Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

* These authors contributed equally
Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J., Tomancak, P., Preibisch, S., Norden, C. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (110), e53966, doi:10.3791/53966 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Morfogenese is het proces dat het embryo en vormen samen met de groei en differentiatie drijft de ontogenie van een bevruchte eicel tot een volwassen meercellig organisme. Het morfogenetische processen tijdens dierlijke ontwikkeling kan het best worden geanalyseerd door beeldvorming van intacte levende exemplaren 1-3. Dit is omdat dergelijke gehele embryo beeldvorming behoudt alle componenten die drijven en ontwikkeling reguleren inclusief gradiënten van signaalmoleculen, extracellulaire matrix, vaatstelsel, innervatie en mechanische eigenschappen van het omringende weefsel. Om de weegschaal, waarbij morfogenese optreedt overbruggen, de snelle subcellulaire gebeurtenissen moeten worden vastgelegd op een minuut tijdschaal in het kader van de ontwikkeling van het hele weefsel dan uren of dagen. Om al deze eisen te voldoen, een moderne uitvoering 4 van de orthogonale vliegtuig verlichting microscoop 5 werd ontwikkeld. Oorspronkelijk werd het genoemd de Selectieve Plane Verlichting Microscopy (SPIM) 4; nu een allesomvattende term Light Sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) wordt meestal gebruikt. LSFM maakt beeldvorming met een hoge tijdsresolutie, terwijl het induceren van minder fototoxiciteit dan laser scanning of draaiende schijf confocale microscoop 6,7. Tegenwoordig zijn er al veel implementaties van de basis lichtwaaier verlichting principe en het is gebruikt om een grote verscheidenheid van monsters en processen voorheen ontoegankelijke onderzoekers 8-11.

We zouden graag eerst een aantal belangrijke voordelen van LSFM ten opzichte van conventionele confocale microscopie benaderingen te benadrukken:

Zinvolle resultaten van levende microscopische beeldvorming experimenten te verkrijgen, is het belangrijk dat de waarneming slechts minimaal het monster beïnvloedt. Veel organismen zoals zebravis zijn zeer gevoelig voor blootstelling aan laserlicht, waardoor het moeilijk om deze afbeelding in een confocale microscoop met hoge tijdsresolutie zonder fototoxiciteit effecten zoals vastgelopen of vertraagde ontwikkeling 6,7. LSFM is momenteel de fluorescentie beeldvormende techniek met de minste verstoring van de het monster 7. Aangezien de dunne plaat laserlicht belicht alleen het gedeelte van het specimen dat wordt afgebeeld op een bepaald tijdstip, het licht plaat microscoop gebruikt fotonen zeer efficiënt. Bijgevolg is de lage blootstelling aan licht zorgt voor een langere time-lapse observaties van gezonder exemplaren, bijvoorbeeld 12-17. Verder dankzij de minimale invasiviteit van LSFM, het aantal verkregen beelden wordt niet meer bepaald door hoeveel licht het monster kan verdragen, maar door de hoeveelheid gegevens kan worden verwerkt en opgeslagen.

In dezelfde lijn van het houden van het model in de buurt van fysiologische omstandigheden, LSFM komt met alternatieve monster montage strategieën goed geschikt voor live-embryo's. In LSFM technieken worden de embryo's gewoonlijk ingebed in een dunne kolom lage percentage agarose. de mounting agarose in cilinders maakt de volledige vrijheid van rotatie, zodat het monster kan worden waargenomen vanaf de perfecte hoek (in LSFM aangeduid als view) en vanuit verschillende aanzichten tegelijk. De multiview imaging en de daaropvolgende multiview fusie is vooral gunstig voor grote, verstrooiing exemplaren en maakt het vastleggen van hen met een hoge, isotrope resolutie. Een overzicht van de andere mogelijke LSFM montage strategieën kunnen worden gevonden in de officiële microscoop handleiding, in het hoofdstuk over monstervoorbereiding geschreven door het lab van E. Reynaud. Het verdient aanbeveling lezen, vooral wanneer het doel is om het verschillende monsters als hier beschreven.

Het beeld acquisitie in LSFM is breed veld, camera-gebaseerde, in tegenstelling tot laser scanning confocale microscoop. Dit resulteert in een hogere signaal-ruisverhouding (SNR) voor de verkregen beelden en kan zeer snel zijn (tientallen tot honderden frames per seconde). De hoge gevoeligheid van LSFM maakt verdere beeldvorming van zwak fluorescerende samples, zoals transcriptiefactoren geuit op endogene niveaus 18 of, in de nabije toekomst, endogene eiwitten gelabeld met behulp van CRISPR / Cas9. De hoge SNR is ook belangrijk voor een succesvolle downstream beeldanalyse. De hoge snelheid is niet alleen noodzakelijk om snelle intracellulaire processen te vangen, maar ook het gehele beeld embryo uit meerdere weergaven snel genoeg. Een naadloze fusie van de verschillende standpunten kan alleen worden bereikt als de waargenomen verschijnsel niet veranderen tijdens verwerving van deze verschillende z stacks afkomstig van aparte uitzicht.

De voordelen van LSFM meestal niet ten koste van de beeldkwaliteit. De laterale resolutie van LSFM is iets slechter dan de resolutie van een confocale microscoop. Dit komt doordat de detectie doelen voor LSFM lagere numerieke apertuur (gewoonlijk 1,0 of minder) ten opzichte van 1,2-1,3 water of silicium immersie doelstellingen op standaard confocale setups. Bovendien, als gevolg van het brede veld detectie in LSFM (afwezigheid opce van een pinhole), is er meer out-of-focus licht in vergelijking met een confocale microscoop. Het bedrag van de out-of-focus licht wordt bepaald door het licht plaatdikte. Desalniettemin worden de nadelen gecompenseerd door de hogere SNR in LSFM. In de praktijk resulteert dit in soortgelijke kwaliteitsbeelden vergelijking met bijvoorbeeld draaiende schijf confocale acquisitie 15. Bijgevolg is dit maakt betrouwbare extractie van functies, zoals celmembranen of kernen, bijvoorbeeld voor cellijn tracing 15,19.

De axiale resolutie van LSFM wordt bepaald, naast de detectie doel, door het licht plaatdikte. De axiale resolutie kan LSFM in sommige gevallen overtreffen de resolutie van de confocale microscoop. Ten eerste, de verbetering van de resolutie komt wanneer de lichtwaaier dunner is dan de axiale resolutie van het detectiesysteem doel is meestal het geval voor grote preparaten afgebeeld met een doelstelling lage vergroting. De tweede manier, waarop de LSFM kan ACHieve betere axiale resolutie, is de multiview fusie, waarbij de hoge resolutie xy informatie vanuit verschillende standpunten wordt gecombineerd tot één beeld stack. De resulterende samengevoegde stapel heeft een isotrope resolutie naderen de waarden van de resolutie in de dwarsrichting 20,21. De strategie voor het registreren van de meerdere beelden op elkaar hier beschreven is gebaseerd op het gebruik van fluorescerende polystyreenkorrels als fiduciaire markers ingebed in agarose rond het monster 20,21.

Door de LSFM commercialisering deze techniek nu onder grote groepen wetenschappers 22. Daarom is de motivatie voor het schrijven van dit protocol is om deze technologie toegankelijk te maken ontwikkelingsstoornissen biologen weinig praktijkervaring in LSFM te maken en om deze wetenschappers begonnen met het gebruik van deze technologie met hun monsters. Ons protocol maakt gebruik van de commerciële licht plaat microscoop, die een conceptueel eenvoudige microscoop t vormthoed is eenvoudig te bedienen. We willen bovendien graag vermelden andere recente protocollen voor het afbeelden van de zebravis met zelfgebouwde LSFM setups, die geschikt zijn om bepaalde vragen te beantwoorden 23-25 ​​zou kunnen zijn. Een andere optie om toegang LSFM zijn de open platforms 26,27, waarbij het ​​open access principes gebruiken om het licht plaat microscopie om een bredere gemeenschap. De documentatie van zowel de hardware als de software aspecten is te vinden op http://openspim.org en https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

In dit protocol gebruiken we de beenvissen zebravis als een modelsysteem voor de ontwikkelingsprocessen met LSFM bestuderen. Morfogenese van de zebravisoog is een voorbeeld dat veel van de voordelen van LSFM onderstreept. LSFM is reeds in het verleden gebruikt om te onderzoeken ontwikkeling oog in medaka 28 en in de zebravis 29,30. In een vroeg ontwikkelingsstadium oog is ingewikkeld om het embryo juiste richting conventionele microscopie,als de omvangrijke dooier staat niet toe dat de embryo om aan de kant te liggen met zijn ogen geconfronteerd met de doelstelling. Echter, met LSFM inbouw in een agarose kolom, kan het monster reproduceerbaar gepositioneerd worden. Bovendien, bij de overgang van optische vesikel aan de optische kop fase het oog ingrijpende morfogenetische herschikkingen gepaard met groei, die vereist het vastleggen van een grote stapel z en een groot gezichtsveld. Ook voor deze uitdagingen LSFM superieur aan conventionele confocale beeldvorming. Het proces van vorming optische kop driedimensionaal, daarom is het moeilijk te begrijpen en uitsluitend visualiseren beeldvorming van een oog. Dit maakt multiview beeldvorming met isotrope resolutie gunstig. Na vorming optische kop, de retina steeds gevoeliger voor laserbelichting. Dus de lage fototoxiciteit geassocieerd met LSFM is een groot voordeel voor langdurige beeldvorming.

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor beeldvorming van 1-3 dagen oude zebravis embryo eennd larven met de nadruk op het oog ontwikkeling. Onze methode maakt het vastleggen van time-lapse filmpjes met betrekking tot 12-14 uur met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Belangrijker laten we ook een pijpleiding voor gegevensverwerking, die een essentiële stap in LSFM, aangezien deze techniek altijd genereert grote datasets, vaak terabytes bereik.

Protocol

LET OP: Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Unie (EU) Richtlijn 2011/63 / EU en de Duitse Animal Welfare Act. Het protocol is bedoeld te volgen zonder onderbreking van montage aan het monster beeldvorming. Afhankelijk van de praktische ervaring, zal het 2-3 uur duren om een ​​time-lapse experiment te starten. Gegevensverwerking is niet opgenomen in deze tijd berekening. Alle voor het experiment van terug te vinden in de controlelijst materiaal nodig voordat die wordt verschaft als een aanvullend document. Draag poedervrije handschoenen tijdens de stappen 1, 2, 3 en 4. Voor stappen 2, 3, 4 en 5 van het protocol ook verwijzen naar de officiële microscoop handleiding.

1. Voorbereidende werken voordat de Imaging Experiment

  1. Fluorescent Bead Stock Solution
    1. Voor dit protocol, gebruik maken van de 500 of 1000 nm diameter polystyreen korrels (aangeduid met rode emitting fluorescerende kleurstof). De werkverdunning van de korrels 1: 4,000. In de eerste plaats vortex de kraal voorraad oplossing voor 1 min. Verdun 10 ul van kralen in 990 pi DDH 2 O. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C en deze 1: 100 verdunning van de voorraadoplossing voor verdere verdunning in 01:40.
  2. De voorbereiding van Oplossing voor de monsterkamer
    1. In een 100 ml bekerglas mix 38,2 ml E3 medium zonder methyleenblauw, 0,8 ml 10 mM N -phenylthiourea en 1 ml 0,4% MS-222. Het is gunstig voor gefilterde E3 medium te kleine stofdeeltjes of onopgeloste kristallen drijvend in de monsterkamer later voorkomen.
  3. Fluorescerende Fish Embryo Selection
    1. In de dagen voorafgaand aan het experiment, bereiden embryo tot expressie fluorescerende eiwitten. Vlak voor het experiment, sorteren de embryo's onder fluorescente stereoscoop op gewenste sterkte van het fluorescentiesignaal. Neem 5-10 gezonde embryo's en dechorionate ze met behulp van een pincet.
      NB: Dit protocol is geoptimaliseerd voor 16-72 uur oudembryo.

2. Instellen van de monsterkamer

  1. Montage van de Drie Kamer Windows
    1. Er zijn 4 ramen in de monsterkamer, een voor het doel en drie af te dichten met de dekglaasjes (18 mm diameter, gekozen dikte 0,17 mm). Bewaar deze dekglaasjes in 70% ethanol. Veeg ze schoon zijn voor gebruik met de ether: ethanol (1: 4).
    2. Plaats het dekglaasje in het venster met behulp van fijne pincet en zorg ervoor dat het past in de kleinste groef. Bedek het met de 17 mm diameter rubberen O-ring en draai de verlichting adapterring functie kamer raam. Herhaal deze procedure voor de andere twee vensters.
  2. Bevestiging van de resterende Kamer Parts
    1. Schroef de adapter voor een passende doelstelling in het vierde resterende zijde van de kamer. Plaats de 15 mm diameter O-ring in het midden van de adapter.
    2. Schroef in de witte Luer-Lock-adapter in de rechter benedenhoek opening in de chamber en de grijze drain connector in de linkerbovenhoek opening. Blokkeer alle de drie overgebleven openingen met de zwarte blinde pluggen.
    3. Bevestig het Peltier blok en de metalen zwaluwstaart schuif bodem van de kamer met behulp van een inbussleutel. Bevestig de slang met de 50 ml spuit aan het Luer-Lock-adapter. Steek de temperatuursensor in de kamer.
  3. Plaatsen van de doelstellingen en de Kamer in de Microscope
    1. Kijk onder de stereoscoop dat alle doelstellingen zijn schoon. Gebruik de 10X / 0.2 doelstellingen verlichting en de Plan-Apochromat 20X / 1.0 W detectie objectieve en zorg ervoor dat de brekingsindex correctie kraag is ingesteld op 1,33 voor water. Schroef de detectie doel in de microscoop, terwijl het lichtdoorlatende doelstellingen gedekt.
    2. Verwijder de beschermende plastic doppen die het lichtdoorlatende doelstellingen. Schuif de kamer in de microscoop en draai het met de borgschroef.
    3. Sluit de temperatuur proen het Peltier blok met de microscoop.
      LET OP: De twee buizen die de koelvloeistof voor het Peltier blok circuleren zijn compatibel met beide aansluitingen. Ze vormen een functionerende schakeling ongeacht de stand van de verbinding.
    4. Vult de kamer via de spuit met de oplossing bereid in stap 1,2 tot aan de bovenrand van de kamer ramen. Controleer of de kamer niet lekt.
    5. Start de microscoop, incubatie en de controlerende en opslag computers. Start de microscoop besturingssoftware en stel de incubatietemperatuur tot 28,5 ° C.
      LET OP: Het duurt 1 uur duren om volledig in evenwicht. Bereid het monster in de tussentijd.

3. Monstervoorbereiding

  1. De voorbereiding van de Agarose Mix
    1. 15 min alvorens de agarose mix, smelt men 1 ml van 1% laag smeltpunt agarose (opgelost in E3 medium) in een verwarmingsblok ingesteld op 70 ° C. Zodra de agarose volledig molten, overdracht 600 ul in een schoon 1,5 ml buis, voeg 250 pl E3 medium, 50 pi 0,4% MS-222 en 25 pl gevortexed kraal voorraadoplossing.
      Opmerking: Dit maakt 925 pi van het mengsel, terwijl extra 75 ul berekend voor later toegevoegd samen met de embryo vloeistof.
    2. Houd de buis in een tweede verwarmingsblok bij 38-40 ° C of zorgen dat de agarose zeer dicht bij het gelpunt alvorens monster embryo erin.
  2. Montage van de Embryo's
    1. Neem vijf glazen haarvaten van 20 ui volume (met een zwarte vlek, ~ 1 mm binnendiameter) en plaats de bijpassende Teflon tip zuigers in hen. Duw de zuiger door de capillaire zodat de Teflon tip onder in het capillair.
    2. Transfer vijf embryo (een nummer dat in een keer worden bevestigd) met een glazen of plastic pipet in de buis gewerveld 37 ° C warm agarose mix.
      LET OP: Probeer te voeren over een minimale hoeveelheid vloeistof samen with de embryo's.
    3. Plaats de capillaire in de mix en zuigen één embryo binnen door aan de zuiger omhoog. Zorg ervoor dat het hoofd van het embryo komt de capillaire voordat de staart. Vermijd eventuele luchtbellen tussen de zuiger en het monster. Er moet ± 2 cm agarose boven het embryo en ± 1 cm eronder. Herhaal dit voor de resterende embryo's.
    4. Wacht tot de agarose volledig stolt, dat gebeurt binnen een paar minuten en dan slaan de monsters in E3 medium, door ze vasthouden aan de muur van een beker met plasticine of tape. De onderste opening van het capillair moet worden opknoping vrij in de oplossing waardoor gasuitwisseling aan het monster.
      LET OP: Een soortgelijk protocol bij de paragrafen 3.1 en 3.2 is ook te vinden op de OpenSPIM wiki pagina http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

4. De steekproef Positioning

  1. Sample Holder Assembly
    1. Plaats 2 plastic hoezen van de juiste maat (zwart)tegen elkaar in de monsterhouder steel. Hun spleet zijden moeten naar buiten wijzen. Maak de klemschroef los door er 2-3 rondes. Steek de capillair door de klem los en duw hem door de houder totdat de zwarte kleur band zichtbaar aan de andere kant. Vermijd het aanraken van de zuiger.
    2. Draai de klemschroef. Duw de overtollige 1 cm van agarose onder het embryo uit de capillaire en snijd het. Plaats de stang in de monsterhouder disc.
    3. Bevestigt de software die de microscoop podium in de laadpositie. Gebruik geleiderails gehele houder glijden met het monster loodrecht naar beneden in de microscoop. Zet hem, zodat de magnetische houder schijf sloten in positie.
  2. Het vinden van de capillaire
    1. Van nu af aan, de controle van het monster positionering door de software. In het tabblad Locate kies de Locate capillaire optie en de positie van de capillaire in x, y en z in beeld net boven de detectie van objectenive lens. Gebruik de grafische voorstelling in het specimen navigator voor begeleiding.
    2. Duw de embryo voorzichtig uit de capillaire totdat deze voor de pupil van het objectief detectie.
      OPMERKING: De 'Locate capillaire' de enige stap in de resterende protocol, waarbij het bovenste deksel van de microscoop te openen en het monster geduwd.
  3. Het vinden van de Sample
    1. Overschakelen naar optie 'Locate monster' en 0.5 zoom brengt de zebravis oog in het midden van het gezichtsveld. Draai het embryo, zodat het licht plaat niet door een sterk refractieve en absorberende delen van het monster passeert voordat het oog bereikt. Ook de uitgezonden fluorescentie moet een duidelijk pad uit het monster. Klik op 'Set Thuis Position'.
    2. Open de voordeur van de microscoop en zet de plastic deksel met een 3 mm opening aan de bovenkant van de kamer om verdamping te voorkomen.
      NB: Als het vloeistofniveau daalt onderde beeldvormende niveau zal het experiment worden aangetast.
    3. Controleer de hartslag van het embryo als een proxy voor de algehele gezondheid. Als het te langzaam, gebruik dan een ander monster (te vergelijken met de niet-gemonteerde controles; specifieke waarden afhangen ontwikkelingsfase). Overschakelen naar finale zoominstelling en stel de positie van het embryo.

5. Het opzetten van een Multidimensional Acquisition

  1. acquisitie parameters
    1. Schakel over naar het tabblad 'Overname'. Definieer het lichtpad waaronder laser lijnen, detectie objectieve, laser blokkeren filter, beam splitter en de camera's.
    2. Activeer de checkbox pivot scan. de andere overname-instellingen, zoals de bit diepte, beeldformaat, licht plaatdikte te definiëren en kies enkelzijdige verlichting.
    3. Druk op 'Continuous' en afhankelijk van de intensiteit van het verkregen beeld te wijzigen het laservermogen en de belichting tijd.
      LET OP: Voor het instellen van gebruik maken van alle beeldvorming instellingen de less laservermogen (0,5% van 100 mW laser 30 msec belichtingstijd), dan voor het eigenlijke experiment onnodige foto schade aan het monster te voorkomen.
  2. Light Sheet Adjustment
    1. Schakelen naar de 'Dual-zijdig Illumination' en activeren van de Online Dual Side Fusio'n checkbox '. Start de 'Lightsheet Auto-passen Wizard'. Volg de instructies stap voor stap.
      OPMERKING: De wizard verplaatst de lichtwaaier in het brandvlak van het objectief detectie en zorgt ervoor dat het niet gekanteld en de taille in het midden van het gezichtsveld. Nadat de automatische aanpassing worden de posities van de linker en rechter licht vellen automatisch geactualiseerd in de software. Een verbetering van de beeldkwaliteit moet nu duidelijk zijn. Activeer het selectievakje 'Z-stack'.
    2. Controleer het licht plaat instelling door het inspecteren van de symmetrie van het punt spreiding functie (PSF) gegeven door de fluorescerende kralen in het XZ en YZ ortho uitzicht. Als het niett symmetrisch, handmatig het licht vel parameter positie op en neer tot het bereiken van een symmetrische zandloper vormige PSF (Figuur 1A) aan te passen.
  3. Multidimensional Acquisition Instellingen
    1. Definieer de z-stack met de 'First Slice' en 'Last Slice' opties en zet de z stap tot 1 pm.
      LET OP: Het licht blad in deze microscoop is statisch en de z snijden wordt bereikt door het verplaatsen van het monster door. Gebruik altijd de optie 'Continuous Drive' voor een snellere acquisitie van z-stacks.
    2. Activeer het selectievakje 'Time Series'. Bepaal het aantal tijdstippen en het ertussen.
    3. Activeer het selectievakje 'Multiview'. Voeg de huidige weergave in de multiview lijst, waar de x, y, z en de hoek informatie wordt opgeslagen. Gebruik het podium controller om de capillaire draaien en bepalen de andere gewenste uitzicht. Het opzetten van een z-stack bij elke weergave en voeg ze toe aan de multiview lijst.
      LET OP: Desoftware sorteert het uitzicht op een seriële wijze, zodat het capillair in één richting wordt gedraaid, terwijl het beeld wordt verkregen.
  4. Drift Correctie en starten de Experiment
    1. Zodra de set-up acquisitie is afgerond, te wachten 15-30 minuten vóór het begin van het eigenlijke experiment.
      Opmerking: Het monster drijft aanvankelijk enkele micrometers in x, y en z, maar moet stoppen binnen 30 minuten. Als het monster blijft drijven langer, gebruik dan een ander monster of remount.
    2. Schakel over naar het tabblad 'onderhouden' en de optie 'Streaming' bepalen hoe de gegevens moeten worden opgeslagen, bijvoorbeeld één bestand per tijdstip of een apart bestand voor elke weergave en het kanaal. Ga terug naar het tabblad 'Acquisition', drukt u op 'Start Experiment' en definieer de bestandsnaam, de locatie waar het moet worden opgeslagen en het bestandsformaat (gebruik .czi).
    3. Houd rekening met de overname van de eerste keer dat punt om te bevestigen dat alles perfect loopt. Direct door te gaan met de registratieen fusie van de eerste tijdstip zoals beschreven in stappen 6 en 7, om te bevestigen dat het mogelijk is om de gehele dataset verwerken.

6. Multiview Registratie

  1. Multiview Wederopbouw Application
    1. Aan het einde van de opnamesessie overdracht van de gegevens uit de gegevensopslag computer op de microscoop om een ​​gegevensverwerkende computer. Gebruik de 'MultiView ReconstructionApplication '20,21,31 geïmplementeerd in Fiji 32 voor gegevensverwerking (Figuur 1B).
  2. Definieer Dataset
    1. Werk Fiji: Fiji> Help> Bijwerken ImageJ en Fiji> Help> Bijwerken Fiji. Gebruik de belangrijkste ImageJ en de Fiji-update sites.
    2. Breng de gehele dataset in één map. De resultaten en tijdelijke bestanden van de verwerking wordt opgeslagen in deze map. Start de MultiView Wederopbouw Application: Fiji> Plugins> Multiview Wederopbouw> Multiview Wederopbouw Application.
    3. Selecteer 'definiëren een nieuwe dataset'. Als type dataset selecteert u de meu optie 'Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset (LOCI Bioformats) "en maak een naam voor het XML-bestand. Selecteer vervolgens de eerste .czi dossier van de dataset (dwz bestand zonder index). Het bevat de beeldgegevens en de metadata van de opname.
      LET OP: Zodra het programma de eerste .czi bestand opent, worden de metadata in het programma geladen.
    4. Controleer of het nummer van de hoeken, kanalen, verlichting en observeer de voxel grootte van de metadata. Na op OK te drukken, te observeren drie afzonderlijke ramen open (figuur 1C): een logboek venster toont de voortgang van de verwerking en de resultaten, de 'ViewSetup Explorer' en een console, waarin foutmeldingen van Fiji.
      LET OP: De 'ViewSetup Explorer' is een gebruiksvriendelijke interface dat elke weergave, kanaal en verlichting geeft en zorgt voor de selectie van de dossiers van belang. Daarnaast is de 'ViewSetup Explorer' zorgt voor de aansturing van alle processtappen het.
    5. Selecteer de bestanden die moeten worden verwerkt en druk op de rechter muisknop in de verkenner. Observeer een raam open met verschillende processtappen (figuur 1C).
    6. Bij het definiëren van de dataset, constateren dat een XML-bestand in de map met de gegevens wordt gemaakt.
      OPMERKING: Dit bestand bevat de metadata die eerder werden bevestigd.
    7. In de rechterbovenhoek te observeren twee knoppen 'info' en 'save'. Door op 'info' toont een overzicht van de inhoud van het XML-bestand. Door op 'save' zal de verwerking van resultaten op te slaan.
      OPMERKING: Tijdens de verwerking in de 'MultiView Wederopbouw Application' de verschillende processtappen nodig hebben om in de XML worden opgeslagen voor het sluiten van Fiji.

oad / 53966 / 53966fig1.jpg "/>
Figuur 1: Multiview Wederopbouw workflow en rente punt detectie (A) Light blad afstemming op basis van fluorescerende kraal beeldvorming.. Het systeem is uitgelijnd (midden), wanneer het de kraal heeft een symmetrische zandlopervorm in xz en yz projecties. De voorbeelden van verkeerd lichtwaaier in beide richtingen getoond links en rechts. De maximale intensiteit projecties van een 500 nm kraal in xz, worden yz en xy assen getoond. Merk op dat de verhouding van de intensiteit van de centrale piek van de Airy disc (XY) aan de zijlobben groter, wanneer de lightsheet correct is uitgelijnd ten opzichte van de situatie uitgelijnd. Beelden werden genomen met 20X / 1.0 W doelstelling op 0,7 zoom. Schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. (B) De dataset wordt bepaald en vervolgens opnieuw opgeslagen in de hdf5 formaat. De kralen worden gesegmenteerd en vervolgens geregistreerd. Voor een tijdreeks elk tijdstip wordt geregistreerd op een referentietijd punt. De gegevens worden tenslotte versmolten tot eenenkele isotrope volume. (C, boven) De ViewSetup Explorer toont de verschillende tijdstippen, hoeken, kanalen en verlichting zijden van de dataset. (C, linksonder) Het venster BigDataViewer toont op het standpunt dat is geselecteerd in de ViewSetup Explorer. (C, midden rechts) Klik met de rechtermuisknop in de ViewSetup Explorer opent de verwerking opties. (C, rechter benedenhoek) De voortgang en de resultaten van de verwerking worden weergegeven in het logbestand. (D en E) Het doel van de detectie segmenteren zoveel belangstellingspunt (korrels) met zo weinig detectie in het monster mogelijk hier weergegeven als schermafbeeldingen van de interactieve kraal segmentatie. (D en E, linksboven) De segmentatie wordt bepaald door twee parameters, het verschil-of-Gaussische waarden voor Sigma 1 en de drempel. (D) Een voorbeeld van een succesvolle detectie met een vergroot aanzicht van een correct herkend kraal. (E) Segmentatie met te veel false positives en meerdere detecties van een enkele kraal. Schaal bar in (C) staat voor 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Resave Dataset in hdf5 Format
    1. Om de volledige dataset opnieuw op te slaan, selecteert u alle bestanden met Ctrl / Apple + a en klik met de rechtermuisknop. Selecteer vervolgens opnieuw opslaan dataset en als hdf5.
    2. Er verschijnt een venster weergeven van een waarschuwing dat alle standpunten van de huidige dataset wordt opnieuw opgeslagen. Druk op ja.
      LET OP: Het programma zal blijven om de .czi bestanden hdf5 opnieuw op te slaan door het openen van elk bestand opnieuw op te slaan en de verschillende resolutie niveaus van het hdf5 formaat. Het zal druk op 'done' bij de voltooiing. resaving usually duurt een paar minuten per tijdstip (zie tabel 1).
      LET OP: Aangezien de bestanden in de hdf5 formaat zeer snel kan worden geladen, is het nu mogelijk om de niet-geregistreerde dataset door 'rechts klikken' in de ontdekkingsreiziger en makelen bekijken 'display in BigDataViewer (on / off)'. Een BigDataViewer venster verschijnt met de geselecteerde weergave (figuur 1C). De kernfuncties van het BigDataViewer 33 worden uiteengezet in tabel 2 en http://fiji.sc/BigDataViewer.
  2. Detect Interest Points
    1. Selecteer alle tijdstippen met Ctrl / Apple + a en klik met de rechtermuisknop selecteer detecteren rente punten.
    2. Selecteer Verschil-of-Gauss-34 voor het type van belang punt detectie. Omdat de kraal gebaseerde registratie hier wordt gebruikt, type "parels" in het veld voor het label interest punten. Activeer 'downsamplen beelden voorafgaand aan segmentatie'.
    3. In het volgende venster, observeert de detectie instellingen. Voor 'subpixel lokalisatie "gebruik" 3-dimensionale kwadratische fit' 34 en het verschil-of-Gauss waarden en radius voor kraal segmentatie gebruik 'interactief' in het i'nterest punt specificatie "te bepalen.
    4. Voor 'Verlaag XY' gebruik 'Match Z resolutie (minder downsampling)' en voor 'Verkleinen Z' gebruik 1 ×. De z stap grootte is groter dan de xy pixelgrootte, dus gewoon naar beneden bemonstering van de xy aan te passen de z resolutie is voldoende. Selecteer 'compute op CPU (JAVA)'. Druk op 'OK'.
    5. In een pop-up venster, selecteert u een weergave voor het testen van de parameters uit het drop down menu. Zodra de weergave wordt geladen, de helderheid en het contrast van het venster met Fiji> Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast of Ctrl + Shift + C Vink het vakje 'look voor maxima (groen)' voor bead detectie.
    6. Let op de segmentatie in de 'viewSetup' als groene ringen around de detecties bij het zoeken naar maxima en rood voor minima. De segmentatie wordt gedefinieerd door twee parameters, het verschil-of-Gauss waarden voor Sigma 1 en de drempel (figuur 1D). Pas ze aan segment zo veel kralen rond de monster en zo weinig vals-positieve detecties in het monster mogelijk (figuur 1D). Detect elke kraal slechts een keer en niet meerdere keren (figuur 1E). Na het bepalen van de optimale parameters, drukt u op 'done'.
      NB: De detectie begint door het laden van elke individuele uitzicht op de tijdstip en segmenteren van de kralen. In het logbestand, het programma voert het aantal korrels gedetecteerd per view. De detectie moet worden gedaan in een paar seconden (zie tabel 1).
    7. Druk op te slaan wanneer de hoeveelheid detecties wenselijk is (600 tot enkele duizenden per view).
      NB: Een map wordt aangemaakt in de data directory, waarin de informatio zal bevattenn de coördinaten van de gedetecteerde kralen.
  3. Inschrijven via Interest Points
    1. Selecteer alle tijdstippen met Ctrl / Apple + a, klik met de rechtermuisknop en kies 'Register behulp Interest Points'.
    2. Gebruik 'fast 3d geometrische hashing (rotatie invariante)' voor bead detectie als 'registratie-algoritme'.
      Opmerking: Dit algoritme wordt geen voorgaande kennis van de oriëntatie en positionering van de verschillende standpunten ten opzichte van elkaar.
    3. Voor de registratie van de standpunten op elkaar, selecteer 'registreer tijdstippen individueel' als 'type registratie'. Voor 'interest points' in het geselecteerde kanaal, moet de eerder opgegeven label voor de rente punten nu zichtbaar zijn (dat wil zeggen "parels").
    4. In het volgende venster, gebruik maken van de vooraf ingestelde waarden voor de registratie. Bevestig de eerste weergave door 'Fix tegels: Fix eerste tegel en gebruik Niet in kaart back' (gebruik deze als tiles niet vast) in de rubriek 'Kaart Terug tegels'.
    5. Gebruik een 'gelijkstellingstransformatie model' met 'regularisatie'.
      OPMERKING: De toegestane fouten voor RANSAC zal 5px en 'betekenis voor een descriptor match zullen 10.' regularisatie 'gebruiken' rigide model 'met een lambda van 0,10, wat betekent dat de transformatie 10% hard en 90 zijn % affine 35. Druk op OK om de registratie te starten.
      LET OP: Zoals aangegeven in het log venster, eerst elke weergave is afgestemd met alle andere standpunten. Dan is de steekproef consensus (RANSAC) 36 test de correspondenties en sluit valse positieven. Voor een robuuste registratie dient de RANSAC hogere waarde dan 90% bedragen. Wanneer een voldoende aantal echte kandidaten overeenkomt tussen twee opvattingen worden gevonden, wordt een transformatie model berekend tussen elke wedstrijd met de gemiddelde verplaatsing in pixels. Dan is de iteratieve globale optimalisatie wordt uitgevoerd en alle standpunten zijn geregistreerd op het vaste weergave. Met de succesvolle registratie, is een transformatie model berekend en weergegeven met scaling en de verplaatsing in pixels. De gemiddelde fout moet optimaal onder 1 px en de schaling van de transformatie vlakbij 1. Registratie wordt uitgevoerd in seconden (zie tabel 1) zijn.
    6. Controleer dat er geen verschuiving tussen verschillende opvattingen waargenomen op fijne structuren in het monster, zoals celmembranen. Sla de transformatie voor elke weergave in het XML-bestand.
      OPMERKING: Nu de geregistreerde uitzicht overlappen elkaar in de BigDataViewer (Figuur 2A) en de kraal afbeeldingen moeten ook worden overlappen (Figuur 2B).
    7. Verwijder de transformaties door het selecteren van de tijdstippen klik met de rechtermuisknop op hen en selecteer vervolgens Verwijderen Transformations> Laatste / Nieuwste Transformation.

RE 2 "src =" / files / ftp_upload / 53966 / 53966fig2.jpg "/>

Figuur 2:. Resultaten van de multiview reconstructie (A) Overlay geregistreerde, ieder in een andere kleur dan de overlap daartussen tonen. (B) Vergrote weergave van de overlap van de PSF kralen afgebeeld vanuit de verschillende weergaven. (C) Close-up van een kraal na fusie, de PSF is een gemiddelde van de verschillende standpunten. (D) PSF van dezelfde korrel als in (C) na multiview deconvolutie blijkt dat de PSF stort in een enkel punt. (E) xy sectie en (F) yz doorsnede van een aanzicht van een optische vesikel, waarbij membranen worden gelabeld met GFP toont degradatie van het signaal z dieper in het weefsel. (G) xy sectie en (H) yz deel van dezelfde opvatting na gewogen gemiddelde fusie van 4 meningen ongeveer 20 graden van elkaar met iets meer Degraded xy resolutie over het algemeen maar verhoogde z-resolutie. (I) xy sectie en (J) yz gedeelte van dezelfde gegevens na multiview deconvolutie, die een aanzienlijke toename van de resolutie en het contrast van het signaal zowel xy en z. Afbeeldingen in (EJ) zijn enkele optische schijfjes. Schaal bar staat voor 50 micrometer (A, B, EJ) en 10 micrometer (C, D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Time-lapse Registratie
    1. Selecteer de hele tijd lapse, klik met de rechtermuisknop en kies 'registreren met behulp van Interest Points' om de time-lapse in de tijd te stabiliseren.
    2. In de 'Basisregistratie Parameters venster selecteren wedstrijd tegen één referentie tijdstip (geen globale optimalisatie) voor het type van de registratie'. Ke ep t hij andere instellingen hetzelfde als in de registratie van de individuele tijdstippen.
    3. In de volgendevenster het tijdstip te gebruiken als referentie, typisch een tijdstip in het midden van de time-lapse. Vink het vakje 'beschouwen elk tijdstip als rigide eenheid', omdat de individuele standpunten binnen elk tijdstip al op elkaar zijn geregistreerd.
    4. Vink het vakje voor 'Show tijdreeksen statistieken'. De andere registratie parameters blijven zoals voorheen met inbegrip van de regularisatie. Druk op OK.
      OPMERKING: In het logboek venster, zal dezelfde output worden weergegeven als in de afzonderlijke tijdstip registratie. Als de registratie voor de afzonderlijke tijdstippen succesvol en robuust was, de RANSAC is nu 99-100% en de gemiddelde, minimale en maximale fout is meestal lager dan 1 px. Bewaar deze registratie voordat u verder gaat.

7. Multiview Fusion

Opmerking: De resulterende transformaties uit de registratie stappen worden gebruikt om een ​​gecondenseerde isotrope stapel berekenen uit de meerdere aanzichten. Deze stack has z groter aantal segmenten ten opzichte van de oorspronkelijke gegevens, omdat de z afstand is nu gelijk aan de oorspronkelijke pixelgrootte in xy. De fusie kan worden uitgevoerd door ofwel een inhoudelijke multiview fusie of 21,31-Bayesiaanse MultiView deconvolutie 31, die zowel in de multiview reconstructie toepassing worden uitgevoerd.

  1. selectiekader
    OPMERKING: Fusion is een computationeel proces (zie tabel 1), dus de hoeveelheid gegevens verminderen door het definiëren inbinden verhoogt de verwerkingssnelheid.
    1. Selecteer alle tijdstippen klik met de rechtermuisknop en kies Definieer 'Selectiekader'. Gebruik 'Define met BigDataViewer' en kies een naam voor het selectiekader.
    2. Verplaats de schuifregelaar voor 'min' en 'max' in elke as naar de regio van belang vast te stellen en druk vervolgens op 'OK'. De parameters van het selectiekader wordt weergegeven.
      LET OP: Het inbinden zal alles binnen bevattenhet groene vak, dat is bedekt met een transparante magenta laag.
  2. Content-based Multiview Fusion
    OPMERKING: Content-gebaseerde multiview fusie 21 neemt de beeldkwaliteit verschillen de stapel (dat wil zeggen afbraak van het signaal in z) in aanmerking en past hogere gewichten voor een betere beeldkwaliteit in plaats van een eenvoudige gemiddelde.
    1. Selecteer het tijdstip (s) die in de 'ViewSetup Explorer' moeten worden gefuseerd, klik met de rechtermuisknop en kies 'Image Fusion / Deconvolutie'.
    2. In het Afbeelding Fusion venster, selecteert u 'Gewogen gemiddelde fusion' uit het drop down menu en kies 'Gebruik voorgedefinieerde Selectiekader voor Omsluitend Box'. Voor de uitvoer van het gefuseerde beeld select 'toe te voegen aan de huidige XML Project', waarin nieuwe hdf5 bestanden schrijft aan de reeds bestaande hdf5 bestanden en maakt het mogelijk met behulp van de het gefuseerde beeld geregistreerd gefuseerde uitzicht en samen. Druk op 'OK'.
    3. Dan in de 'Pre-definiëren Selectiekader & #39; pop-up venster selecteert u de naam van de eerder gedefinieerde selectiekader en druk op 'OK'.
    4. Let op de parameters van het kader in het volgende venster. Voor een snelle fusie, breng dan een naar beneden bemonstering van het gefuseerde dataset.
      LET OP: Als het gefuseerde stack is boven een bepaalde grootte, zal het programma raden u aan een meer geheugen efficiënter 'ImageLib2 containe'r. Overschakelen van 'ArrayImg' naar het 'PlanarImg (grote afbeeldingen, eenvoudig weer te geven) of CellImg (grote foto)' container, die de verwerking van grotere data mogelijk te maken. Anderszins gebruik maken van de vooraf gedefinieerde instellingen en toe te passen 'blending en content-based fusion'. Ga verder door op 'OK'.
    5. Let op de hdf5 instellingen in het volgende venster. Gebruik de vooraf gedefinieerde parameters en start het fusieproces. Zorg ervoor dat Fiji genoeg geheugen heeft toegewezen Bewerken> Opties> Geheugen & Threads.
  3. Multiview Deconvolutie
    NB: Multiview Deconvolutie 31 is Anothaar soort multiview fusie. Hier aanvulling op de fusie, wordt de PSF van het beeldvormingssysteem in aanmerking genomen om het beeld en de opbrengst verhoogde resolutie en contrast van het signaal Deconvolutie (vergeleken in figuur 2C-J, figuur 5 en Film 3).
    1. Selecteer het tijdstip (s) te deconvolved, klik met de rechtermuisknop en druk op 'Image Fusion / Deconvolutie'.
    2. Selecteer 'Multiview Deconvolutie' en het gebruik 'van de vooraf gedefinieerde inbinden en toe te voegen aan het huidige XML-project'. Selecteer de rechthoek en ga verder.
      OPMERKING: De vooraf gedefinieerde parameters voor de deconvolutie zijn een goed uitgangspunt. Voor de eerste proef gebruik '20 iteraties 'en de impact van de deconvolutie met behulp van de' Debug mode '. Tot slot zet de compute op in 512 x 512 x 512 blokken.
    3. In het volgende venster, gebruik maken van de vooraf gedefinieerde instellingen. Stel de 'debug mode' om de resultaten weer te geven elke '5 iterantsoenen '.
      : Het uitgangsniveau van de deconvolutie is 32-bit gegevens, maar de BigDataViewer nog ondersteunt alleen 16-bit data. Teneinde de uitgang van de deconvolutie toevoegen aan de bestaande hdf5 dataset, moet worden geconverteerd naar 16-bits.
    4. Voor de conversie, run 'Gebruik min / max van het eerste beeld (misschien intensiteiten verzadigen in de tijd).
      Attentie: de deconvolutie zal dan beginnen met het laden van de foto's en voor te bereiden op de deconvolutie.
  4. BigDataServer
    1. Om het grote XML delen / hdf5 gegevensverzamelingen worden gebruikt de HTTP server 33 BigDataServer. Een inleiding over hoe te installeren en aan te sluiten op een dergelijke server kan worden gevonden op http://fiji.sc/BigDataServer.
    2. Om aan te sluiten op een bestaand BigDataServer geopend Fiji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
    3. Voer de URL zoals de haven in het venster.
      NB: De in deze publicatie beschreven films zijn toegankelijk via deze advertentiejurk: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
    4. Observeer een raam die het mogelijk maakt het selecteren van de beschikbare films. Dubbelklikken om het venster BigDataViewer openen en de gegevensweergave zoals eerder beschreven.

Aanvullend: Checklist materiaal die nodig is voordat u begint

  • zebravisembryo's / larven expressie fluorescerende eiwitten (Houd de embryo zebravis E3 medium zonder methyleenblauw. Voor stadia ouder dan 24 uur tegen de pigmentatie door het toevoegen PTU tot een eindconcentratie van 0,2 mM.)
  • fluorescerende stereoscoop
  • capillairen (20 pl volume met een zwarte streep) en passende plunjers (niet opnieuw de capillairen. De plunjers, daarentegen, kan worden hergebruikt voor verschillende experimenten.)
  • 1,5 ml kunststofbuizen
  • scherpe pincet
  • glas (vuur gepolijst) of kunststof pipetten (kunststof kan worden gebruikt voor 24 uur en oudere embryo)
  • glas of plastic schaaltjes diameter 60 mm (kunststof kan wordengebruikt voor 24 uur en ouder embryo's)
  • twee 100 ml bekers
  • 50 ml luerlockspuit met 150 cm verlengslang voor infusie (De slang en de spuit moet volledig droog tussen de experimenten om besmetting door micro-organismen te voorkomen worden gehouden.)
  • plasticine
  • laag smeltpunt (LMP) agarose
  • E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4)
  • MS-222 (tricaïne)
  • fenylthioureum (PTU)
  • fluorescerende microbolletjes (hier aangeduid als kralen)
  • dubbel gedestilleerd H 2 O (DDH 2 O)

Representative Results

LSFM is een ideale methode voor het afbeelden van ontwikkelingsprocessen over schalen. Verscheidene toepassingen worden hier opgesteld waarbij zowel korte als lange termijn beeldvorming van intracellulaire structuren, alsook cellen en volledige weefsels. Deze voorbeelden tonen ook dat LSFM is een nuttig instrument op verschillende stadia van oogontwikkeling van optische formatie cup neurogenese in de retina. Film 1 dient ter illustratie van de algemene LSFM benadering, eerst met een uitgezoomd aanzicht van een intacte embryo in de inbedding in agarose cilinder helderveld en later toont een gedetailleerde weergave van het netvlies in het kanaal fluorescentie.

film 1
Film 1:. LSFM van de zebravis netvlies Om de LSFM aanpak te illustreren, deze film toont voor het eerst in de helderveld dat het embryo intact is afgebeeld in de agarose cilinder voordat u naar fluorescentie. Later is aangetoond dat het grote gezichtsveld maakt waarneming van de hele retina. Vervolgens wordt de film toont een vergroot klein gebied van het netvlies aan de goede subcellulaire resolutie te markeren. Een Ath5: gap-GFP 37 transgene zebravis embryo werd gebruikt voor de beeldvorming. Deze transgene labels verschillende neuronen in het netvlies (voornamelijk ganglioncellen en fotoreceptoren voorlopers). De fluorescentie deel van de film werd vastgelegd als één weergave opname met dubbelzijdige belichting met behulp van de 40X / 1.0 W objectief met intervallen van 5 min. De maximale intensiteit projectie van een 30 pm dikke volume wordt getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Film 2 laat zien, hoe zeer snel intracellulaire gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met een hoge resolutie; in dit geval de groei van microtubulihun plus eindigt de retinale neuronale progenitorcellen. De informatie in de film informatie maakt het mogelijk voor het bijhouden en kwantificering van microtubuli plus einde groei.

Movie 2
Movie 2:. Dynamiek van microtubuli in één cel Deze film vangt groeiende plus tips van microtubuli gelabeld door de plus fooi marker eiwit EB3-GFP 38. Het eiwit wordt tot expressie gebracht in een enkele retinale voorlopercel. De microtubuli worden voornamelijk groeien in de richting van apicale basale (van boven naar beneden). De gemiddelde snelheid van de EB3 kometen werd gemeten als 0,28 ± 0,05 um / sec. Het lichtpuntje aan de apicale kant van de cel vertoont hoge microtubule nucleatie activiteit is de centrosome. De wild-type embryo geïnjecteerd met hsp70: EB3-GFP plasmide-DNA. De film werd verkregen 4 uur na hitteschok (15 min bij 37 ° C) en ongeveer 28 hrpost meststofatie (HPF) als een enkele weergave opname met enkelzijdige verlichting met behulp van de 63x / 1.0 W objectieve en 1 sec tijdsintervallen. De enkele cel werd bebouwd van een gezichtsveld voor de meerderheid van de retina. De maximale intensiteit projectie van twee sneetjes wordt getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur 3 toont, hoe intracellulaire structuren te volgen gedurende vele uren. Hier wordt het centrosoom in translokatie retinale ganglioncellen (RGC's) gevangen.

figuur 3
Figuur 3:. Centrosome lokalisatie in de retinale ganglioncellen translocatie Deze montage van een time-lapse experiment toont de positie van het centrosoom gehele retinale ganglioncellen (RGC) rijping.In de neuronale voorlopercellen de centrosome is gelokaliseerd in het uiterste puntje van de apicale proces (01:00). Tijdens de celdeling, de twee centrosomes dienen als palen voor de mitotische spindel (02:25). Deze divisie levert een dochter cel die differentieert in een RGC en een tweede dochter cel die een fotoreceptorcel voorloper wordt. Na deling, het cellichaam van de RGC zich naar de basale zijde van de retina, terwijl de apicale proces aan de apicale zijde bevestigd blijft. Zodra de RGC de basale kant bereikt, zijn apicale proces los en het centrosoom reist mee (06:15). De centrosome kan worden gevolgd, terwijl geleidelijk aan samen met de apicale proces (06:50, 07:20, 08:10) terugtrekken. In het laatste frame (08:55) de ganglion cel groeit een axon van zijn basale kant, terwijl de centrosome nog apicaal is gelokaliseerd. Het mozaïek expressie werd bereikt door het plasmide DNA injectie in wild-type embryo in één cel stadium. De cellen worden gevisualiseerd door de Ath5: GFP-CAAX (groen) construct, die RGC en andere neuronen labels. De centrosomes (pijlpunten) worden gelabeld door Centrin-tdTomato 29 expressie (magenta). De apicale kant van het netvlies is bovenaan van de afbeelding en de basale zijde onderaan. De maximale intensiteit projectie van een 30 pm dikke volume wordt getoond. De beelden werden bebouwd van een film die het hele netvlies. De film begint bij ongeveer 34 uur na de bevruchting (HPF). Een z stack werd overgenomen om de 5 min met de 40X / 1.0 W doelstelling. Tijd wordt in hh: mm. Schaal balk vertegenwoordigt 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In figuur 4 is weergegeven, hoe enkele cel gedrag kan uit gegevens registreren van het gehele weefsel worden geëxtraheerd, zoals in film 1. Transplantaat van een RGC gemakkelijk worden gevolgd en de apicale en basale proceses gevolgd.

figuur 4
Figuur 4:. Transplantaat van een retinale ganglioncellen De RGC translocatie van apicale basale zijde van de retina optreedt nadat de terminal mitose zoals beschreven in figuur 3 de RGC gelabeld door expressie van de Ath5. Gap-GFP 37 transgen. De maximale intensiteit projectie van een 30 pm dikke volume wordt getoond. De beelden werden bebouwd van een film die het hele netvlies. De film begint bij ongeveer 34 HPF. Een z stack werd overgenomen om de 5 min met de 40X / 1.0 W doelstelling. Tijd wordt in hh: mm. Schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5 toont het vermogen van multiview LSFM om weefsel sc vangenale morfogenetische processen cellulaire resolutie over het voorbeeld van optische kop morfogenese, waarbij optische vesikel transformeert in een optische kop. De beeldkwaliteit kan sterk worden verbeterd door multiview beeldvorming, wanneer het uiteindelijke beeld wordt gecombineerd uit de gegevens van 5 verschillende aanzichten (in dit geval) in een z-stack met isotrope resolutie. Dit cijfer illustreert de verbetering van de beeldkwaliteit na gewogen gemiddelde fusie en de verdere toename in het contrast en de resolutie na multiview deconvolutie. De figuur toont twee optische schijfjes in verschillende oriëntaties door de dataset. Daarnaast is er een montage van de deconvolved dataset toont de optische kop morfogenese loop van de tijd. Alle tijdstippen worden vervolgens getoond in Movie 3.

figuur 5
Figuur 5: Vergelijking van de beeldkwaliteit tussen enkele weergave en twee methoden van multiview fusie. (A) Een optische schijfje enkele weergave gegevens blijkt uit zijaanzicht en (B) dorsaal aanzicht. Streep artefacten en degradatie van het signaal dieper in de steekproef zijn duidelijk zichtbaar. Ook een deel van het beeld zichtbaar in het gefuseerde data (CF) werd niet meegenomen in dit aanzicht. (C) Dezelfde optische schijfje, nu net zo multiview gefuseerd data blijkt uit zijaanzicht en (D) dorsaal aanzicht. Merk op dat stripe artefacten onderdrukt en structuren diep in het monster beter opgelost. (E) De dezelfde optische schijfje nu net zo multiview deconvolved data blijkt uit zijaanzicht en (F) dorsaal aanzicht. Let op de verhoogde contrast en de resolutie, zodat de individuele celmembranen en kernen goed kunnen worden onderscheiden. De resolutie is niet verslechtert met name dieper in het monster. De dataset is verworven met dubbelzijdige belichting vanaf 5 keer bekeken ongeveer 20 graden van elkaar. De z-stacks van abuit 100 urn met 1,5 micrometer stapgrootte werden verworven bij elke weergave in 10 minuten intervallen gedurende 10 uur met de 20X / 1.0 W doelstelling. Input beelden voor het multiview fusion en deconvolutie werden naar beneden bemonsterd 2 × het versnellen van de beeldverwerking. 15 herhalingen van de multiview deconvolutie werden uitgevoerd. (G) De montage toont een bijgesneden gedeelte van de dorsale uitzicht vanaf de deconvolved gegevens naar de morfogenetische gebeurtenissen tijdens de vroege ontwikkeling oog van de optische blaasjes aan de optische kop podium te markeren. De twee lagen van het optische vesikel, die aanvankelijk vergelijkbare kolomvormige epitheel zijn, differentiëren in verschillende celpopulaties. Het distale laag nabij de epidermis wordt het netvlies neuroepithelium (RN) en de proximale laag nabij de neurale buis wordt het retinale pigmentepitheel (RP). De cellen in de RN langwerpige en invaginate aan de optische kop (1:40-05:00) te vormen; op hetzelfde moment de RP cellen plat. Het oppervlak ectoderm wordt geïnduceerd een lens (01:40) vormen, which invaginates later (05:00). De film begint om 17 HPF. Tijd wordt in hh: mm. Alle cellulaire membranen worden gelabeld door de β-actine Ras-GFP-transgen en de kernen worden gelabeld door de hsp70: H2B-RFP transgen. Schaal bar vertegenwoordigt 30 micrometer. FB voorhersenen, LE lens, OP olfactorische placode, RN retinale neuroepithelium, RP netvliespigmentepitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Movie 3
Movie 3: Optic kop morfogenese getoond met één oog en twee methoden van multiview fusion De time-lapse film illustreert het volledige proces van de optische kop morfogenese van de optische blaasjes aan de optische kop podium.. Het toont een enkele optische segment van de zijaanzicht (boven) en een optische segment van de dorsaal aanzicht (onder). De cellen van de ontwikkeling van optische vesikel ondergaan complexe herschikkingen om uiteindelijk vormen de hemisferische optische kop met de binnenste en buitenste netvlies neuroepithelium retinaal pigment epitheel. Een lens gevormd door het oppervlak ectoderm. Het invaginates samen met de neuro-epitheel en zit in de optische kop. Alle cellulaire membranen worden gelabeld door expressie van het β-actine Ras-GFP (groen) transgen en de kernen worden gemerkt met hsp70: H2B-RFP (magenta). De film begint bij ongeveer 17 HPF. De dataset is verworven met dubbelzijdige belichting vanaf 5 keer bekeken ongeveer 20 graden van elkaar en az stapels van ongeveer 100 urn werden elke 10 min is opgedaan met de 20X / 1.0 W doelstelling. Tijd wordt in hh: mm. Schaal bar vertegenwoordigt 50 micrometer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

1. Kritische stappen en probleemoplossing voor de data-acquisitie

De typische imaging instellingen voor een GFP en RFP expressie monster te vinden in Tabel 3. In de beschreven opstelling de microscoop lichtwaaier statisch, gevormd door een cilindrische lens. De twee verlichting doelstellingen zijn voorzien van lenzen en de detectie doel is een water-dompelen lens. Zoom 1.0 met 20X / 1.0 of 40X / 1.0 doelstellingen geeft 230 nm en 115 nm pixelgrootte en een gezichtsveld van 441 x 441 urn of 221 x 221 micrometer respectievelijk. Het wordt aanbevolen om de standaard licht plaatdikte gebruiken met het centrum verhouding 1 Rand: 2. Voor 20X / 1,0 deze dikte correspondeert met 4,5 urn en 40X / 1,0-3,2 urn in het midden. Als afbeeldingssnelheid niet de eerste prioriteit moeten gescheiden sporen bij een multicolor monster overspraak van fluorescentie-emissie tussen de kanalen te voorkomen. De hoogste snelheid van de overname is beperkt tot 50 msec per z stap voor debewegingssnelheid van de z-driver. Als het doel is om de maximale imaging snelheid te bereiken in het geval van, bijvoorbeeld, twee tracks met dubbelzijdige verlichting, de belichtingstijd moet worden ingesteld, zodat de som van alle genomen per z stap beelden is onder de 50 msec. Anderzijds, als één beeld per z stap wordt verkregen, is niet bevorderlijk voor de belichtingstijd korter dan 50 msec ingesteld.

afbeelding 1920 x 1920 formaat
16-bits
Pivot scannen op
Dubbelzijdige belichting met online fusion
10X / 0.2 objectief verlichting
20X / 1.0 W Plan-Apochromat detectie doel
Track 1: excitatie 488 nm normaal 2% van 100 mW laser, 550 nm SP emissie filter
Track 2: excitatie 561 nm meestal 3% van 75 mW laser, 585 nm LP emissie-filter
Belichtingstijd tot 100 msec
Z-stack dikte van 50-100 urn
1-1,5 micrometer z stapgrootte in de continue z drive mode
Incubatie bij 28,5 ° C

Tabel 3: Imaging-instellingen.

Het inspecteren van het monster na het experiment

Het is belangrijk dat het monster nog gezond aan het eind van het experiment. Als eerste uitlezing, controleer dan de hartslag van het monster onder een stereoscoop. Met een paar scherpe tang uit het monster kan worden genomen van de agar en verhuisde naar de incubator voor om na te gaan of het werd beïnvloed door de beeldvorming verder te ontwikkelen. Als alternatief kan worden vastgesteld voor antilichaamkleuring.

Montage en drift

Het is essentieel om de osmolariteit van de kamer houden waarinPLOSSING dichtbij de osmolariteit van de inbedding agarose, anders zwellen / krimpen van de agarose en daaropvolgende instabiliteit van het monster optreedt. Daarom gebruik maken van dezelfde oplossing (E3 medium zonder methyleenblauw) om de kamer te vullen en om de 1% laag smeltpunt agarose porties te bereiden. Bovendien, niet de agarose in 70 ° C verwarmingsblok reactie langer dan 2 uur, omdat het de gelerende eigenschappen kan verliezen.

Laat de vis niet insluiten in te heet agarose, omdat dit kan leiden tot een heat shock respons of de dood van het embryo. Bij twijfel over het effect van warm agarose op de embryo's, controleer dan of de staart niet buigen en dat de hartslag niet te vertragen. Als dit gebeurt, gebruik dan een andere embryo voor het experiment.

Houd de totale lengte van de agarose kolom met het monster kort (ongeveer 2 cm) en monteer de zebravis met zijn kop gericht op de plunjertop. Ook de agarose cylinder geëxtrudeerd uit de capillary zo kort mogelijk worden gehouden. Deze maatregelen zullen zorgen voor de stabiliteit van het monster in de hele film. Tegelijkertijd moet de agarosekolom lang genoeg zijn zodat de glazen capillair zich niet tot aan de lichtweg, aangezien deze belangrijke breking en reflectie zou veroorzaken.

De initiële drift van het monster wordt veroorzaakt door de volumeveranderingen van de agarose cylinder zelf. Glijden van de zuiger is niet de reden voor het. Daarom is het niet helpen om de plunjer met plasticine of nagellak op te lossen. Het embryo kan zijn positie in de loop van de film te veranderen als gevolg van de natuurlijke groei. Dienovereenkomstig is het raadzaam om het gebied van belang te centreren in het midden van het gezichtsveld en houden wat ruimte aan de randen van deze bewegingen tegemoet.

Verminderde hoeveelheid inbedding medium in het lichtpad

Oriënteren van de sample correct helpt om de best mogelijke beeldkwaliteit 15 bereiken. Genrally, excitatie en emissie licht moet reizen door zo weinig weefsel en montage media mogelijk. De optimale oplossing is agarose-montage. Dit gebeurde bijvoorbeeld in een opstelling voor Arabidopsis zijwortelinitiatie imaging 14, waarbij de hoofdwortel in Phytagel gemonteerd en de laterale wortels werden vervolgens laat volledig uit de gel kolom groeien. Agarose-montage werd ook ontwikkeld voor de beeldvorming van de volledige embryogenese van Tribolium kever over twee dagen 12. Beeldkwaliteit verbetering was geen primaire motivatie in dat geval. Tribolium embryo's gewoon niet lang genoeg overleven in de agarose. Een absoluut inbedding media-montage niet is bereikt voor de lange termijn beeldvorming in de zebravis. Toch kunnen we gebruik maken van het feit dat wanneer de agarose stolt, de meeste embryo schuin gepositioneerd in de capillair met een oog diep in de agarose en het tweede oog dicht bij het oppervlak van de inbedding kolom. Thij oog dichter bij het oppervlak zorgt voor een superieure beeldkwaliteit en moet daarom bij voorkeur worden afgebeeld.

Agaroseconcentratie en langdurige imaging

De concentratie van agarose voor de montage is een compromis tussen stabiliteit van het monster en de mogelijkheid om de groei van het embryo en diffusie van zuurstof te accommoderen. Er is geen extra toename in de stabiliteit van het monster bij gebruik van agarose hogere concentraties dan 1%. Als uitgangspunt voor het optimaliseren van de experimenten raadzaam 0,6% agarose, die ook geschikt is voor embryo's jonger dan 24 HPF die te fijn in 1% agarose te monteren zijn. Om oudere embryo's en larven verdoven, kan de MS-222-concentratie worden verhoogd tot 200 ug / ml zonder bijwerkingen 13.

Indien ontwikkelende embryo's worden afgebeeld langer dan ± 12 uur, agarose montage wordt afgeraden, omdat het de groei van het embryo en caus beperktes staart vervorming. Dit probleem werd opgelost door het monteren van de zebravis embryo's in FEP polymeer buizen met brekingsindex vergelijkbaar met water 13,39. Muizenembryo's, anderzijds, kunnen worden geïmmobiliseerd op agarose holle cilinders 40 of gaten van een acryl staaf bevestigd aan een injectiespuit 41. FEP buis montage wordt echter niet aanbevolen als standaard methode, omdat de wand van de buis breekt het licht iets meer dan agarose.

Light sheet alignment

Voor een goede beeldkwaliteit is het essentieel om de automatische licht blad uitlijnen voor elk experiment. Vooral als de zoominstellingen werden gewijzigd, werden de doelstellingen uitgenomen of een andere vloeistof die in de kamer.

Verlichting

Het draaipunt scannen van het licht plaat moet altijd worden geactiveerd. Voor grote verstrooiing specimens moet de dubbelzijdige belichting toepassing online fusion om gelijkmatige verlichting over het gezichtsveld te bereiken. Dubbelzijdige verlichting vermindert ook een specifiek probleem van het oog imaging, dat de breking van het binnenkomende licht door de lens plaat van het embryo. Kleinere, minder verstrooiende monsters efficiënt worden afgebeeld met behulp enkelzijdige verlichting, waarbij de beeldvormende verkort helft en kan leiden tot iets betere beeldkwaliteit in vergelijking met dubbelzijdige belichting. Dit komt omdat de lichtwegen van de belichting twee armen altijd anders en efficiënter kan worden gekozen. Daarnaast zijn de twee lichte lakens uit elke kant zijn nooit perfect in één vlak, wat mild oorzaken vervagen na de fusie. Voor zeer snelle intracellulaire gebeurtenissen, zoals de groeiende microtubuli (Movie 2), de dubbele eenzijdige belichting niet geschikt is, omdat de beelden met verlichting van links en rechts worden verworven na elkaar, wat kan resulteren in motion blur.

Photobleachingen fototoxiciteit

Minder fluorofoor fotobleken wordt vaak genoemd als een belangrijk voordeel van de LSFM. We beweren dat het doel geen fotobleken helemaal zou moeten zijn. Als er merkbaar fotobleken in de live-imaging experiment, het monster is waarschijnlijk al uit zijn fysiologische reeks verdragen blootstelling laser. Bij beeldvorming van de zebravis embryo's in de draaiende schijf microscoop, in onze ervaring, hoge fototoxiciteit kan embryonale ontwikkeling kraam nog voordat het fluorescerende signaal bleekmiddelen aanzienlijk. Daarom moet de beeldvormende instellingen in het LSFM aangepast zodat er weinig of geen fotobleken waargenomen. Hoewel LSFM aangenaam is voor het monster, is het verstandig om slechts zoveel laservermogen en blootstellingstijd als nodig is om een ​​signaal-ruisverhouding voldoende is voor de latere gegevensanalyse bewerkstelligen.

Z-stack, tijdsintervallen en data-formaat

De bestanden die door LSFM zijn meestal erg groot; soms in de terabyte assortiment. Het is vaak nodig een compromis tussen beeldkwaliteit en gegevensgrootte maken. Dit is met name het geval voor z tussenruimte van stacks en intervallen in de time-lapse acquisities. Aan de z frequentie ervan, moet de optimale knop in de tab Z-stack instrument idealiter worden gebruikt, vooral als de dataset later wordt deconvolved. Het berekent de afstand tot 50% overlap tussen aangrenzende segmenten optische bereiken. Toch, wat grotere z intervallen zijn meestal aanvaardbaar. Ze verminderen de tijd die nodig is om de z-stack en de uiteindelijke bestandsgrootte verwerven. De optimale time sampling afhankelijk van het proces plaats. Voor algemene oogontwikkeling 5-10 min intervallen zijn meestal aanvaardbaar. Als sommige structuren automatisch worden bijgehouden, mag de latere tijdspunten gelijkaardig.

fluorescerende kralen

Fluorescerende kralen in de eerste plaats dienen als ijkpuntmarkers voor het registreren van verschillende weergavenvan een multiview dataset op elkaar. vortex altijd de kraal-oplossingen voor gebruik goed. Verwarm de kralen omdat dit kan leiden tot verlies van de fluorescerende kleurstof. De optimale concentratie voor de kraal multiview registratie moet experimenteel bepaald worden. De beschreven plugin werkt het beste met ongeveer 1.000 gedetecteerd kralen in elk oog. Groter (500 nm of 1000 nm) kralen steviger gedetecteerd dan kleinere (minder dan 500 nm) kralen. Dit komt doordat grotere kralen zijn lichter en gemakkelijker te segmenteren zonder vals positieve detecties van structuren in het monster. Het nadeel van de grotere korrels is dat ze zeer prominent in het uiteindelijke gesmolten en deconvolved beeld. Voor elke nieuwe fluorescente merker, de juiste korrelgrootte en fluorescentie-emissie te optimaliseren. Om een voorbeeld te geven van het monster uit figuur 5 en Movie 3, 100 nm groene emissie kralen gaven te veel vals positieve detecties in het membraan-GFP-kanaal, maar 1000 nm rode emissie parels werden robuust gedetecteerd in de H2B-RFP kanaal met zeer weinig positieve detecties in het monster. Als de kraal detectie mislukt in het kanaal met de fluorescente merker kan een afzonderlijk kanaal alleen die korrels worden verkregen, maar dit is niet erg praktisch. De sub-resolutie sized kralen geven directe uitlezing van de puntspreidingsfunctie (PSF) van de microscoop, die kan worden gebruikt voor deconvolutie (figuur 2C-D). Als de registratie en fusie beter met grotere kralen (bijv 1000 nm) werkt, kan een nieuw beeld van de PSF met sub-resolutie, bijvoorbeeld 100 nm kralen worden verworven. Het gebruik van multicolor kralen is nuttig tijdens de registratie van multichannel-acquisitie en voor het verifiëren dat de kanalen overlay perfect.

Toevoeging van fluorescerende kralen is niet noodzakelijk bij beeldvorming van één beeld zonder verdere multiview registratie en fusie. Maar zelfs in die gevallen kralen kan nuttig tijdens de Initia zijnl licht blad aanpassing om te controleren of de kwaliteit van het licht blad en in het algemeen optische aberraties te onthullen. Dergelijke optische aberraties kunnen afkomstig zijn van verschillende bronnen, zoals beschadigd of vuil doelstellingen, vuile ramen van de kamer of inhomogeniteit in de agarose. Kralen kunnen ook gebruikt worden voor drift correctie door de multiview registratie Fiji plugin 20.

Multiview

Voor de reconstructie multiview doel, is het beter om een ​​oneven aantal views 3, 5 en dergelijke, die niet elkaar tegengestelde verwerven. Dit verbetert deconvolutie aangezien de PSF's worden afgebeeld vanuit verschillende richtingen. Het is ook belangrijk te bevestigen aan het begin van de tijdspanne verkrijging moet er voldoende overlap van de aanzichten. Dit kan het beste empirisch gedaan, dat wil zeggen, meteen bevestigd dat de standpunten in het eerste tijdstip met succes kan worden geregistreerd. Als het doel van de multiview overname is om de resolutie te verhogenvan een afbeelding van een grote verstrooiing specimen, is het niet raadzaam om beeld het volledige specimen in elke weergave, maar stoppen rond het midden van het monster, waarbij het signaal verslechtert. De lage kwaliteit overname uit de tweede helft van het monster zou nuttige informatie niet toe te voegen aan de multiview wederopbouw.

2. Kritische stappen en probleemoplossing voor de gegevensverwerking

Op dit moment bestaan ​​er verschillende mogelijkheden voor het verwerken van multiview gegevens van een lichte plaat microscoop die goed zijn gedocumenteerd en relatief eenvoudig vast te stellen. We gebruiken de multiview wederopbouw van toepassing, dat is een open source software in Fiji 32 (Stephan Preibisch ongepubliceerde, geïmplementeerd Link 1a en Link1b in de lijst van materialen). Deze plugin is een belangrijke herontwerp van de vorige SPIM registratie plugin 20, beoordeelddoor Schmied et al. 42, de integratie van de BigDataViewer en de XML en hdf5 formaat 33 met de SPIM registratie workflow (Figuur 1B, Link 2 , Link 3 ). Deze toepassing kan ook worden aangepast voor high performance computing cluster, die aanzienlijk versnelt de verwerking 43. Deze multiview registratieaanvraag wordt actief verder ontwikkeld en steeds beter. In geval van problemen of functies verzoeken om de beschreven software, dient u problemen op de respectievelijke pagina's GitHub ( Link 4 voor Multiview Wederopbouw en Link 5 voor BigDataViewer).

De tweede optie is om de commerciële software gebruiken samen met de microscoop. Deze oplossing werkt goed en biedt werk aan hetzelfde principe met fluorescerende kralen om de verschillende standpunten registreren. Echter, het mist de mogelijkheid om de gehele dataset visualiseren snel als de BigDataViewer. Ook de software kan niet worden aangepast aan de cluster en bovendien de bewerkingsblokken de microscoop voor andere gebruikers zonder aanvullende licentie voor de software wordt aangeschaft.

De derde optie, die ook is een open source software, werd onlangs gepubliceerd door de Keller lab 44 en biedt een uitgebreid kader voor de verwerking en downstream-analyse van het licht plaat data. Deze software maakt gebruik van informatie vanuit het monster naar Multiview fusion voeren, daarom sluit de aanwezigheid van fluorescerende kralen om het monster nodig. Maar tegelijkertijd veronderstelt orthogonale oriëntatie van de standpunten imaging (doelen), dus het kan niet worden gebruikt voor data verkregen van willekeurige hoeken 44.

hardware vereisten

ntent "> De hardware voor verwerking kunnen worden in tabel 4. Er moet voldoende opslagcapaciteit en een duidelijke pijpleiding data processing, vóór de eigenlijke experiment. Overname van de afbeeldingen sneller dan daaropvolgende analyse en het is gemakkelijk te krijgen overspoeld met onbewerkte data. het is vaak niet realistisch om alle rAW-afbeeldingen, maar eerder een bijgesneden versie of bewerkte beelden op te slaan, zoals gefuseerde uitzicht, maximale intensiteit projecties of sferische uitsteeksels 45.

bewerker Twee Intel Xeon processor E5-2630 (Six Core 2.30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / sec)
Geheugen 128 GB (16 x 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Harde schijf 4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7.200 rpm) harde schijf
HDD Controller PERC H310 SATA / SAS Concontroller voor Dell Precision
HDD Configuration C1 3.5 inch SATA, 1-4 Harde Schijven
grafiek Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kaarten w / 2 DP & 1 DVI-I per stuk) (2 DP-DVI & 2 DVI-VGA adapter) (MRGA17H)
Netwerk Intel X520-T2-poorts 10 GbE Network Interface Card

Tabel 4: Hardware-eisen.

Verwerking van gegevens snelheid

De tijd nodig voor dataverwerking afhankelijk van de afmetingen van de data en de gebruikte hardware. In tabel 1, geven we een overzicht van de tijd die nodig is voor de belangrijkste stappen in de verwerking van een voorbeeld 8,6 GB multiview dataset die bestond uit 1 tijdstip met 4 x bekeken en 2 kanalen.

Processing step Tijd Protocol stap
Opnieuw opslaan als hdf5 6 min 30 sec 6.3
Detect Interest Points 20 sec 6.4
Inschrijven via interest punten 3 sec 6.5
Content-based MultiView fusion 4 hr 7.2
Multiview deconvolutie (CPU) 8 hr 7.3
Multiview deconvolutie (GPU) 2 uur 7.3

Tabel 1: Data Processing Time.

Input data formaten voor multiview reconstructie

De Fiji Plugin Multiview Reconstructie kan ondersteunen .czi, tif en ome.tiff formaten. Door de gegevensstructuur van de .czi formaat discontinue datasets nietondersteund zonder pre-processing. Discontinue betekent dat de opname moest worden gestart (bijvoorbeeld de posities door drift van het monster passen). In dit geval moet de .czi bestanden worden opnieuw opgeslagen als .tif. Voor tif-bestanden elke weergave en de verlichting richting moet worden opgeslagen als een apart bestand.

Kalibratie van pixelgrootte

De microscoop-besturingssoftware berekent de kalibratie van het xy pixelgrootte op basis van de geselecteerde doelstelling. Echter, de pixelgrootte in z onafhankelijk bepaald door de stapgrootte. Als een verkeerde doel is opgegeven in de software van de xy tot z ratio is onjuist en de registratie zal mislukken.

Eerste registratie

Na het definiëren van de dataset van het aantal registraties zal zijn 1 en het aantal rente punten zal zijn 0 in de ViewSetup Explorer. De eerste inschrijving geeft de kalibratie van de dataset. Zowel het aantal of registraties en interesse punten zal toenemen tijdens de verwerking.

Onderaan de bemonstering voor de detectie van rente punten

Via downsampling wordt aanbevolen, aangezien het laden van de bestanden en segmentatie zal veel sneller. Het is echter belangrijk om op te merken dat de detectie parameters zal veranderen, afhankelijk van de bemonstering, waardoor detectie-instellingen overbrengen tussen verschillende neer monster instellingen is niet mogelijk.

Detectie van rente punten

Het is raadzaam om segment zoveel echte parels mogelijk in elke weergave, zelfs bij de prijs van het verkrijgen van een aantal vals-positieve detecties, omdat zij de inschrijving niet wezenlijk niet hinderen. Onechte detecties, als klein in aantal, zijn uitgesloten tijdens de registratie (zie Registratie van rente punten). Echter, massieve vals positieve detecties vormen een probleem voor het algoritme. Het vermindert niet alleen prestaties voor de detectie ende registratie, want het duurt veel langer om het segment van de afbeelding alsmede vergelijken deze kralen tussen het uitzicht, maar het vermindert ook de nauwkeurigheid van de registratie. Dit kan worden aangepakt door strengere detectieparameters. Bovendien, op segmentatie van de kralen (dwz meerdere detecties op een kraal Figuur 1E) nadelig is voor de registratie en moet worden vermeden.

Registratie van de rente punten

Naar de standpunten op elkaar te registreren, wordt de locatie van elke kraal in elke weergave beschreven door zijn positie ten opzichte van de drie dichtstbijzijnde naburige kralen. Deze sterrenbeelden zijn de vorming van een lokale geometrische descriptor en laat het vergelijken van elke kraal tussen de standpunten. Kralen met bijpassende tem tussen twee visies worden dan beschouwd als kandidaat-correspondenties. Merk op dat dit alleen werkt voor willekeurig verdeeld kralen, waarbij de lokale descriptoren typisch uniek voor elke kraal.Men kan andere structuren gebruiken, zoals kernen in het monster voor registratie. Echter, om kernen, die niet willekeurig verdeeld in het monster detecteren, andere methoden toepassen 20,21.

De kandidaat correspondenties worden vervolgens getoetst aan RANSAC 36 om valse positieven te sluiten. Elke correspondentie suggereert een transformatie model voor het bedekken van het uitzicht op elkaar. True correspondenties zou waarschijnlijk het eens over een transformatie model, terwijl uitschieters zou elk punt naar een ander. De ware overeenkomsten worden vervolgens gebruikt om een ​​affiene transformatie model tussen de twee vergeleken uitzicht berekenen. Een globale optimalisatie met een iteratieve optimalisatie algoritme wordt dan uitgevoerd, waarbij alle uitzicht op het eerste zicht, met als doel een minimale verplaatsing tussen de standpunten 20,21 zijn geregistreerd.

Time-lapse registratie

Door verplaatsenling van de agarose en onnauwkeurig motoriek van de microscoop podium, de positie van elke stapel matig varieert in de tijd. Overwegende dat de registratie van de individuele tijdstip het verschil tussen de standpunten van dit tijdstip verwijdert, de time-lapse moet ook in zijn geheel te worden geregistreerd. Hiertoe wordt elke afzonderlijke tijdstip geregistreerd op het referentietijdstip.

Referentie tijdstip

Als een tijdreeks met verschillende tijdstippen wordt verwerkt, wordt een representatief tijdstip als referentielijnen gewoonlijk vanuit het midden van de tijdreeks omdat de kraal siteiten tijd versleten door bleken. Op deze referentie kunnen de parameters voor rente punt detectie, registratie, inbinden en fusie worden bepaald. Deze parameters worden dan toegepast op het hele tijdsverloop een specifiek transformatiemodel voor elk tijdstip te berekenen. Tijdens de time-lapse registratie alle andere tijdstippen zijn ook regEred ruimtelijk op deze referentie tijdstip. Dus het selectiekader parameters voor de gehele opname zijn afhankelijk van deze specifieke tijdstip.

multichannel registratie

Wanneer beeldvorming meerdere kanalen, idealiter dezelfde fluorescerende kralen moeten zichtbaar in alle afgebeelde kanalen. De detectie en registratie kan dan worden uitgevoerd op elk kanaal afzonderlijk, waarbij de invloed van de verschillende golflengtes van het licht op de omzetting rekening houdt. Vaak is dit niet mogelijk, omdat de korrels niet zichtbaar in alle kanalen of kralen domineren het beeld te veel in één kanaal en zijn te zwak in het andere kanaal (s). De typische oplossing is om kralen zichtbaar is uitsluitend te gebruiken in een kanaal voor de detectie en registratie en de verworven transformatie model (dat wil zeggen na detectie, registratie en time-lapse registratie), dan wordt toegepast op de andere kanalen door Fiji> Plugins> Multiview Reconstruction> Batch Processing> Extra> Duplicate Transformations. In het drop down menu voor Toepassen transformatie van Selecteer één kanaal naar andere kanalen. In het volgende venster selecteert u de XML en klik op OK. Selecteer vervolgens het kanaal dat de kralen bevat als Bronkanaal en zoals Target kanaal van de zender (s) zonder kralen. Voor Duplicate die transformaties gebruiken Vervang alle transformaties en druk op OK. De transformaties worden dan gekopieerd naar alle andere kanalen en opgeslagen in de XML. Om de nieuwe veranderingen in de ViewSetup Explorer te zien, start u de MultiView Wederopbouw Application.

selectiekader

De fusie van meerdere weergaven rekenkundig zeer intensief. Echter worden grote afbeeldingen meestal verkregen niet alleen het monster, maar ook de kralen om hierop in. Zodra de registratie parameters worden uit de kralen, ze niet meer bruikbaar zijn als deel van het beeld. Daarom, om de efficiëntie van de fusie te vergroten, worden alleen de gedeelten van de afbeeldingsstapels met het monster samen te smelten. Een regio van belang (bounding box) moet worden gedefinieerd om het monster te bevatten en zo weinig van de omringende agarose mogelijk. Voor het voorbeeld in figuur 2 een gewogen gemiddelde fusie op het gehele volume met 2229 × 2136 × 2106 px 38.196 MB RAM nodig zou zijn, terwijl bij een selectiekader het volume is gereduceerd tot 1634 × 1746 × 1632 px en de herinnering eisen worden verminderd tot 17.729 MB.

Content-based MultiView fusion

De uitdaging in het fuseren van multiview gegevens is dat het uitzicht meestal eindigen abrupt en hebben niet dezelfde beeldkwaliteit voor dezelfde voxels bevatten. Eenvoudige middeling van het uitzicht zou dus leiden tot het mengen van artefacten en onnodige beeld degradatie. Content-based MultiView fu sie neemt beide problemen rekening. Ten eerste, mengt de verschillende aanzichten, waarbij een beeld eindigt en de andere begint en anderzijds het DG de lokale beeldkwaliteit en geeft hogere gewichten hogere beeldkwaliteit in het fusie-21. Vergeleken met één beeld is een verbetering van de resolutie z met een lichte verslechtering van het signaal in xy (figuur 2E-H, Figuur 5A-D).

Multiview deconvolutie

Multiview deconvolutie is een andere benadering van de fusie van het uitzicht te bereiken. Met deze methode ook de PSF's van de verschillende standpunten in aanmerking worden genomen om het beeld dat is convolved door de optiek van de microscoop te herstellen. Deze methode verbetert drastisch de beeldkwaliteit door het verwijderen van beeldonscherpte en het verhogen van de resolutie en het contrast van het signaal 31 (figuur 2C-D, Figuur 2I-J, figuur 5E-G, Movie 3).

ve_content "> Deconvolutie rekenkundig zeer intensief (zie tabel 1), waardoor het gebruik van een GPU voor de verwerking verhoogt de snelheid van dit proces. Het kan ook nodig zijn om de deconvolutie uitvoeren naar beneden bemonsterde gegevens. Om af te monster, gebruiken Fiji> Multiview Wederopbouw > Batch verwerking> Extra> Breng Transformations. Dit zal een nieuwe transformatie model toe te passen op de standpunten die in het XML-bestand wordt opgeslagen.

Hdf5 bestandsformaat voor BigDataViewer en BigDataServer

De BigDataViewer 33 maakt een eenvoudige visualisatie van terabyte-sized data. Hoe de BigDataViewer controle is samengevat in tabel 2. Een screencast van de fundamentele werking van het programma is ook beschikbaar als een aanvulling in de oorspronkelijke publicatie 33. De BigDataViewer is gericht op een XML-bestand, waarbij de metadata bevat, en een hdf5 bestand, dat de beeldgegevens bevat. De beeldgegevens zijn present in de hdf5 in verschillende resolutie niveaus in 3D-blokken. De meervoudige resolutie niveaus zorgen voor het visualiseren van de gegevens sneller met een lagere resolutie, voor de volledige resolutie is geladen. Individuele blokken worden alleen in het geheugen geladen wanneer nodig. Zo is het beeld hdf5 formaat maakt directe en snelle visualisatie van de gegevens via het BigDataViewer 33. Het versnelt ook verwerken aangezien het laden van de bestanden efficiënter plaatsvindt. Daarom raden we opnieuw op te slaan van de dataset in dit formaat, hoewel het niet strikt noodzakelijk is voor de verwerking. Voor nadere toelichting op de dataformaat, verwijzen wij u naar Link 3 . Daarnaast kan de datasets worden gedeeld met medewerkers of het publiek met behulp van de BigDataServer 33 ( Link 6 ).

effect
sleutel
F1 toont de Help met een korte beschrijving van de BigDataViewer en de basiswerking
<> Of muiswiel beweging in de z
pijl omhoog en omlaag in- en uitzoomen
klik met de rechtermuisknop en slepen beweegt monster in de kijker
links klikken en slepen roteert monster rond de cursor
schuifknop aan de onderkant van de kijker of Tab en pijl links of rechts beweegt op tijd as
Daarnaast drukken shift snellere beweging of rotatie langs elke as
x en dan links en pijl naar rechts draait rond de x-as
y en dan links en pijl naar rechts draait rond de y-as
z en dan links en pijl naar rechts draait rond de z-as
shift en x oriënteert het uitzicht langs de x-as
shift en y oriënteert het uitzicht langs de y-as
shift en z oriënteert het uitzicht langs de z-as
ik schakelt tussen de verschillende interpolatie modi (dwz de dichtstbijzijnde buren en trilineaire)
s of Instellingen> Helderheid en contrast wijzigt de kleur van de kanalen, helderheid en contrast
F6 of Instellingen> Zichtbaarheid en groeperen verandert de weergegeven groepen, stelt groepering te overlappen verschillende groepen en het aanroepen van de groepen via de cijfertoetsen
F10 of Extra> Record Movie verkrijgt een tijdreeks van de momenteel weergegeven slice

Tabel 2: Big Data Viewer.

3. Beperkingen van de beschreven uitvoering van LSFM

low throughput

In een typisch LSFM experiment slechts één monster per experiment wordt afgebeeld. Nog steeds, in onze ervaring, een veel nuttige informatie kan worden gewonnen uit dat enkel monster. Hoge doorvoer beeldvorming van meerdere embryo is recentelijk op zelfgebouwde LSFM setups 46-48, hoewel gewoonlijk ten koste van vrijheid monster positionering en rotatie.

Onvoldoende penetratie diep in de weefsels

Terwijl zebravis embryo doorschijnend, wordt de verkregen beeldkwaliteit verslechtert snel bij beeldvorming dieper in het weefsel door verstrooiing en absorptie. Gedeeltelijk is dit een gevolg van verstrooiing en absorptie van de uitgestraalde fluorescentie van het monster en kan in de huidige opstelling worden gecorrigeerd. Een andere bron van ongelijke beeldkwaliteit onregelmatige verlichting. THij licht sheet invalt vanaf de linker- of rechterkant en voorwerpen in zijn pad breken het, wat resulteert in een streep artefacten en onscherpte. De dubbelzijdige verlichting en multiview fusie kan de artefacten in het uiteindelijke beeld te verminderen. Tenslotte de beeldkwaliteit is meestal iets slechter aan de rand van het gezichtsveld het gevolg zijn van de natuurlijke geometrie van het licht plaat, die steeds dikker naar de randen.

Limited chemische manipulatie

Het gebruik van drugs of remmers is wijdverbreid in de zebravis onderzoek. In deze microscoop drugsgebruik is beperkt vanwege het grote volume van de monsterkamer en overwegingen van gebruikers van het instrument, die de kamer delen. Met behulp van een extra kamer gewijd aan drugs experimenten kan dit probleem op te lossen. Vullen van de kamer gedeeltelijk met glaskralen vermindert de hoeveelheid vloeistof die nodig is.

geen photomanipulation

CurrenTLY is er geen mogelijkheid van gelokaliseerde optische manipulatie zoals photoconversion, of laser ablatie in deze microscoop. Toch kan zelfgebouwde opstellingen worden gebruikt voor dergelijke specifieke toepassingen.

4. Betekenis en toekomstige toepassingen

LSFM is de beste methode beschikbaar zijn tot op heden voor een snelle beeldvorming van grote volumes van levende embryo's. Meeste experimenten denkbaar op een confocale microscoop kan ook worden uitgevoerd op een lichtwaaier microscoop met bovengenoemde voordelen. Bij beeldvorming van oogontwikkeling, de snelheid van LSFM niet de cruciale parameter. In plaats daarvan, de lage fototoxiciteit en de flexibiliteit in de steekproef van de positionering zijn de doorslaggevende voordelen.

De LSFM data een hoge SNR, die helpt om goede resultaten te behalen en deconvolutie is ook gunstig voor automatische beeldanalyse en object tracking. Tot slot, LSFM is een geweldig hulpmiddel voor het genereren van kwantificeerbare gegevens over de embryonale ontwikkeling en Overall cel en kenmerken weefsel voor latere modellering en fysische beschrijvingen van de processen betrokken.

Disclosures

Publicatie van deze video-artikel wordt ondersteund door Zeiss.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose Roth 6351.1
Low melting point agarose Sigma A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) Sigma E10521
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 Millipore (Estapor) 80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries Brand 701904 sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries Brand 701932 sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55 Dumont 0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes Becton Dickinson 300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes Becton Dickinson 397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer http://fiji.sc/BigDataServer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (5), 327-339 (2014).
  2. Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49, (7), 555-569 (2011).
  3. Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340, (6137), 1234168-1234168 (2013).
  4. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
  6. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6, (11-12), 920-928 (2012).
  7. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12, (1), 23-26 (2015).
  8. Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998-1257998 (2014).
  9. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  10. Pampaloni, F., Chang, B. -J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360, (1), 129-141 (2015).
  11. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. Elsevier Inc. 193-215 (2014).
  12. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, (11), 2361-2361 (2014).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  14. Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68, (2), 377-385 (2011).
  15. Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2010).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  17. Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (43), 17708-17713 (2011).
  18. Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. 028308 (2015).
  19. Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11, (9), 951-958 (2014).
  20. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7, (6), 418-419 (2010).
  21. Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12, (1), 30-34 (2015).
  23. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (10), (2011).
  24. Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. (2013).
  25. Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. 1-11 (2013).
  26. Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 598-599 (2013).
  27. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10, (7), 599-600 (2013).
  28. Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136, (13), 2165-2175 (2009).
  29. Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32, (2), 203-219 (2015).
  30. Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
  31. Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11, (6), 645-648 (2014).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, (7), 676-682 (2012).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12, (6), 481-483 (2015).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. BMVA Press. 23.1-23.10 (2002).
  35. Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9, (7), 717-720 (2012).
  36. Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24, (6), 381-395 (1981).
  37. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, (1), 2 (2006).
  38. Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23, (7), 2655-2664 (2003).
  39. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
  40. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, (22), 4406-4414 (2014).
  41. Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9, (3), 575-585 (2014).
  42. Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
  43. Schmied, C., Steinbach, P., Pietzsch, T., Preibisch, S., Tomancak, P. An automated workflow for parallel processing of large multiview SPIM recordings. Available from: http://arxiv.org/abs/1507.08575 (2015).
  44. Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10, (11), 1679-1696 (2015).
  45. Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
  46. Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6, (11), 4447-4456 (2015).
  47. McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23, (12), 16142-16153 (2015).
  48. Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5, (6), e01751-14-8 (2014).

Comments

1 Comment

  1. How to find the distances

    1. between the illumination objective and sample
    2. between the detective objective and sample

    There is a maximum and a minimum image distance for Gaussian beam, how to find that one?

    Thank you.

    Reply
    Posted by: Nava S.
    April 16, 2019 - 9:12 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics