicht mehr erforderlich). Ändern Medien alle zwei Tage und bewerten Zellen anhängenment, das Wachstum und Zusammenfluss. Wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz, in der Regel in 2-3 Wochen, sind sie bereit, agiert werden.
  3. Einem T25 - Kolben (etwa 2,5 x 10 6 Zellen , wenn sie konfluent) in drei T25 Kolben oder einem T75 - Kolben passagiert werden. Nach dem ersten Durchgang sollten die Zellen robust und gesund sein, Einmündung etwa alle drei Tage zu erreichen.

5. Passagierung Zellen

  1. aspirieren vorsichtig die Medien von der Platte. 1 ml 0,05% Trypsinlösung pro T25-Flasche an der Platte und in den Inkubator für etwa 4 min, oder bis die Zellen lösen sich von Platte. Überprüfen Sie die Höhe der Ablösung von Zellen alle 2 Minuten und nicht verlassen Trypsin auf mehr als 10 min.
  2. 5 ml Trypsin-Neutralisationslösung (TNS) oder serumhaltigen Medien das Enzym zu neutralisieren. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und Zellen aus dem Kolben und in einem 15 ml konischen Röhrchen.
  3. Zentrifuge bei 200 xg (Beschleunigung 0 Verzögerung 0) für 5 min ein Zellpellet zu erhalten. absaugen supernatant und resuspendieren Zellen in BEGM + P / S in dem Volumen für die neuen Flaschen erforderlich (4 ml für einen T25-Kolben wurden 10 ml für einen T75-Kolben)
  4. Führen Zellzahl mit einem Live / Dead-Fleck wie oben (2.1) beschrieben. Fügen Sie entsprechende Menge an BEGM und Zellen zu den beschichteten Kolben und zurück in den Inkubator. Halten , wie detaillierter oben oder Kryokonservierung Medium (70% BEGM, 20% FBS und 10% DMSO) in einer Konzentration von 0,5-2 x 10 6 Zellen pro ml in einfriert.

6. Umprogrammierung zu iPS-Zellen

HINWEIS: Vor dem iPSCs Erzeugung gewährleisten die Einhaltung aller institutionellen Regelungen, die Erzeugung und Verwendung von menschlichen iPS-Zellen gelten. Sterile Technik ist besonders wichtig für iPSC Kulturen, als Kulturmedium routinemßig keine Antibiotika enthalten. Es ist wichtig, dass NECs scheinen gesund und kräftig sind proliferative für erfolgreiche Neuprogrammierung.

  1. Tafel 5 x 10 5 NECs pro Vertiefung einer 6 - Well - Gewebekulturplatte. Nach 24 Stunden hinzufügen Polybrenzu BEGM bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml und transduzieren NECs durch lentivirale Partikel exprimieren Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc zu den Medien hinzugefügt wird. Richten Sie eine Vielzahl der Infektion (MOI) von ~ 5 27 zu erreichen.
    1. Um das MOI Bestimmung, bereiten serielle Verdünnungen der konzentrierten-lentiviralen Lager und HT1080-Zellen mit diesen Verdünnungen transduzieren. Nach dem ersten, durch die Bewertung der Anzahl von dTomato-positive Zellen / kleine Klumpen von Zellen in jeder Verdünnung die Anzahl der "transduzierenden Einheiten / ml" unzweideutig Detektion dTomato Expression in den HT1080-Zellen, zu berechnen.
      HINWEIS: In der Regel wird es Verdünnungen sein, die zu hoch sind (alles ist dTomato positiv) und zu niedrig (kein oder nur ein paar positive Zellen).
    2. Führen Sie Scoring aus den Verdünnungen, in denen diskrete positive Zellen / kleine Klumpen von Zellen identifiziert. Bestimmen des Titers durch die Anzahl der Korrektureinheiten / ml mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor transduzieren. MOI ist dann das Verhältnis der Zahlvon 27 Zellen auf die Anzahl von Viruspartikeln transduziert.
      HINWEIS: Jede dTomato positive Zelle / kleine Klumpen wird angenommen, aus einem einzigen Viruspartikel entstehen.
  2. Etwa 3 Stunden nach der Transduktion, entfernen Medien und ersetzen mit frischen BEGM. Entsorgen Sie Lentiviren haltigen Medien mit institutionell genehmigten Verfahren. Zurück transduzierten NECs in den Inkubator für 3 Tage.
  3. Am Tag 3 ersetzen Medien mit frischen BEGM und dann für weitere 3 Tage inkubiert. Absaugen verbrauchte Medien, Zellen mit 1x PBS waschen und 1 ml 0,05% Trypsinlösung zum Brunnen hinzuzufügen. Passage-Zellen mit Trypsin, wie oben (Abschnitt 5) geschrieben. vorsichtig absaugen Überstand und resuspendieren Zellen in 4 ml BEGM + P / S. Die Zellen können zu einer neuen Vertiefung einer 6-Well-Platte mit BDC oder hinzugefügt, um MEF Kulturen, wenn bereit (siehe nächster Schritt) beschichtet agiert werden.
  4. Bereiten Sie MEF-beschichtete Platten. Am Tag 4 0,1% Gelatine-Lösung (1 ml / Well) bis 2 Vertiefungen einer 6-Well hinzufügen (auszuführen +/- Thiazovivin (SPT) siehe Schritt 6.6). Auf der nächstenTag, ein Fläschchen mit inaktivierten MEF 28 aufzutauen.
  5. Platzieren MEFs in 10 ml MEF Medien (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Spin bei 200 xg für 5 Minuten zu pelletieren. Resuspendieren in MEF Medien. Absaugen Gelatine aus 6 - Well - Platte und fügen 1,87 x 10 5 MEFs pro Vertiefung der Gelatine beschichtete 6 - Well - Platte. O / N bei 37 ° C inkubieren, oder für mindestens 24 Stunden.
  6. Transfer 2 ml BEGM enthaltenden Zellen transduziert pro Vertiefung in zwei Vertiefungen einer zuvor beschichteten 6-Well-Platte und Inkubation O / N. Am nächsten Tag, ersetzen BEGM mit 2,5 ml pro Vertiefung von Standard hESC Medien mit 4 ng / ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Feed-Zellen mit frischen hESC Medien +/- SPT täglich für 10 Tage
    HINWEIS: Es ist möglich , einen Cocktail aus kleinen Molekülen (SB431542, PD0325901 und Thiazovivin (SPT) Cocktail) hinzuzufügen , für NECs 23 , um die Effizienz und die Kinetik der Reprogrammierung zu verbessern.
  7. Nach zehn Tagen weiterhin täglich mit hESC Medien ohne SPT zu ernähren. Feed-Kulturen täglich bis hESC artige Kolonienerscheinen (5A, P0 Kolonie). Identifizieren Kolonien mutmaßliche iPSCs durch ihren hohen Kern: Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen.
  8. Manuelles Verbrauch und Transfer Kolonien mit hESC förmige Morphologie zu trennen Brunnen für Kultur und Expansion als separate Leitungen in einem Zubringer freies System. Abgeschnittene Kolonien sollten sich schnell an diese Bedingungen angepasst werden.
    1. Nach dem Plattieren exzidiert Kolonien werden diese diskreten putative iPSC Linien nun Passage betrachtet 1 (p1). Futterkulturen täglich mit mTeSR1. Passage und erweitern iPSC Linien unter Verwendung von Standardverfahren. Es kann mehrere Tage bis zu einer Woche dauern, p1 Kolonien, die Größe zu erreichen, an dem sie agiert werden soll.

7. Die Aufrechterhaltung iPSCs in Kultur

  1. Düngung und bewerten Kulturen täglich. Manuelle Verbrauchsbereiche mit einem sterilen Glaspipette oder Mikropipette durch Schaben Spitze offenkundige Differenzierung zeigen. Ändern Medien nach der täglichen Kommissionierung.
  2. Passage-Zellen nach der Angleichungpro Vertiefung einer 6-Well-Platte (die Hälfte der Fütterung Volumen), dann bei 37 ° C für ca. 4 min vorsichtig absaugen Medien, 1 ml warmem Dispase (1 mg / ml) hinzu: dig alle vier Tage. Die Ränder der Kolonien beginnen, zu heben, die um die Kolonie wie ein weißer Umriss aussieht. aspirieren vorsichtig die Dispase und wasche 3x mit erwärmtem DMEM / F12.
  3. 2 ml mTeSR1 und verwenden Sie einen Zellheber, die Kolonien von der Platte zu heben. Verwenden Sie eine 5 ml serologische Pipette oder P1000 Mikro sanft um die Zellen zu verreiben, bis die Kolonien in kleinere Cluster gebrochen werden.
    1. Vermeiden Sie sehr kleine Cluster oder einzelnen Zellen produzieren, als das Überleben und die anschließende Proliferation wird suboptimal sein. Wenn Kolonien wieder Plattierung, ein 1: 4 bis 1: 6 Split wird eine optimale Kolonie Dichte aufrechtzuerhalten. Sanft Kolonien und Medien von der Platte zu entfernen und zu neuen, Matrigel beschichteten Vertiefungen hinzuzufügen.

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Representative Results

Der erste Teil der Nase, der Nasenvorhof genannt wird , ist der Bereich von Knorpel umgeben 29. Die Bürste muss glatt gehen vorbei diesem Bereich der Nase, über die Nasenklappe (Ostium internum oder das "schwarze Loch" auf der Rückseite des Nare zu sehen ist ), und die Probe wird von der unteren Nasenmuschel (Abbildung 1) erhalten. Die Nasenmuscheln sind knöcherne Strukturen, die die Oberfläche der Nase 29, so dass sie eine ideale Lage für die Probenahme erhöhen. Das Gebiet wird auch von gefäßSchleimhautGewebe ausgekleidet, die eng an die Verkleidungen der unteren Atemwege ähnelt und ist auch aktiv in der Immunantwort auf Umwelteinflüsse.

die korrekte Gewebeentnahme sorgt dafür, dass die Zellen, die Epithelzellen neu programmiert werden. Dies kann durch die anfängliche Zellzahl und Cytospin bewertet werden, sondern auch, indem die Zellen in Kultur zu beobachten. DasCytospin, einmal zentrifugiert, getrocknet und gefärbt, zeigt die Zusammensetzung der Probe. Die meisten Proben bestehen aus Epithelzellen, die mit einem runden Kern säulen und ciliated sind. Mit dem Hema 3 Fleck - Kit, färben sie eine hellblaue Farbe mit einem dunkleren lila Kern (Abbildung 2), und oft , wenn sie direkt aus der Nase sie zusammen verklumpt gesehen getroffen werden. Obwohl nasal Zellproben zunächst eine Mischung von Zelltypen sowie Schmutz von der Nase, mit der Zeit in der Kultur und mit Medien ändert, werden die Epithelzellen überwiegend (3A, B). Wenn Epithelzellen Konfluent wachsen, werden sie wie eine frisch aufgebrochene eiförmigen, wo der Kern groß ist und in der Mitte befindet und das Zytoplasma ist eine Art "Annäherung" und Strecken wie die Zelle (3B) zu teilen bereitet. Da die Zellen wachsen zusammen, beginnen sie auf eher eine Fußballform zu nehmen und zusammen passen genau in die Schale (Abbildung3C).

Sobald die Zellen transduziert sind, werden sie den tdTomato Fluoreszenzmarker in den Zellkern auszudrücken. Abbildung 4 zeigt die Zellen , sobald sie transduziert worden sind, in Hellfeld-, Fluoreszenz- und beide Bilder zusammengeführt. Nicht drückt jede Zelle die Markierung und damit nicht jede Zelle wurde transduziert, aber jeder sollte gut über 90 Prozent Transduktionswirksamkeit haben, und dies wird die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass einige Zellen Pluripotenz, nachdem sie plattiert auf MEFs erreichen wird.

Sobald cokultiviert mit MEFs und als Zellen beginnen, Kolonien zu bilden, werden sie nach und nach aufhören tdTomato Ausdruck zu bringen. Dies ist jedoch nicht die beste Anzeige der Koloniebildung. Der beste Beweis für die Koloniebildung ist eine visuelle Bestätigung. hESC Kolonien, die der "Goldstandard" der Pluripotenz sind, sind meist rund und bestehen aus vielen kleinen, runden Zellen mit large Kerne und ein hohes Nukleus Zytoplasma-Verhältnis. Jede Zelle scheint vor allem von den Kernen zusammengesetzt, und andere Organellen sind nicht deutlich sichtbar. Nach iPSC Kolonie Ernte und Kultur in Standard - Feeder freien Bedingungen neu iPSC gebildeten Kolonien sollten ähnlich wie ihre Pendants hESC aussehen, und die einzelnen Zellen sind fast identisch mit dem hESC Phänotyp, wie es in 5B zu sehen.

Vor Verwendung von iPS-Zellen erzeugt aus Nasenepithelzellen (NEC-iPS-Zellen) in Experimenten, ist es ratsam, die Qualität der neuen Linien zu beurteilen. Dies umfasst in der Regel Beurteilung der Karyotyp, die Expression von Pluripotenz Marker und die Fähigkeit von iPS-Zellen in jede der drei embryonalen Keimschichten (Endoderm, Mesoderm und Ektoderm) zu unterscheiden. Differenzierungskapazität kann auf vielfältige Weise untersucht werden, aber derzeit die strengsten Test ist der Test Teratom 2,23,30. Weitere umfassende Tests wie Transkriptions und epigenomischen Profilierung sind nützlich , um zu bestimmen , ob irgendwelche Chromosomenanomalien durch Umprogrammieren 23 eingeführt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Inferior Turbinate. Sampling - Bewegung und die Sampling - Ziel, die untere Nasenmuschel, wird durch schwarze Pfeil angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Cytospin. Die meisten der Probe besteht aus Epithelzellen, die lang sind und säulenförmig, mit Cilien an einem Ende und einem runden Kern am anderen Ende . Sie werden oft zusammen verklumpt, wenn sie direkt aus dem Nare abgetastet. Die Pfeile zeigen die einzelnen Epithelzellen."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Primäre Nasenepithelzellen in der Kultur. (A) Schwimmdock Zellen und Trümmer unmittelbar nach der Entnahme und dem überzogen. (B) Zellen einen Tag nach einer Passage wird. Zellmorphologie ist konsistent und die Kultur besteht in erster Linie aus Nasenepithelzellen, 10 - facher Vergrößerung, und (C) 5fache Vergrößerung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Transduction von NECs. Cells wobei genommen haben transduzierten den Vektor und zeigen die rote Fluoreszenzmarker tdTomato. Diese Markierung sollte verblassen, wie sie in Richtung zu einem pluripotenten Zustand Fortschritt. (A) Hellfeldbild von transduzierten Zellen. (B) Fluoreszenzbild von transduzierten Zellen. (C) Überlagerung von Hellfeld und Fluoreszenzbilder (Tafeln A und B). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. iPSC Stammzellenartige Kolonien. (A) Anbau auf MEFs, Kolonie auf Kanten meist rund und zeigt wenig bis gar keine Differenzierung. (B) Einzelne Zellen zeigen typische hESC-ähnliche Morphologie, mit kleinen runden Zellen mit großen Kernen.5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Nasale Epithelzellen (NECs) sind eine leicht zugängliche Plattform für Atemwegserkrankungen zu studieren und NEC-iPS - Zellen bieten einen spannenden Weg die Entwicklung der Krankheit, Behandlung und Therapie 1,31,32 zu erkunden. NECs kann leicht ohne stressig oder potenziell schädlichen Verfahren 6,23 erhalten werden. Unserer Erfahrung nach der Probenahme der Nasenschleimhaut, wie in diesem Protokoll beschrieben wird weniger Stress und besser als die Blutentnahme für Kinder wahrgenommen werden. Daher kann dieses Verfahren besonders nützlich sein bei pädiatrischen Patientenpopulationen und relevant für Atemwegserkrankungen zu studieren. Der andere Vorteil des NECs ist, dass, sobald sie in der Kultur sind, sind Epithelzellen mit Medien und Kulturbedingungen ausgewählt für und homogen geworden. Dies ist vorteilhaft, als ein komplexes Gewebe wie Blutzellen verwendet und erleichtert es, die Auswirkungen von Zellursprung zu bewerten in ergeb iPSC Linien transkriptomischen und epigenetische Ansätze.

Wanndie Nasenschleimhaut Abtasten, ist es wichtig , dass der richtige Bereich der Nase abgetastet wird , so daß hauptsächlich Epithelzellen abgerufen werden, wie durch die Cytospin unter dem Mikroskop (Figur 2) angezeigt wird . Die richtige Probenahme werden ≥90% Epithelzellen ergeben. Es ist wichtig, zu erhalten, Proben von gesunden Patienten und um sicherzustellen, dass die Probe in geeigneter Weise, um gesammelt die Zellzahl erhalten und plattiert zu maximieren. Die Drehbewegung in dem Protokoll (Abschnitt 1.5) beschrieben wird sichergestellt, dass die Bürste in Kontakt mit so viel von der Nasenfläche wie möglich kommt. Es ist ein natürlicher Reflex, den Kopf zu drehen, wenn ein Fremdkörper in Richtung auf das Gesicht geht. Daher wird in dem Fall, dass ein Kind seinen Kopf dreht oder wegzieht, ist es wichtig, dass die Abtastung schnell und präzise erfolgt. mit diesen Techniken wird die Effizienz eines jeden anderen Schritt des Protokolls, und bestimmen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Neuprogrammierung erhöhen. Fragen das Kindhinlegen, und selbst unter ihnen, ihre Hände zu legen oder ein Elternteil oder Geschwister halten ihre Hände haben, ist ein guter Weg, um sie zu liegen immer noch zu fördern und einen reibungslosen und schmerzlos Probensammlung garantieren zu helfen.

Vor kurzem haben einige andere Probenahmetechniken für Komfort, Leichtigkeit und Probenergebnisse ausgewertet, basierend auf Zellgehalt und die Zusammensetzung sowie RNA und DNA ergibt 33. Die Gruppe überprüft Probenahme mit einer Zytologie Bürste im Vergleich zu einem Polyester-Tupfer, und sie abgetastet sowohl den unteren Nasenmuschel sowie die vorderen nares durch kräftig den Pinsel oder Tupfer um die nares wirbeln. Abtasten der unteren Nasenmuschel mit einer Bürste wurde festgestellt, etwas unangenehm zu sein, obwohl es die besten RNA-Ausbeuten brachte und bestand aus den meisten Flimmerepithelzellen, wie einen Polyester Tupfer verglichen. Das Verfahren in diesem Protokoll vorgeschlagen wird daher als das zuverlässigste Verfahren zur Abtastung der nasalen Epithelien als Weg prüft Atmungs Atemweg zu studierenEpithel.

Sobald die Probe erhalten wird, muss es bei 37 ° C gehalten werden. Eine der effektivsten Möglichkeiten, um ein Becher Wasser auf mehr als 37 ° C und schmiegen sie in einem Styropor-Behälter für den sicheren Transport zu erwärmen, während der Vorbereitung der Teilnehmer gerecht zu werden. Kurz bevor die Probe entnommen wird, fügen Sie kaltes Wasser, so dass die Temperatur auf etwa 37 ° C gebracht wird, und das konische Röhrchen mit den Medien hinzuzufügen. Wenn die Bürste mit dem konischen Röhrchen gegeben wird, kehrt das Rohr unmittelbar in das Wasserbad und dort zu halten, bis sie ins Labor zurückgeschickt werden können, an welcher Stelle sollte das Rohr in einem geregelten 37 ° C Wasserbad gestellt werden, bis die Zellen sind ausgesät auf eine Kulturflasche. An allen Stellen sollten sterile Technik verwendet werden, um Fremdagenten in die Kultur zu vermeiden einzuführen.

Eine beträchtliche Menge an Variabilität zwischen den Proben beobachtet wurde, wenn die Zellen in Kultur gebracht wurden. Diese Variabilität schien von Stammzellen sowohl der Geberquelle sowiedie Probenqualität selbst. Eine Möglichkeit, Probenqualität zu erhöhen, ist eine Bürste aus jedem Nasenloch zu erhalten, oder zwei Bürsten pro Teilnehmer. Nach der frischen Probe Impfen, und wie die Zellen passagiert werden, sollte der Zustand der Zellen regelmäßig sicher zu sein, überwacht sie fit sind neu programmiert werden. Die Zellen, die die besten Kandidaten für die zu machen sind diejenigen, die die Kultur nehmen und schnell vermehren. Es ist nicht bekannt, warum Zellen von bestimmten Spendern robuster sind als die von anderen Zellen, aber es kann auf Faktoren wie Alter, Größe der Nase und Gesundheit des Spenders zum Zeitpunkt der Probenahme fällig. Wenn eine Probe Ausbeuten sehr wenige Zellen oder nur eine geringe Anzahl von Zellen attach einmal überzogen, ist die Probe unwahrscheinlich Konfluenz wachsen. Wenn ein erfolgloser Kulturkonfluenz tut erreichen, neigen die Zellen schwach und viele Zellen während der Passagierung sterben zu sein. Diese Art der Probe ist ein sehr schlechter Kandidat für die Umprogrammierung, da es wesentlich ist, dass die Zellen schnell und robust proliferierenden sein, und dass siezum frühestmöglichen Passage-Nummer transduziert. Es ist nicht ratsam, zur Transfektion von Zellen, die langsam wachsen, ob es sich um Spender Variabilität, schlechte Probenahme zurückzuführen ist, oder Passagierbarkeit Kulturen zu dünn. Wenn eine Anpassung mit einer schlechten Zellkultur versucht wird, ist es unwahrscheinlich, Früchte tragen, um fortzufahren.

Vorbereitung der Zellen für die Transduktion ist ein Teil des Protokolls, das am schwierigsten zu bereiten. Bezogen auf das Wachstum der Zellen, 2 x 10 5 bis 5 × 10 5 Zellen werden zur Transduktion und dies kann in Abhängigkeit von bestimmten Patientenproben vorgeschlagen. Daher kann es einige Brunnen mit unterschiedlichen Zellzahlen plattiert erfordern die ideale Zahl zu erhalten.

Dieses Protokoll beschreibt nicht nur die Leichtigkeit der Probenahme, sondern auch die relative Leichtigkeit und Zeit von primären Zellkulturen zur Gründung und anschließende Umprogrammierung von primären Zellkulturen zu iPS-Linien für eine nachhaltigere und vielseitige Forschungsmöglichkeiten. Das ganzeProzess von Klinik zu Errichtung von diskreten iPSCs in Kultur dauert etwa 3 Monate, und neue Methoden zur Umprogrammierung Zeiten verkürzt werden 6,34,35 entwickelt. Dieses Feld entwickelt sich schnell effizienter und vollständige Wege zu finden, primären Zellen zu iPS-Zellen umzuwandeln und anschließend iPSCs in spezifische Zell- und Gewebetypen von Interesse unterscheiden. Jedoch Differenzierungsprotokollen für Gewebe wichtig für Atemwegserkrankungen, wie dem Lungenepithel, noch 36-38 arbeitet werden.

iPSCs von NECs hat den Vorteil einer einfachen und relativ schmerzlos Isolierung von Zellen zu erzeugen. Weiterhin ist es möglich, dass NEC-iPSCs bieten Vorteile gegenüber den aus anderen Gewebetypen abgeleitet iPSCs, die ausgenutzt werden können. Die Auswirkungen von iPS Epigenetik auf nachfolgende iPSC Differenzierung ist nicht vollständig verstanden, obwohl Beweise zeigen, dass Maus und Mensch iPSCs Transkriptions und epigenetische Gedächtnis ihrer somatischen Zelle HafenUrsprung und dass dies begünstigt selektiv deren Differenzierung in Linien mit dem Spenderzelltyp zugeordnet sind, während Einschränkungen für andere Schicksale 5,26. Aufgrund der Bedeutung des Ursprungsgewebe, und wie diese Auswirkungen die funktionellen Eigenschaften von iPS - Zellen, insbesondere im Hinblick auf die Speicherung von gewebespezifischen epigenetische Markierungen 39-45, iPSC Linien müssen besser , um deutlicher untersucht werden , um zu verstehen , die Auswirkungen des Ursprungsgewebes. Es wurde bereits gezeigt, dass NEC stamm iPSCs eine genomische Methylierungssignatur Hafen anzeigt Beibehaltung eines epigenetische Gedächtnis ihres Ursprungsgewebes 23. Solche in NEC-iPS-Zellen beibehalten epigenetische Speicher kann bei der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in Atemwegszellen von Vorteil sein, da frühere Studien, dass die Blutzellen abgeleitet iPSCs ausstellenden epigenetische Gedächtnis der Blutzellen Ursprungs mehr sind leicht in Blutzellen als Fibroblasten differenziert gezeigt haben, oder glatten Muskulatur abgeleitete iPSCs bloo fehltd zellspezifischen epigenetische Gedächtnis 5,26. Angesichts der enormen Potential von iPS-derived Atemwegszellen für die Modellierung von Lungenerkrankungen, wird es wichtig sein, zu untersuchen, ob NECs eine optimale Zelltyp zur Differenzierung von iPS-Zellen in der Atemwege Zellen / Gewebe darstellen. Zusätzlich kann diese stabil beibehalten Speicher chromosomalen Stellen resistent gegen Umprogrammierung und Kandidaten für Erkrankungszustände von Spenderzellen darstellen. Als Protokolle iPSCs zu konvertieren 36-38 an proximalen und distalen Lungenzelltypen entwickelt, können diese NEC-iPS - Zellen einen Vorteil bei der Modellierung AtemwegpatientInnen wie Asthma, COPD, Mukoviszidose, und viele andere , und bei der Untersuchung der Umweltwirkungen auf die Lungenentwicklung und Homöostase.

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Acknowledgments

Die Autoren möchten die pluripotente Stammzelle der Einrichtung und dem konfokalen Imaging-Core in Cincinnati Kinderkrankenhaus anzuerkennen. Diese Arbeit wurde von R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) und 2U19AI70235 (GKKH) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml conical Fisher Scientific 14-959-49D Protocol Step 1.1.
BEGM Lonza CC-3170 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide Life Technologies 15240-062 Protocol Step 1.1.
Penn/Strep Life Technologies 15140-122 Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush Fisher Scientific 22-263-357 Protocol Step 1.2.
trypan blue Fisher Scientific MT-25-900-CI Protocol Step 2.1.
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-54 Protocol Step 2.1.
PBS Fisher Scientific BP2438-4 Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips Fisher Scientific 10-357 Protocol Step 2.2.
cytospin funnel Fisher Scientific 23-640-320 Protocol Step 2.2.
Cytospin 4 Fisher Scientific A78300003 Protocol Step 2.2.
blank slide Fisher Scientific S95933 Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit Fisher Scientific 22-122-911 Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1 Life Technologies A1064401 Protocol Step 3.2.
T25 flask Fisher Scientific 08-772-45 Protocol Step 3.3.
Trypsin Lonza CC-5012 Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002 Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 °C for 30 min Sigma-Aldrich F2442 Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% Sigma-Aldrich D2650 Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus* e.g. Millipore SCR511 Protocol Step 6.4. 
A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting 
polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220 Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem  GSC-6301G Protocol Step 6.4.
hESC media See recipe included in protocol Protocol Step 6.11.
SB431542 Stemgent 04-0010 Protocol Step 6.11.
PD0325901 Stemgent 04-0006 Protocol Step 6.11.
Thiazovivin  Stemgent 04-0017 Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel BD Biosciences 354277 Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well Fisher Scientific 08-772-1B Protocol Step 6.13.
mTeSR1 StemCell 5850 Protocol Step 6.13.
250 ml disposable filter flask (0.22 µm) Fisher SCGP-U02-RE 
dispase StemCell 7923 Protocol Step 7.3.
DMEM/F12 Life Technologies 11320-033 Protocol Step 7.3.
cell lifter Fisher Scientific 08-100-240 Protocol Step 7.4.
hESC Media** Protocol Step 6.11.
components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 °C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 °C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media Invitrogen  11330-032 Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR) Invitrogen 10828-028 0.2
200 mM L-glutamine Invitrogen 25030-081 1 mM
55 mM ß-mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 0.1 mM
100x non-essential amino acids Invitrogen 11140-050 1x
2 µg/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) Invitrogen 13256-029 4 ng/ml

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