Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

İskelet kası terminal farklılaşma iskelet hücreleri pluripotent mezodermal öncü hücrelerin taahhüdü ile başlar. Bu hücreler hala çoğalmaya yeteneğine sahip ya da myofibers oluşturmak için daha olgunlaşmak çok çekirdekli miyotüplerinden, içine ayırt ve sigorta olabilir. İskelet kası terminal farklılaşma özellikle kas Düzenleyici Faktörler veya MRF üyeleri (MyoD, Myogenin, Myf5 ve MRF4), aynı zamanda miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri ailesi olarak adlandırılan, çeşitli transkripsiyon faktörleri koordineli hareket tarafından orkestra edildiği. Bu faktörler iskelet Miyogenesis ulaşmak için ayrıntılı kopyalama düzenleyici ağı içinde kromatin-remodeling kompleksleri ile işbirliği. Bu bağlamda, MyoD kas terminal farklılaşma tetikleme master myojenik transkripsiyon faktörü olarak kabul edilir. Bu kavram iskelet kası hücrelerine olmayan kas hücrelerini dönüştürmek için myod yeteneği ile güçlendirilmiştir. Burada myod tanımlamak için kullanılan bir yaklaşım tanımlamakiskelet kası farklılaşması dahil çeşitli faktörleri aydınlatmak için ayrıntılı bir şekilde protein ortakları. Uzun vadeli amaç iskelet kası genlerin düzenlenmesi, yani., MyoD hedefleri yer alan epigenetik mekanizmalar anlamaktır. MyoD ortakları iskelet kası farklılaşması esnasında ilgili mümkün rolü doğrulama ve ardından kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış bir heterolog sistemde, Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak tespit edilir. kas rejenerasyon konjenital myastenia, miyotonik distrofi rabdomiyosarkomda ve kusurları: miyojenik faktörler, ya da anormal düzenleme anormal şekilleri, kas bozuklukları sayısı ile ilişkilidir. Bu nedenle, myojenik faktörler hastalığın tedavisini artırabilir hastalığın kendisi ve rejeneratif mekanizmaların neden mekanizmaları ile ilgili hem kas bozukluklarında potansiyel terapötik hedefler havuzu sunmaktadır. Bu nedenle, ayrıntılı understankas kaynaklı faktörler tarafından kontrol edilen moleküller arası etkileşimlerin ve genetik programları Ding etkin terapiler rasyonel tasarımı için gereklidir.

Introduction

Ökaryotik çok hücreli organizmalar farklı organ ve dokularda oluşmaktadır. Her işlevsel doku, her farklılaşma adımında belirlenen spesifik bir gen deseni ifade vardır. Hücresel farklılaşma gen bir dizi hücre proliferasyonu ile ilgili olanlar gibi bir susturma, genel olarak özel genlerin aktivasyonu, kendi ifade bakım gerektirir ve. İskelet kası farklılaşma veya Miyogenesis, o miyoblastların içine mezodermal kök hücrelerin belirlenmesi ile başlar, böylece çok adımlı bir süreçtir ve daha sonra ilk mono-çekirdekli ve daha sonra çoklu çekirdekli, myotubes bu miyoblastların terminal farklılaşmasına yol açar . Böylece, miyoblastlar hala çoğalmaya edebiliyoruz hücreleri, "kararlı", ama onlar embriyonik gelişim sırasında veya yetişkin kas rejenerasyonu ya iskelet kas hücrelerine sadece ayırt edebilir, böylece iskelet kası soy taahhüt ve edilir. iskelet kası terminal işlemi farklıdırayırt edilmesi gibi E2F hedef genlerin 1 proliferasyon ilişkili genlerin, kesin bir susturma neden miyoblast öncü hücrelerin hücre döngüsüne kalıcı çıkış ile başlayan belirli bir genetik program tarafından yönetilen bir almaktadır. Gerçekten de, farklılaşması sürecinde, miyoblast proliferasyonu tutmak iskelet kası, belirli genlerin ekspresyonunu ve miyotüplerinin 2'ye miyoblastların füzyon öncesinde çok önemli bir adımdır. Böyle bir program iskelet kası hasarı aşağıdaki rejenerasyon sürecinde ayırt etmek için erişkin kas kök hücrelerini de denilen uydu hücreleri, izin verir.

Memeli Miyogenesis myojenik temel helix-loop-sarmalın bir ailenin kritik bağlıdır (bHLH) transkripsiyon sıklıkla iskelet kası belirleme faktörleri veya MRF (kas Düzenleyici Faktörler) 3 ailesinin olarak anılacaktır myod, Myf5, MRF4 ve Myogenin, faktörler. Bunların her biri tarifnamede ve dif önemli bir rol oynariskelet kası hücreleri ferentiation ve belirli bir sentezleme modelini Nisan 05-07 yer alır. Myf5 ve myod aktivasyonu miyojenik soy hücreleri taahhüt belirleyici bir adım teşkil ve Myogenin sonraki ifadesi gibi MCK (kas Kreatin Kinaz) olarak iskelet kası belirli genlerin aktivasyonu ile Miyogenesis tetikler. Miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri önceden sessiz loci 8 kas genlerin aktivasyonuna MEF2 aile üyeleri ile işbirliği. Ayrıca çeşitli gen düzenleyici bölgeler 8 sözde e-kutuları bağlanan D proteinleri olarak bilinen her yerde bHLH proteinler, E12 ve E47, ile heterodimerler olarak iskelet kası, gen transkripsiyonu teşvik eder. Büküm, Kimliği (farklılaşma inhibitörü) ve diğer faktörler olumsuz 8 bağlayıcı E proteinleri için myod ile rekabet ederek, bu süreci düzenler.

MyoD kas terminal farklılaşma 9 tetikleyen önemli bir oyuncu olarak kabul edilir 10-13 bir myojenik belirleme / farklılaşma (trans-farklılaşma) programı neden kapasitesine sahip çünkü. Nitekim, myod zorla ifadesi farklı hücresel türde başka embriyolojik kökenli 12 türetilmiş hatta trans-farklılaşmasını uyarır. Örneğin, MyoD kas-benzeri hücrelere hepatositler, fibroblastlar, melanosit, neuroblasts ve adipositler dönüştürebilirsiniz. Myod trans-farklılaşma eylem orijinal genetik programı (özellikle, çoğalma genleri) susturulmasına eşlik olmayan bir kas ortamda myojenik genetik programın anormal aktivasyonunu (özellikle hedef genler), içerir.

Miyoblastları çoğalan yılında MyoD ifade ama onların rehberleri 14-16 bağlanır bile hedef genleri aktive edemiyor edilir. Bu nedenle, MyoD sürekli farklılaşmamış miyoblastların ifade edilmesi şartı oldukça ELU kalırsive. MyoD önce kromatin remodeling aktive 14,17 enzimleri yüklenmesiyle miyoblastları çoğalan baskıcı kromatin değiştirici enzimlerin işe nedeniyle hedef genleri bastırmak olabilir. Örneğin, miyoblastlar çoğalan, MyoD histon H3 lizin 9 veya H3K9 ve H3K27 KMTs içeren transkripsiyonel ko-represör KAP-1, histon deasetilaz (HDAC) ve baskı lisin metiltransferaz (KMTs) ile ilişkili ve aktif hedef genlerin ekspresyonunu baskılayan bir bir yerel baskıcı kromatin yapısı 14,17 kurarak. Önemli olarak, yeni bir rapor MyoD kendisi doğrudan H3K9 KMT G9A olan transaktivasyon aktivitesini, 16 inhibisyonu ile sonuçlanan metillenmektedir olduğunu göstermiştir.

MyoD non-kas hücrelerinin, bu şekilde trans-farklılaşmada rol oynayan epigenetik mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, bazı hücre çizgilerinden MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dayanıklıdır. Böylece HeLa hücrelerinde, MyoD ya olmayan veyaHatta bağlı kompleks SWI / SNF 18 remodeling kromatin BAF60C alt biriminin ekspresyonu olmaması bastıncısı yerine transkripsiyon aktivatörü olarak işlev olabilir. Bu model, bu şekilde daha iyi bir MyoD kaynaklı geni sentezlenmesi mekanizmalarını tanımlamak için bir seçim olabilir. Ilişkili ortakları ile hedef odakta baskıcı kromatin ortamı teşvik ve bu nedenle terminal farklılaşma ince ayar yapmak için miyoblastları çoğalan olarak MyoD bağımlı baskıcı mekanizmaları ortaya çıkarmak için myod yeteneğini tahlil edilmesi de uygundur.

Burada kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak MyoD ortaklarının tespiti için protokol açıklar. stabil Bayrak-HA-myod ifade HeLa-S3 hücrelerinin kullanılması fraksiyone nükleer ekstrelerinden MyoD kompleksleri arındırmak için yeterli malzeme almak için izin verdi. heterolog sistemde MyoD ortaklarının tespiti validati izlediilgili bir sistemde üzerinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HeLa-S3 Nükleer Tuz ekstrakte ve Kromatin bağlı Kesirler 1. hazırlanması

  1. Hücreleri Toplama
    1. % 10 fetal dana serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin (büyüme ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 'de HeLa-S3 Flag-HA-MyoD ve HeLa-S3 Flag-HA (kontrol hücre soyu) büyütün nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de, orta) ve% 5 CO2.
      Not: kararlı bir şekilde Flag-HA-MyoD ve HeLa-S3 boş vektör (HeLa-S3 Flag-Ha) ile transduse hücreleri eksprese eden HeLa-S3 hücreleri anlatılan protokol kullanılarak kurulabilir ya: 19,20 ya da yazarlar tarafından sağlanır.
    2. Her bir hücre hattı (HeLa-S3 Bayrak-HA-MyoD ve HeLa-S3 Bayrak-HA hücreleri) 10 tam konfluent 150 mm yemekleri hücreleri kadar yükseltin.
    3. 5 L spinner içine süpernatant (yapışmayan ICSI'nin içerirler) toplayın.
    4. Oda tem 1 dakika için hücreler trypsinize, 150 mm tabak başına 10 ml PBS ile yapışık alt popülasyonu yıkayınsıcaklık (% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi, 15 cm'lik bir tabak 2 mi).
    5. 150 mm tabak başına ortam 4 ml ilave edilir ve 50 ml tüpler içinde hücreleri toplamak.
    6. (5 L spinner) aşama 1.1.3 ve aşama 1.1.5 hücreleri süpernatant birleşerek hücre hattı için, taze, önceden ısıtılmış büyüme ortamı 500 ml ekle.
    7. 5 L'lik spinere hücre süspansiyonu aktarın ve nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde en az 60 saat boyunca hücrelerin büyür.
    8. Taze büyüme ortamı 500 ml ilave edilir ve 24 saat boyunca hücrelerin büyür.
    9. Taze büyüme ortamı 1 L ilave edin ve 24 saat boyunca hücrelerin büyür.
    10. hücrelerin sayısı ve hücre canlılığı kontrol etmek için hücre süspansiyonu 1 ml çıkar. Renk hemasitometre kullanarak mikroskop altında 30 mavi% 0.4 tripan ul ve saymak canlı (mavi değil) hücreleri ile hücre süspansiyonu 30 ul.
    11. ; Günlük taze büyüme ortamı eklenerek 6 x 10 5 hücre / ml - 2 hücre yoğunluğu tutmak 1 x 10 6 hücre / ml aşmamaktadır. Maksimumbir 5 L eğiren hacim L. 2.5
      Not: Aşağıdaki adımlar için, 2 toplu tarafından devam - bir yoğunlukta 1 x 10 6 hücre / ml kültür 2.5 L. yaklaşık 20 L toplamak için 1.1.14 - Tekrar 1.1.12 adımları bir sonraki aşamaya geçmeden önce, her bir hücre hattı (kuru pelet ≈ 20 g) eklenmiştir.
    12. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri 4 ° C'de ve supernatant atın.
    13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de pipetleme ve santrifüj ile buz soğukluğunda PBS, 100 ml içinde süspanse pelet hücreleri yıkamak için kullanılır.
    14. Buz soğukluğunda PBS, 25 ml hücrelerin tekrar asılı tutulmasından 50 ml tüp içine süspansiyon aktarma ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yıkama tekrarlayın.
      Not: Hücre peletleri hemen kullanılmıştır veya sıvı azot içinde dondurulmuş ve birkaç gün -80 ° C de muhafaza edilebilir ya da.
  2. Çekirdeklerin izolasyonu
    Not: adımları 1.2.1 gerçekleştirin - soğuk oda 1.4.3.
    1. Ön soğutma büfers ve homojenizatörler.
    2. donmuş malzemenin kullanılması durumunda, hızlı bir şekilde 37 ° C'de su banyosu içinde hücre pelletleri eritin.
    3. Yeniden süspanse 20 g, 20 ml hücre (≈ 20 mi), daha sonra 5 ml ekleyerek, ilk tampon, 10 ml kullanılarak eklenerek hipotonik tampon A (Tablo 3) (hücre peleti boyutuna eşit olan bir hacim) başka bir 5 ml. Hücrelerin tam verim alabilmek için taze tamponu ile de pipetler yıkayın.
    4. Bir dar havaneli ile önceden soğutulmuş homojenleştirici içine aktarın 40 ml hücre süspansiyonu.
    5. Bir homojenleştirici 20 vuruş (ve hareketler dışında 20) ile hücrelerin homojenize ve 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın.
    6. Hücrelerin maksimum geri sakaroz tampon (ilk hücre hacminin 1/3, Tablo 3) 7 ml homojenleştirici yıkayın. çekirdekleri korumak ve sızıntıyı sınırlamak için adım 1.2.5 50 ml tüp içine hızlı bir şekilde bu süspansiyon aktarın.
    7. % 0.4 TR'nin 30 ul ile 30 ul kısım Leke(Lizis başarılı olursa, tüm çekirdekler mavi olmalı) lizis etkinliğini kontrol etmek mikroskop altında analiz mavi ypan. Gerekirse, homojenleştirme adımı tekrarlanır.
    8. 10,000 x g'de, 7 dakika ve 4 ° C'de santrifüj çekirdekleri pelet. Sitoplazmik fraksiyon olarak süpernatant kaydedin.
  3. Nükleer Tuz ekstrakte (SE) Kesir hazırlanması
    1. sukroz tamponu (çekirdekler pelet boyutuna eşit bir hacim) 8 ml çekirdekleri pelletini. Bir girdap yüksek tuz tamponu (1 çekirdek topağı hacmi, Tablo 3), 8 ml ile iyice karıştırılması, 300 mM NaCI nihai konsantrasyon elde etmek için ise damla damla ekleyin. 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya bırakılır ve her 5 dakikada karıştırılır.
    2. sukroz tamponu 8 ml (toplam hacmin 1/3) eklenerek 150 mM NaCI konsantrasyonunu azaltır. 13.000 x g'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüj. süpernatant (nükleer tuz ekstrakte fraksiyon, SE) toplayın.
      Not: Ya SE 1.3.3 adıma ya da ayrılmak geçinkromatin bağlı fraksiyonu ve her iki fraksiyonlar aynı anda daha sonra ultra santrifüj hazırlanması sırasında buz üzerinde kesir.
    3. 4 ° C'de 85,000 x g'de 30 dakika için ultra-santrifüj GD. süpernatant (≈ 26 ml) atın.
    4. sıvı nitrojen içinde 100 ul tablet dondurun. ekstresinin kalanını kullanarak, 2 "Protein kompleksi saflaştırma" adıma geçin.
      Not: kısım aşama 5.1.1 içinde bir giriş kontrol olarak kullanılmak üzere.
  4. Kromatin bağlı Fraksiyon hazırlanması
    1. pelletini (Adım 1.3.5 den.) titizlikle 7 ml sakaroz tampon (pelet boyutuna eşit bir hacim).
    2. MNase (aşama 1.4.4) aktif hale getirmek ve karıştırmak için 1 mM arasındaki nihai bir konsantrasyonda (süspansiyon 14 ml, 0.5 M CaCI2 28 ul) ile CaCl2 ekleyin.
    3. 37 ° C'de 1 dakika süre ile ön ısıtma süspansiyon.
    4. 0.5 ila 0.0025 U / ul (1/200 seyreltme nihai konsantrasyonu elde etmek için 70 uL mikrokok nükleaz (MNase) ekleyinU / ul stok) ve karıştırın.
    5. 37 ° C'de tam olarak 12 dakika inkübe edin. her 4 dakikada bir karıştırın.
    6. Hemen buz üzerinde reaksiyon yerleştirin.
    7. , MNase etkinliğini durdurmak 4 mM nihai bir konsantrasyona kadar, 0.5 M EDTA pH 8.0 (1/125 seyreltme) 112 ul ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Sonikasyon iki sonikasyon arasında yüksek genlikte 1 dakika için 5 kez, 1 dakika boyunca (toplam 10 dakika) bir ara verir.
    9. 85.000 x g'de 30 dakika 4 ° C ultrasantrifüjdeki.
    10. süpernatant (nucleosome zenginleştirilmiş fraksiyon, NE, ≈ 12 ml) toplayın.
    11. sıvı nitrojen içinde 50 ul bir kısım dondurun. ekstresinin kalanını kullanarak, 2 "Protein kompleksi saflaştırma" adıma geçin.
      Not: kısım aşama 5.1.1 içinde bir giriş kontrol olarak kullanılmak üzere.

2. Protein Kompleksi saflaştırma

Not: Her bir hücre hattı (HeLa-S3 Bayrak-HA-myod ve kontrol, Hel Paralel özleri de devam edina-S3 Bayrak-HA).

  1. FLAG- bazlı saflaştırma
    1. Ön yıkama Bayrak reçine. Her deneysel nokta (her hücre hattı için GD ve KD kesirler) için (ticari% 50 stoktan) Bayrak reçine 600 ul kullanın.
    2. 15 ml tüp içine Aktarım reçinesi, 1.000 x g'de 2 dakika boyunca soğuk Tegn adlı (Tablo 3), santrifüj 13 ml tekrar süspansiyon ve supernatant çıkarın. 5 kez tekrarlayın. Tegn adlı eşit hacimde (her deneysel noktası için 300 ul) içine son yıkama tekrar süspansiyon Bayrak reçine sonra.
    3. Her bir deney noktası için, 600 yıkanmış Bayrak reçine ul ve karşılık gelen protein ekstreleri (26 mi SE fraksiyonları 12 mi NE için 15 ml'lik bir tüp içinde ve 50 ml tüp içinde, sırası ile) karıştırılır. 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde gece boyunca inkübe edin.
    4. 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süreyle santrifüj, bir kenara süpernatant koymak ve arıtma verimi testi (2.2) sonucu kadar 4 ° C'de tutun.
    5. SE numuneler için, Bayrak reçine tekrar süspansiyon15 ml'lik bir tüpe transfer Tegn adlı 4 ml. Bu adımı 3 kez tekrarlayın, aynı 15 ml tüp transfer her zaman boncuk kaybetmemek için. 1000 xg ve 4 ° C ve süpernatant kaldırmak Santrifüj 2 dak.
    6. Yıkama Flag Reçine Tegn adlı 13 ml kullanılarak 1000 x g ve 4 ° C'de 2 dakika santrifüj 15 ml bir tüp içinde 7 kez.
    7. 1.5 ml son 1 ml Tegn adlı de yıkama, tekrar süspansiyon ve transfer sonrası tüp düşük bağlayıcı. 1000 xg ve 4 ° C ve süpernatant kaldırmak Santrifüj 2 dak.
    8. Her bir deney noktası için pH'sı 7.8 olan, 4 mg / ml'de Bayrak peptid çözeltisinin 200 ul süspanse edin. boncuk ve peptid karıştırın. Tegn adlı tampon 200 ul ilave edin ve en az 4 saat ya da bağlı proteinler elüte etmek için gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    9. 4 ° C'de 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj ve reçine ve süpernatan (Bayrak eluat) 2 ml'lik bir tüp içine yerleştirildi boş döndürme kolonuna transfer.
    10. Santrifüj kolon, toplamak sol üzerinde 2 ml tüp süpernatant. sütununa Tegn adlı tamponu eklenerek Bayrak reçine toplayın ve her bir deney noktası için gece boyunca 4 ° C 'de Bayrak peptid solüsyonu, 200 ul (4 mg / ml) ile, ikinci Bayrak elüsyon geçin.
    11. İkinci elüsyon toplamak için 2.1.10 - Tekrar 2.1.9 adımları. Birinci ve ikinci eluatları birleştirin.
  2. Arıtma Etkinliğinin Testi
    Not: Adım 2.1.11 sırasında - 2.1.12, SDS-PAGE ve gümüş lekeleme (- 2,2,2 2.2.1) gerçekleştirmek.
    1. , Yıkama sıvılarından 15 ul alır 4x yükleme tamponu, 5 ul 10x ve indirgeyici madde 2 ul, 96 ° C'de 5 dakika boyunca kaynar ve SDS-poliakrilamit 4 çalıştırmak - Üreticinin talimatlarına göre% 12 jel.
    2. gümüş boyama kiti kullanılarak jel Leke (üreticinin talimatlarına uyun). Bayrak-HA-myod ve Bayrak-HA arasındaki protein desen belirgin farklılıklar sahte eluates Bayrak-HA myod özellikle bant varsa (50 kDa, Şekil 1A civarında), bir sonraki ste geçins.
  3. Hemagglutinin (HA) tabanlı Arıtma
    1. 15 ml tüp içine transfer Tegn adlı 13 ml yeniden süspanse edildi ve 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika santrifüj edilerek yıkama HA reçinesi. Tekrarlayın yıkama aşaması 5 kez. Tegn adlı tampon eşit hacimde son yıkama tekrar süspansiyon boncuk sonra.
      Not: hacim Flag-bazlı saflaştırma verimliliğine göre ayarlanması gerekir. Her bir deney noktası için ticari bir% 50 stok 300 ul başla.
    2. 1.5 ml düşük bir bağlanma tüp içine her bir deney noktası için HA reçine aktarın. Santrifüj 2 dakika, 4 ° C 'de 1000 xg'de, yıkama tamponu (Tablo 3) maksimum ortadan kaldırmak ve HA reçinesine Flag-bazlı saflaştırma elde edilen yıkama sıvıları ekleyin.
    3. 4 ° C'de dönen tekerlek üzerinde gece boyunca inkübe edin.
    4. 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süreyle santrifüj, bir kenara süpernatant koymak ve arıtma verimi testi sonucunda kadar 4 ° C'de tutmak (2.3.12.).
    5. Yeniden, Tegn adlı 0.5 ml HA reçine askıya 1.5 ml tüp bağlama, yeni bir düşük transfer. 1000 xg ve 4 ° C'de boncuk ve santrifüj 2 dakika kaybetmemek için bir kez aynı 1.5 ml tüp ekleyerek tabanda tekrarlayın. süpernatantı.
    6. (Kaybetme boncuk kaçının) süpernatant Tegn adlı 1 mi, her zaman kullanılarak 1000 x g'de 2 dakika ve 4 ° C'de santrifüj ve kaldırarak boncuk 8 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 0.5 ml tüpler içinde boncuk aktarın.
    7. Mümkün olduğunca fazla süpernatantı. bağlı proteinler elüt edilmesi için boncuk pH 7.8 HA serbest peptid solüsyonu (4 mg / ml) 100 ul ekle. 4 ° C'de gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
      Not: HA-peptid miktarı kompleksleri çokluğuna bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir.
    8. 4 ° C'de 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj ve 2 ml'lik bir tüp yerleştirilir boş döndürme kolonuna reçine ve süpernatan (HA eluat) aktarın.
    9. 2 ml tüp sol-over süpernatant toplamak için sütun santrifüjleyin. Her bir deney noktası için HA peptit 100 | il (4 mg / ml) ile, ikinci bir elüsyon gerçekleştirin. 4 ° C'de gece boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Adımı tekrarlayın 2.3.8 - 2.3.9 ikinci elüsyon toplamak için.
    10. Birinci ve ikinci eluatları birleştirin.
    11. SDS-PAGE ve gümüş boyama ile test arıtma verimi (adım 2.2.) (Şekil 1A).
    12. üreticinin talimatlarına göre 10 kDa kesme (nominal moleküler ağırlık limiti, NMWL) santrifüj filtre üniteleri kullanılarak 30 ul HA eluat konsantre edilir.
    13. 22.5 (3/4) ve 7.5 (1/4) ul: ikiye konsantre örnekleri bölün. Ek bileşen -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza örnekleri 1/4 dondurma. Adım 3 3/4 bölümünü kullanın.
      Not: 1/4 Dondurulmuş kısmı western blot ile kütle spektrometresi sonuçları teyit kullanılacak olan (adım 5.1).

3. Kütle Spektrometresi Analizi

Not: Aşağıdaki adımlar analizi gerçekleştirecek Kütle Spektrometre tesisi ile ele alınmalıdır.

  1. 4x yükleme tamponu 7.5 ul ve 10x indirgeyici madde 3.3 ul numune 3/4 (22.5 ul) Ek 96 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatılır.
  2. % 12 jel - Bir SDS-poliakrilamit 4 Numuneleri. 150 V sabit 5 dakika süreyle çalıştırın jel tüm proteinler ayrılık olmadan jel girmesine izin vermek için.
  3. su ile yıkayın jel; Daha sonra ultra temiz su sabit jele 5 kez yıkayın fiksatif solüsyonu (% 10 asetik asit,% 50 metanol,% 40 ultra temiz su) ile 30 dakika - 20 sabitleyin.
  4. 1.5 ml bir tüp içinde 1 ml su içinde protein, mağaza ihtiva eden bantlar kesin ve kütle spektrometrisi imkan gönder.

4. Veri Analizi

Not: Bu analiz için genel bir yol göstericidir. Kesin adımlar MS tesis tarafından verilen verilerin belirli moduna bağlı olacaktıranaliz gerçekleştirmek için kullanılan (örneğin, 21,22).

  1. Negatif kontrol hazırlık karşılık elde edilen liste ile "MyoD" elüsyonların tanımlanan proteinlerin listesini karşılaştırın. analizden her iki listede bulunan proteinleri hariç.
  2. Kalan listeden belirlenen peptidler ≤2 toplam sayıda proteinleri çıkarın.
  3. Erişim fonksiyonel açıklama ve DAVID Biyoinformatik Kaynakları kullanarak proteinlerin elde edilen listenin fonksiyonel sınıflandırma (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) ve proteinlerin 23,24 listesini sınıflandırır.
  4. (İsteğe bağlı) negatif DNA 25 ücret bağlanma güçlü tesadüfi olmayan nükleer proteinler ücret listesi "hitchhikers", kaldır. Bunlar hücre iskeleti, sitoplazmik, mitokondrial membran ve reseptör proteinler içerir (Protein katlanması, Tablo 1 Sitoiskelet ve Muhtelif grup proteinleri ve 2). </ Li>
  5. Her fraksiyonun (Şekil 2) için spesifik ortak proteinleri ve proteinleri tespit etmek GD ve KD fraksiyonlardan MyoD interactors elde listeleri karşılaştırmak.

Western Blot ile tanımlanır interactors 5. Onay

  1. HeLa-S3 Bayrak-HA-myod ve HeLa-S3 Bayrağı-HA Onay
    1. Çözülme Eluat numuneler buz üzerinde adım 2.3.14 (7.5 ul) de elde edilmiştir. Tegn adlı tamponu 12 ul 4x yükleme tamponu 10 ul ve indirgeme maddesi 10x 3 ul ekle. 96 ° C de 5 dakika süreyle kaynatılır örnekleri.
    2. batı blot giriş örnekleri hazırlayın.
      1. adımlar 1.3.9 ve 1.4.11 gelen hacimde çözülme ve BCA kiti (üreticinin talimatlarına uyun) kullanılarak, örneğin, protein konsantrasyonu ölçmek.
      2. şerit başına proteinin 15 ug kullanın. ekstresinin uygun miktarda ölçün ve Tegn adlı tamponu ile 15 ul örnek sesini ayarlayın.
      3. 5 ul 4x yükleme tamponu ekleyin ve1.5 ul 10 x indirgeme maddesi. 96 ° C de 5 dakika süreyle kaynatılır örnekleri.
    3. Eluat numunelerin 15 ul kullanarak (MS analizi sırasında tespit edilen iş ortağı aday için spesifik) ilgi antikorları ile bir western blot analizi yapın. Endojen protein seviyeleri (Şekil 3A) bir kontrol olarak, giriş özleri kullanın.
  2. İlgili Hücresel Sistemde Onay
    1. C2C12 fare miyoblastların toplam nükleer özü hazırlanması.
      1. Nemli bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 15% fetal buzağı serumu ile takviye edilmiş DMEM ortamında, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin içinde C2C12 fare miyoblastlar büyütün. Asla proliferatif devlet hücreleri korumak için% 80 hücre izdiham aşmaktadır.
      2. immüno bir alanına (bir antikor gibi) için (PPI) C2C12 en az iki 150 mm tabaklar büyütün. , Orta aspire 10 ml PBS ile iki kez yıkama hücreleri.
      3. hücreleri kazıyın ve 15 ml'lik bir tüp içine toplar. Ce4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de ntrifuge. Süpernatantı atın.
      4. Hücre topağı (= V hücresi) hacmini belirleyin. Yavaşça sitoplazmik membran (Tablo 3) bozmaya hipotonik tampon B 3 hacim V hücrede pelletini.
      5. % 10, 0.44 x D hücre hacmi ekleme NP-40,% 1 nihai konsantrasyona ulaşmak için (hac / hac). Yavaşça karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
      6. Çekirdek bütünlüğünü korumak için SR (Tablo 3) 0.89 x V hücre hacmi ekleyin. Yavaşça çekirdekleri pelet 2,000 xg'de 5 dakika boyunca bir süspansiyon ve santrifüj homojenize etmek içi tüpü birkaç kez ters çevirin.
      7. süpernatant (sitozolik fraksiyonu) sökün. Çekirdek pelet (= V MBK) hacmini belirleyin. Sakaroz tampon bir hacim V MBK içinde süspanse çekirdekler pelet.
      8. Yüksek tuzlu tampon vorteks bir hacım V MBK ile iyice karıştırılarak 300 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için ise damla damla eklemeNaCI ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. her 5 dakikada karıştırılır.
      9. Sükroz tamponun bir hacim V Nük ekleyin ve CaCl2 (nihai konsantrasyon 1 mM) (150 mM NaCI konsantrasyonunu azaltmak için). Karıştırın.
      10. Ön ısıtma karışım 37 ° C'de 1 dakika süre ile, konsantrasyon 0.0025 U / ul (0.5 U / ul stok 1/200) nihai için mikrokok nükleaz ekleyin. Karıştırın.
      11. 37 ° C'de tam olarak 12 dakika inkübe edin. her 3 dakikada karıştırın.
      12. Hemen buz üzerinde reaksiyon yerleştirin ve MNase etkinliğini durdurmak için EDTA (nihai konsantrasyon, 4 mM) ilave edin. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
      13. Sonikasyon yüksek genlikli 0.5 dakika her biri için 5 kez. İki sonikasyon arasında, 0.5 dakika (toplam 5 dakika) bir ara verir.
      14. 85.000 x g'de 30 dakika ve 4 ° C'de için ultra-santrifüj. süpernatant (toplam nukleer extract) toplayın.
      15. (Üreticinin talimatlarına uyun) BCA kiti kullanılarak, örneğin, toplam nükleer özü protein konsantrasyonu ölçmek ve immediyat devamely 5.2.2 adıma.
    2. Endojen MyoD imüno (IP).
      1. Özü açık-öncesi her IP noktası için protein G agaroz boncuk 10 ul yıkayın.
        1. 1.800 x g'de 2 dakika süre ile, soğuk Tegn adlı, santrifüj 1.4 ml 1.5 ml tüp, tekrar süspansiyon haline protein G agaroz boncuklar gerekli hacim transferi ve supernatant çıkarın. 3 kez tekrarlayın.
      2. Toplam nükleer ekstre uygun miktarda önceden yıkanmış protein G agaroz boncuklar karıştırın. IP noktası başına toplam nükleer ekstre protein 500 mikrogram kullanın.
      3. özleri pre-temizlemek için 2 saat boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
      4. 4 ° C'de 1,800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. süpernatant tutun.
      5. 1.5 ml düşük bağlanma tüplerde 500 ug önceden temizlenmiş toplam nükleer özleri ile tavşan IgG 5 MyoD Ab ug veya 5 ug karıştırın. Tegn adlı 1 ml tampon kadar ekleyin. gece boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
        Not: f gerçekleştirAdım 5.2.2.3 sırasında adımları ollowing.
      6. IP noktası başına ön yıkama 7,5 ul protein A / G stok boncuk çözüm.
        1. 2 dakika boyunca 4 ° C'de 1800 x g'de santrifüj Tegn adlı 1 ml, 1.5 ml tüp içine yeniden süspanse boncuk tanelerin gerekli hacmi aktarın. süpernatantı. 3 kez tekrarlayın.
      7. Gece boyunca 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde çözeltisi (Tablo 3) ve inkübe bloke 1.5 ml içinde süspanse protein A / G boncuklar.
      8. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 xg'de Abs (aşama 5.2.2.5) ile inkübe Santrifüj toplam çekirdek ekstreleri. süpernatant tutun.
      9. Santrifüj, 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1800 x g'de protein A / G reçinesi (adım 5.2.2.7) bloke etti. Tegn adlı tamponu 1 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon atın. Yeniden santrifüj 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1800 x g'de bloklama tamponu yıkayın.
      10. Süspanse bloke protein A / G 7.5 ul Blo elde etmek için yeni bir düşük protein-bağlayıcı bir tüp içine Tegn adlı tamponu ve kısım 1 ml reçineIP noktası başına cked protein A / G reçinesi. 2 dakika boyunca 4 ° C'de 1800 x g'de santrifüj ve çok süpernatan mümkün çıkarın.
      11. Abs ile kuluçkaya toplam nükleer özleri ekleyin (ya da kontrol IgG) A / G reçine. Karıştırın ve dönen bir tekerlek üzerinde, oda sıcaklığında (rt) 2 saat boyunca inkübe edilir.
      12. Santrifüj süspansiyon 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1800 x g. Yeni düşük bağlanma tüplere yıkama tamponu ve transfer süspansiyon 1 ml süpernatant, tekrar süspansiyon atın. 5 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde, oda sıcaklığında inkübe edin.
      13. Yıkama tamponu 1 ml 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1800 x g'de, tekrar süspansiyon santrifüjleyin süspansiyonu ve 5 dakika için bir döner tekerlek üzerine, oda sıcaklığında inkübe edilir. 4 kez tekrarlayın. yeni bir düşük bağlayıcı tüp son yıkama transferi için.
      14. yüzer maksimum çıkarın. Yıkama tamponu 7 ul 4x yükleme tamponu 7 ul boncuk indirgeme maddesi 10x 3 ul ekle karıştırın ve 96 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatılır.
      15. Int antikorlar ile Western blot analizini gerçekleştirmekerest (immün için ortak aday için özel protein çöktürülmüş). Endojen protein seviyeleri (Şekil 3B), bir kontrol olarak, giriş özler,% 1 (5 ug) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MyoD etkinliğinin düzenlenmesini anlamak için, kütle spektrometrisi (MS) ile ve ardından MyoD bir çift etiketli formda imüno göre, biyokimyasal saflaştırma ile MyoD komplekslerinin ayrıntılı karakterizasyon üstlenmiştir. Bayrak-HA-etiketli myod ve Bayrak-HA izinleri ifade eden bir kontrol hücre hattı ifade HeLa-S3 hücre hattının kullanılması Bayrağı-HA-myod çift-afinite saflaştırma gerçekleştirerek MyoD kompleksi arındırmak için yeterli malzeme elde etmek için.

Bu nükleer kısmını fraksiyonlarına daha da ayrıntılı olarak, Sitoplazmik ve nükleer bölümler halinde hücre ekstreleri fraksiyonlarına tuz ekstre (Nükleer tuz ekstrakte, SE) ve nükleozom için (nükleozom zenginleştirilmiş NE) kısımlar zenginleştirilmiş. Bu ayrı nükleer fraksiyonların (Şekil 1, Tablo 1 ve 2) TAP-Tag arıtma nispeten düşük ab sahip ortakları çözülüyor izinbelirli bir çekirdek içi bölmesinin lokalize zaman undance. Dahası, böyle bir strateji MyoD etkinlik düzenleme ayrıntılı bilgi edinmek için DNA'ya bağlı (NE) myod karşı ilişkisiz (SE) ortakları ortaya çıkarmak için istismar edilmiştir.

TAP-Etiket arıtılması için, Bayrak-HA tandem epitop sistemi kullanıldı. Küçük hidrofilik Flag ve HA epitopu protein fonksiyonunun en az müdahale ve antikor-antijen etkileşiminin için son derece erişilebilir. Anti-Flag ve anti-HA reçine bazlı sıralı imüno Flag ve HA peptitler kullanılarak immüno komplekslerinin elüsyon yapılarak gerçekleştirildi. daha sonra bir SDS-sayfasında yürütülmüş sonra elüt, protein proteinler, jel girmesine izin vermek için. Bütün saflaştırılmış proteinlerin içeren jel parçaları kesilmiştir; proteinler, ekstre tripsin ile sindirilmiş ve kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, (Şekil 2 ve 3) 26-28. Bu baskıcı-kromatin ortamı kurabilir DNA'ya bağlı MyoD ortakları ve muhtemel ortak düzenleyiciler ışık tutuyor. Örneğin, tarif edilen yöntem vasıtasıyla, MyoD ortak olarak tespit edilmiştir HP1 proteinleri, gen baskısı ve heterokromatin yapısını korumak için metil H3K9 bağlandığı bilinmektedir. Gerçekten de, HP1 bozulmuş MyoD, hedef gen ekspresyonu ve kas farklılaşması 26 elde MyoD transkripsiyonal aktivitesini inhibe eder.

daha da fraksiyonasyongliserol degrade üzerine GD ve KD MyoD kompleksler (29 anlatıldığı gibi) iki subnuclear bölmeleri (Şekil 1B) MyoD alt kompleksleri ortaya çıkardı. kromatin bağlı MyoD bir kompleks esas ait Özel olarak, SE MyoD, üç alt kompleksleri dağıtılır.

TAP-etiket / MS Bazı interaktörler MyoD kompleksleri üzerinde western blot ile doğrulandı saptandı. Bu transkripsiyon faktörü CBF, EBB, MTG8R ve SWI / SNF altbirim BAF47 (SNF5) (Şekil 3A, sol) ve HP1 proteinleri (CBX1 ve CBX3) (sağ Şekil 3A) sayılabilir. HeLa hücreleri, kas hücreleri değildir ve myod ifade yoktur çünkü önemlisi, miyoblastların içinde yeni tespit interactors ve myod arasındaki etkileşimleri (Şekil 3 BD) onaylamak için gereklidir. Özellikle, bu tür doğrulama için, (SE ve NE üzerinde ayrılık olmadan) toplam nükleer özler yüklenebileceğini, genellikle yeterlidirH Numune hazırlanması için kullanılan miyoblastların miktarının azaltılmasına izin verir. 26,27 gibi in vitro etkileşim tahlilleri, ayrıca, bu bulgular onaylanmıştır yardımcı olur. Son olarak, kas hücrelerinde bu etkileşimlerin fonksiyonel anlamları daha 26-28 gibi ele alınmalıdır.

Birlikte ele alındığında, veri yayg ifade MyoD ortakları küresel bir görünüm göstermek ve daha alakalı bir kas modelinde yol daha da fonksiyonel çalışmalar açacağı sundu.

Şekil 1
Şekil 1: Tandem Affinity Arıtma tarafından İzole MyoD kompleksleri (A) Nükleer tuz-ekstrakte (SE) veya nucleosome zenginleştirilmiş (NE) izole çift afinite ile saflaştırılmış eMyoD kompleksleri HeLa-S3 hücre hatları stabil nükleer fraksiyonlar bir gümüş boyama. ifade Bayrak-HA-MyoD (MyoD kompleks) bird kontrol hücre hattı (Mock). MW kilo Dalton moleküler ağırlık markörü (kDa) sahiptir. Ok Bayrak-HA-myod (eMyoD) gösterir. Bu araştırma aslında 37 yılında yayımlandı. Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için Telif The American Derneği. Sahte saflaştırma ile şerit ve SE nükleer kesirler izole karmaşık şimdi gösterilmiştir eMyoD: Bu rakam 26 ile modifiye edilmiştir. (B) (a) 'da çift afiniteyle saflaştırılmış eMyoD kompleksleri% 20 ila% 41 arasında değişen gliserol gradyanı üzerinde parçalara ayrıldı. Fraksiyonlar elle toplanmıştır konsantre edildi ve anti-Flag antikorları kullanılarak Western Blot (WB) ile analiz edilmiştir. Varlığını Not birkaç eMyoD içeren nükleer tuz ekstrakte (SE) fraksiyon alt kompleksleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2 Şekil 2:. Nükleer Çözünür (nükleer tuz ekstrakte, SE) MyoD Partners karşı (nucleosome, NE zenginleştirilmiş) Kromatin bağlı Karşılaştırılması Üst: Nükleer tuz-ekstrakte (SE) ve nükleozom zenginleştirilmiş izole eMyoD interactors arasında Venn şeması gösteren örtüşme ( NE) kesir. . Ribozomal proteinler, çeviri-başlatma faktörleri, DNA onarım faktörleri ve tübülin izoformları non-spesifik Bottom olarak TAP ile elde edilen ve kabul çeşitli veri setleri mevcut olarak analize dahil edilmiştir: Her iki SE bulundu MyoD inter ve (ortak) veya (özel) kısımların biri için belirli bir KD fraksiyonlar fonksiyonel ek açıklamalar göre gruplara ayrıldı. Hücre iskeleti ile ilgili ve diğer çeşitli proteinlerin tasvir edilmemiştir. altı çizili proteinler ya HeLa ve / veya myoblas valide MyoD Uygulayıcılar olanko-immunoprecipitation tarafından ts. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. MyoD interactors seçilmiş takımı, Doğrulama stabil olarak Flag-HA-MyoD (eMyoD) ifade HeLa-S3 hücre hattı, kütle spektrometrisi, sol panel tarafından tanımlanan MyoD interactors (A) doğrulama,., Çift afinitesi Western blot analizi nükleer ekstrakte tuzu-(SE) ya da kararlı bir şekilde belirtilen antikorlar ile (Mock) eMyoD ya da kontrol hücre hattı ifade HeLa-S3 hücre çizgisinin nükleozom bakımından zenginleştirilmiş (NE) fraksiyonlarından izole -purified MyoD kompleksleri. MW moleküler ağırlık markörü Sağ panel:. HeLa-S3 hücre hattı s nükleer nükleozom zenginleştirilmiş fraksiyonlarından izole çift afiniteyle saflaştırılmış MyoD komplekslerinin Western blot analizianmalıyım belirtilen antikorlar ile eMyoD ya da kontrol hücre çizgisi (Mock) ifade. Bu panel aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Yahi lH, Fritsch L Philipot, O, Guasconi V Souidi E, Robin P, Polesskaya A, Losson R Harel-Bellan A Ait-Si-Ali S. J. Biol Chem. 2008 29 Ağustos, 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için Temmuz 2. Telif The American Derneği. Bu rakam 26'dan modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve metin şekil içindeki etiketleme birleştirmeye döndürüldü. MyoD diğer panellerde sunulan endojen IP ile karışıklığı önlemek için eMyoD olarak etiketlendi. C2C12 fare miyoblastların içinde MyoD interactors (BD) Doğrulama. (B) çoğalan C2C12 miyoblastların Nükleer toplam ekstreler BAF47 (SNF5) ya da MyoD karşı ya da kontrol IgG'si ile antikorlarla immüno-çökeltme (İP) için kullanılmıştır. Elde edilen çökeltiler, DB wit ile analiz edilmiştirH belirtilen antikorlar. Anti-MyoD uzun antikorlar (uzun expo.) ve daha kısa (kısa expo.) maruziyet süreleri gösterilmiştir. Girdi ekstreleri endojen protein düzeyleri göstermek için yüklendi. Bu panel, Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) kapsamında 28 yayımlanarak yürürlüğe girmiştir. Bu rakam 28'den modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve test şekil içinde etiketleme birleştirmeye döndürüldü. (C), çoğalan C2C12 miyoblastların Nükleer toplam ekstreler MyoD, Suv39h1 (pozitif kontrol) karşı antikorlarla immüno-çökeltme için kullanıldı ya da IgG (negatif kontrol) kontrol edildi. Elde edilen çökeltiler, daha sonra, belirtilen antikorlar ile WB tabi tutuldu. Bu panel aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Yahi lH, Fritsch L Philipot, O, Guasconi V Souidi E, Robin P, Polesskaya A, Losson R Harel-Bellan A Ait-Si-Ali S. J. Biol Chem. 2008 29 Ağustos; 283(35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için Temmuz 2. Telif The American Derneği. Bu rakam 26'dan modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve metin şekil içindeki etiketleme birleştirmeye döndürüldü. Çoğalan (D) Nükleer toplam ekstreleri (Prolif.) Ile ayırt C2C12 miyoblastlar (48 sa, fark olarak gösterilmiştir.) Immüno (IP) için kullanılan MyoD ve Myf5 karşı antikorlarla ya da normal tavşan IgG ve boş boncuklar negatif kontrol. Nihai çökeltiler belirtilen antikorlar ile WB ile analiz edilmiştir. Girdi ekstreleri endojen protein düzeyleri göstermek için yüklendi. Bu panel, Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) kapsamında 27 yayımlanarak yürürlüğe girmiştir. Bu rakam 27 ila modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve metin f içindeki etiketleme birleştirmek için döndürüldüŞEKIL. Çoğalan ve özgün figür aksine ikiye ayrılır C2C12 farklılaşan elde edilen sonuçlarla panelleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1:. Kontrol hücre hattından elüsyonların MS tarafından belirlenen Arka Plan Proteinlerin Çıkarma sonra Nükleer Tuz ekstrakte Kesir İzole Çift Affinity saflaştırılmış eMyoD Kompleksleri MS Analizi ile Belirlenen Proteinlerin listesi (Proteinler non-spesifik arka plan olarak kabul edildi . veri dört bağımsız saflaştırma toplamını ifade etmektedir). Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Tablo 2: Proteinler I listesiArka plan Proteinlerin Çıkarma sonra Nükleozom zenginleştirilmiş Kesir İzole Çift Affinity saflaştırılmış eMyoD Kompleksleri MS Analizi ile dentified. veri üç bağımsız saflaştırma toplamını ifade etmektedir. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Tablo 3. Tampon kompozisyonlar. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

sunulan yöntem, bir transkripsiyon faktörü, myod ortaklarından ayrıntılı tanımlanmasına izin verir. Bu MyoD kaynaklı farklılaşması, yani HeLa-S3 hücreleri dirençli bir heterolog sistemde MyoD ortakları saptandı. Böylece, tanımı gereği, belirlenen MyoD ortakları yayg ifade edilmiştir. Bu genel sekansa özel kopyalama faktörleri, kromatin değiştirici enzimler, RNA işleme proteinleri kinazlar (Tablo 1 ve 2) içerir. HeLa-S3 hücreleri MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dirençli olduğu için, MyoD etkinliği esas olarak baskı ve tespit ortakları MyoD eş baskılayıcılar olması muhtemeldir. Bu MyoD transaktivasyon yeteneği 8 inhibe ettiği bilinen Id proteini (Tablo 1 ve 2, Şekil 2), varlığı ile vurgulanır. Önemlisi, bu tür baskıcı devlet miyoblastları çoğalan içinde MyoD durumunu gösterir. Gerçekten de, CBFβ bir MyoD o MyoD etkileşimleri teyittarif edilen yöntemle tanımlanmış olan ortak C2C12 miyoblastlar çoğalan tespit edilebilir, ancak hücre (Şekil 3D bakınız) farklılaşma uygulandı kaybolur. Bununla birlikte, sunulan yöntemin önemli sorunlardan biri MyoD ko-aktivatörler tanımlama olmaması dikkat etmek önemlidir. Sürekli böyle histon olarak bilinen MyoD eş-aktivatörleri, bu yöntem hiçbiri kullanılarak 32 tespit edilmiştir asetiltransferazlar.

MyoD komplekslerinin saflaştırılması çekirdeğinde veya kromatin zenginleştirilmiş fraksiyonu (zenginleştirilmiş nucleosome, NE) (Şekil 1A) çözünür fraksiyon (ekstrakte nükleer tuz, SE) en az iki büyük fonksiyonu vardır ya. Birincisi, böyle bir fraksiyon MyoD arıtma toplam nükleer özlerinden yapıldığı takdirde maskeli olacağını olmayan stokiyometrik ortakların temsil artırır. İkincisi, bu myod iki fonksiyonel alt popülasyonlarının ayrılması izin verir: Önceden yatırılır / EVICted (SE) ve kromatin bağlı (NE). Proteinlerin yanı sıra bazı kromatin remodelers tespit edilmiştir (Şekil 2) trafiğe DNA bağlanmamış MyoD, birçok kinazlar, transkripsiyon faktörleri için özel interactors arasında yer almaktadır. tamamen valide, böyle bir ağ DNA ilişkisiz myod aktivitesi düzenleme moduna bir fikir verebilir. kütle spektrometresi ile bu iki nükleer bölümlerinde MyoD post-translasyonel modifikasyonlar için ek arama, daha MyoD etkinlik düzenleme çözülmeye başladı. Son olarak, bir gliserol gradyanı üzerinde çözünür ve kromatin bağlı MyoD komplekslerinin fraksiyonlama kromatin bağlı MyoD ağırlıklı bir kompleks olarak bulunur, DNA-bağlı olmayan MyoD üç alt kompleksleri (Şekil 1B) dağıtılır olduğunu ortaya çıkarmıştır. MS ve / veya protein adaylarına karşı western blot ya da bu alt-komplekslerinin karakterizasyonu daha MyoD düzenleme modu aydınlatmak gerekir.

Yukarıda da vurgulandığı gibi, HeLa hücreleri doğal olarak Expre yokss kas transkripsiyon faktörü MyoD. Iskelet kası modelinde bulunan etkileşimleri (Şekil 3) Onaylamak için önemli hale geldi. Myod ve sunulan TAP-etiket deneyinde tespit ortaklarından bazıları arasında böyle fonksiyonel etkileşimler ilgili modellerinde teyit birçok raporlar. Bu, örneğin prohibitin 33 DDX17 34, Meis1 35 CBF 27 HP1 26 ve SWI / SNF kromatin remodeling kompleksi 36,28,30 için geçerlidir.

Böyle hassas MS kombine miyoblastların gelen hücrelerin, düşük miktarda bu tür TAP-etiket saflaştırma gerçekleştirmek mümkün olduğunu unutmayın. Nitekim, son kağıt miyoblastların 30 Flag-etiketli myod uyanlabilir ifadesinden sonra MyoD ortakları karakterizasyonu nitelendirdi. Miyoblastların istikrarlı ve sürekli MyoD overekspresyonu zararlı olduğundan, alternatif bir yaklaşım miyoblastların endojen MyoD alel (ler) içine Bayrak-HA etiketleri ekleyerek olacaktırBöyle CRISPR-Cas9 31 olarak genom düzenleme yöntemleri kullanarak. Özellikle, etiket (ler) ilave potansiyel dikkatle seçilmelidir etiket (N- ya da C-ucu) bu nedenle bir yerde, bağlayıcı partnerleri protein fonksiyonu ve / veya esas değiştirebilir. İlgili sistemde füzyon proteininin bir fonksiyonel tahlil etiketli protein fonksiyonel olmasını sağlamak için önce TAP-etiket saflaştırma yapılmalıdır. Endojen proteinlerin immünopresipitasyonu, bu problemleri, ancak nadiren kullanılabilir spesifik yüksek afinite antikor, mevcudiyetine dayanır önler.

tarif edilen yöntemin diğer bir katma değer saflaştırılmış proteinin kendisinin ve bol ortaklarının (PTMS) post-translasyonel modifikasyonları teşhis etmek üzere bir olasılıktır. Böylece, bu özelliği ile TAP-etiket arıtma sadece yeni etkileşim ortakları değil, aynı zamanda faiz ve / veya ortaklarının proteine ​​bağlı yeni enzimatik işlevler tanımlamak için uygundur. İçindeBir kromatin bağlama proteini (örn., transkripsiyon faktörleri, enzimler) durumunda, bu yöntem bu şekilde bağlantılı "histon kodu" tanımlanması için uyarlanmıştır. Gerçekten de, nükleozom yüzeye maruz kalan amino terminal histon kuyrukları, birden fazla kovalent PTMS tabidir. Histon PTMS katılan nükleozom için benzersiz bir imza görüşmek. histon N-terminal kuyrukları farklı modifikasyonlar kombinasyonu böylece gen ifadesi regülasyonu sağlamak için kromatin yapısını değiştirebilir. Böylece, rolleri ve çalışılan kromatin-bağlayıcı proteinlerin 22 etki mekanizmaları içgörü sağlayabilir belirli bir proteine ​​bağlı bu tür değişiklikler karakterize.

Özetle, sunulan metodoloji MyoD ortaklarının kapsamlı tanımlanmasına izin verir. TAP-etiket arıtma gibi GST çekme çıkışlar, maya iki hibrit deneyleri ve faj görüntüleme gibi diğer yaklaşımlara bir alternatif sunuyor. Bile pratik nedenlerden dolayı (production nükleer ekstrelerin büyük miktarda) bir heterolog hücresel sistemi kullanmak zorunda ve biz iskelet kas farklılaşma tespit MyoD ortakların katılımını teyit etmek mümkün olmuştur. Elde edilen veriler, MyoD miyojenik faktör transkripsiyon faktörünün aktivitesi düzenleyen farklı mekanizmaları düşündüren transkripsiyonel düzenleyici RNA bağlama proteinleri arasında değişen bir protein bolluk ile etkileşime görünmektedir göstermektedir.

Sonuç olarak, aynı metodolojik yaklaşım kendi özel hücresel bağlamda incelemek için zor olabilir sayısız nükleer faktörlerin yayg ifade ortakları belirlemek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23, (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24, (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8, (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11, (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8, (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6, (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40, (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185, (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132, (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47, (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25, (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22, (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31, (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20, (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37, (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8, (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5, (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9, (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29, (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10, (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117, (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11, (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27, (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316, (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics