Undersøgelse af Supramolekylær Organisationen af ​​photosynthetic Membraner inden Freeze-brækkede Leaf Væv af Cryo-scanning Electron Microscopy

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cryo-scanning elektronmikroskopi (SEM) af fryse-brud prøver giver undersøgelse af biologiske strukturer på nær native betingelser. Her beskriver vi en teknik til undersøgelse af supramolekylær ordning af fotosyntetiske (thylakoid) membraner inden bladprøver. Dette opnås ved højt tryk indefrysning af bladvæv, fryse-frakturering, double-layer belægning og endelig cryo-SEM billeddannelse. Anvendelse af dobbelt-lags belægning metode gør det muligt at erhverve stor forstørrelse (> 100,000X) billeder med minimal stråle skade på de frosne hydreret prøver samt minimal opladning effekter. Ved hjælp af de beskrevne procedurer, vi undersøgte ændringerne i supramolekylære fordeling af fotosystem og lys høst antenne proteinkomplekser, der finder sted i løbet af dehydrering af opstandelsen plante Craterostigma pumilum, in situ.

Introduction

Oxygen fotosyntese, med oprindelse i det gamle cyanobakterier, blev arvet af alger og landplanter ved endosymbiotic begivenheder, der førte til udviklingen af ​​kloroplast organel. I alle nutidens oxy- fototrofer, er fotosyntetiske elektrontransport og generering af proton-drivende kraft og reducere magt udføres inden flade sac-lignende vesikler betegnes "thylakoid" membraner. Disse membraner huse de proteinkomplekser, der udfører de lys-drevne reaktioner af fotosyntese og tilvejebringer et medium for energi transduktion. De thylakoid membraner af planter og (nogle) alger er differentieret i to forskellige morfologiske domæner: tæt tiltrykt membran regioner kaldet »grana« og stakkede membraner, der forbinder den grana, kaldet 'stroma lameller »1. Forskellige fryse-fraktur studier af planter og alger thylakoid membraner er blevet udført, starter i begyndelsen af ​​1970'erne. Når fryse-brækket, membraneropdelt langs deres hydrofobe kerne 2 generering af en exoplasmic flade (EF) og en protoplasmisk flade (PF), afhængigt af det cellulære rum, som de halvt membran grænser, som oprindeligt opfundet af Branton et al. . i 1975 tre Plant og alger thylakoider har fire forskellige brudfladerne: elementærfiler, EFU, PF og PFU, med 's' og 'U' betegner 'stablet' og 'stakkede "membran regioner, henholdsvis. Membranproteinet komplekser, som spaltede eller knuste, har tendens til at forblive med enten E eller P side af membranen. De første observationer, at de forskellige fraktur ansigter thylakoider indeholder partikler af forskellige størrelser og tætheder 4, og de ​​mange undersøgelser, der fulgte, førte til identifikation og sammenhæng mellem de observerede partikler og membran protein komplekser, der udfører de lette reaktioner 5-13 (se også Bedømmelser 14,15).

FreEze-fraktur eksperimenter thylakoid membraner typisk udført på præparater af kloroplaster eller isolerede thylakoid membraner (men se 16,17), med risiko for enhver ændring i strukturel og / eller supramolekylær organisation, der kan forekomme under isolation procedure. Efter fraktur, er kopier fremstillet ved afdampning af platin / carbon (Pt / C), derefter med et tykt lag af carbon (C), og endelig spaltning af det biologiske materiale 18. Replikaer visualiseres ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). Den traditionelle fryse-fraktur-replica teknik fortsætter med at tjene som et vigtigt redskab til at studere den supramolekylære organisering af fotosyntetiske membraner og deres tilpasning til forskellige, f.eks., Lys, betingelser 19-23.

I vores seneste undersøgelse af homoiochlorophyllous opstandelse plante Craterostigma pumilum 24, vi havde til formål at undersøge ændringer i supramolekylær organisation of thylakoid membraner, såvel som i den samlede cellulære organisation, under dehydrering og rehydrering. Det unikke ved homoiochlorophyllous opstandelse arter er, at de er i stand til at overleve betingelserne for udtørring i deres vegetative væv (blade), samtidig beholder deres fotosyntetiske apparat. Når vand er til rådighed, disse planter genvinde og genoptage fotosyntetiske aktivitet inden for timer til et par dage 25. Til denne undersøgelse blev cryo-scanning EM (SEM) billeddannelse af fryse-brud bladprøver kombineret med højtryks-frysning for prøve kryo-immobilisering. Disse procedurer giver et middel til at visualisere frosne-hydreret biologiske prøver ved en tilstand tæt på deres oprindelige tilstand 26. En af de største fordel er, at prøverne undersøges direkte efter fryse-fraktur og belægning uden successive trin. Dette er særligt relevant for undersøgelsen af ​​planter på forskellige relative vandindhold (RWC), som er fastholdt deres hydrering tilstand under forberedelse. Hvordannogensinde, en kritisk ulempe er, at frosne-hydreret prøver kan lide af stråle skader under billeddannelse, især når scannet ved høje forstørrelser, der er nødvendige til nøjagtig måling af størrelsen af ​​fotosyntetiske komplekser. For at overvinde dette, en metode kaldet "double-layer belægning" (DLC) 27,28 kombineret med specifikke cryo-SEM imaging betingelser var udnyttet. Disse resulterede i prøver, der er betydeligt mindre stråle-følsomme og tilladt til belysning af værdifulde oplysninger om fotosyntetiske protein supramolekylær organisation og andre cellulære bestanddele af opstandelsen plante C. pumilum ved store forstørrelser in situ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cryo-fiksering af Leaf væv ved Højtryk Indefrysning

Bemærk: Dette afsnit beskriver, hvordan du udfører højtryks-frysning af bladvæv for en fryse-fraktur eksperiment. For hensynet til plante- prøver se 29. Dette kan tilpasses til andre typer af væv eller prøver med nogle ændringer.

  1. Brug af hjørnet af et barberblad, ridse bunden af 0,1 mm hulrum af en 0,1 / 0,2 mm aluminium blodplader (figur 1). Forbered mindst en halv snes blodplader (6 prøver). Tage forsigtighed ikke at skabe kniv mærker på omkredsen af ​​disken.
    1. Efter skrabe, vaske diske i absolut ethanol, lad dem tørre og holde på et rent fad.
  2. Forbered højtryks frysning maskine ifølge producentens anvisninger. Fyld højtryks frysning maskinens alkohol kammer med isopropanol.
  3. Forbered en hjemmelavet vakuum-assisteret infiltration anordning til at erstatte gas, der findes i bladvæv med væske.
    1. Tæt tilslutte en 200 pi pipettespids til slutningen af ​​en 10 ml sprøjte. Afbrød ~ 1 cm af spidsen. Lav et hul i låget af en 1,5 ml mikrocentrifugerør til stramt passer snittet spids. Vakuum kan skabes inde i røret ved at trække stemplet af sprøjten.
  4. Skær et lille stykke blad fra planten under anvendelse af et barberblad og med en pincet placere bladet inde i et mikrocentrifugerør halvt fyldt med 1-hexadecen. Infiltrere de intercellulære rum i bladet med væsken ved at trække stemplet til at skabe vakuum blidt, holde i ca 30 sek, og derefter slippe langsomt stemplet.
  5. Fjern bladet stykke fra røret med en pincet. Trim bladet med et barberblad, hvis det er tykkere end 0,2 mm og skære et lille stykke, der vil passe ind i en blodplader.
  6. Placer en ren blodplader med ridset opad i indefrysning maskinens indehaver og derefter placere det afskårne stykke af leAF ind i blodplade. Fyld den resterende plads omkring bladet med 1-hexadecen. Luk sandwich bruge en anden blodplader, med ridser overfor bladet.
  7. Luk og stram holderen og sæt den ind i maskinens kammer. Tryk derefter knappen 'Jet' at fryse (~ 2.100 barer til 300-500 ms), og hurtigt overføre holderen i flydende nitrogen. Fjern forsigtigt frosne sandwich fra holderen ved hjælp af pre-kølet pincet, pas på ikke at bryde sandwich.
    Bemærk: Lukket frosne sandwiches kan være fryse brækkede straks eller opbevares i flydende nitrogen til senere brug. Brug beskyttelsestøj og briller, når du håndterer flydende nitrogen.

2. Freeze-fraktur og Double-layer Coating 27,28

  1. Forbered freeze fraktur maskine til brug, herunder både pistoler til fordampning af platin / carbon (Pt / C) og carbon, ifølge producentens instruktioner. Placer Pt / C pistol ved 45 grader ennd kulstof pistol på 90 grader.
    1. Forprogrammere en coating arrangement med en 2-nm lag af Pt / C (coating rate 0,02-0,04 nm / sek) og en 6-nm lag af carbon (~ 0,1 nm / s).
      1. Indtast opsætningen på fryse-fraktur maskinens skærm. Vælg et brugernummer, hvor belægningen ordningen vil blive gemt.
      2. Vælg Pt / C for "Layer 1 '. Vælg en tidsramme, f.eks., 5 min (for at overskride den nødvendige tid til at fuldføre coating). Brug op-ned-pilene for at definere en tykkelse på 2 nm.
      3. Tryk på knappen "Lag" for at flytte til Layer 2. Gentag trin 2.1.1.2, bortset fra at vælge carbon og definere en tykkelse på 6 nm.
    2. Test og juster gun drift.
      1. Vælg 'Layer 1'. Vælg Pt / C pistol ved at trykke på knappen 'GUN1' og tryk på knappen "ON" på fordampning styreenhed fryse-fraktur maskine. Overvåg fordampning sats og juster den ved hjælp af spænding og emission drejeknapper until nå en hastighed på 0,02 - 0,04 nm / sek. Tryk på 'OFF' for at slukke for Pt / C pistol.
      2. Vælg 'Layer 2'. Gentag 2.1.2.1, bortset fra at vælge 'GUN2 "og justere for en fordampning på ~ 0,1 nm / sek.
  2. Afkøl freeze sprækkesystemets etape til -140 ˚C eller -160 C (for hydrerede eller dehydrerede blade, henholdsvis). Fastgør vakuum kryo transfer shuttle til maskinen og fylde sin kammer med flydende nitrogen. Tryk i den afkølede fryse-fraktur kammer er sædvanligvis mellem 1 - 8 ud x 10 -7 mbar.
  3. Indsæt en fastfrysning frakturering prøveholder (velegnet til 3 mm blodplader) i læsning station. Oversvømme fyldestationen kammer med flydende nitrogen.
  4. Læg to frosne sandwich på holderen én efter én ved hjælp af høj præcision kvalitet pincet. Stram den første sandwich i holderen, og derefter vende holderen over til at kontrollere, at det passer sikkert på plads. Gentag for den anden sandwich.
  5. Detach den afkølede rumfærgen fra freeze fraktur maskinen og tilslut det til fyldestationen. Åbn shuttle ventil, indføre tilbagetrækningskraften armen ind i holderen og lås den på plads. Genindføre armen med holderen i rumfærgen og lukke omskifterventil hjælp knop lastning station. Fastgør shuttle til fryse-fraktur maskine og indføre holderen ind i kammeret med tilbagetrækningskraften arm. Tag shuttle fra maskinen.
  6. Juster freeze fraktur mikrotom kniv til en sådan højde, at det vil banke ned de bedste blodplader af sandwich.
  7. Med den mikrotom kniv, hurtigt bryde sandwich, og derefter straks hæve den op for at undgå forurening af prøverne ved vragrester klamrer til kniven, og drej den afkølede lukkeren over den nyligt udsat flyet for at beskytte prøverne fra mulig forurening med vandmolekyler i kammeret.
  8. Coat prøverne med platin og kul.
    1. Indtast 'Layer 1' på scReen. Tænd for Pt / C pistol ved at trykke på knappen 'GUN1' efterfulgt af knappen 'ON'. Undersøg fordampning sats og når den når 0,02 til 0,04 nm / sek, samtidig udsætte prøverne og tryk på knappen " ', der skal overvåge tykkelsen af ​​det aflejrede lag.
      Bemærk: Gun slukker automatisk, når tykkelsen har nået den forvalgte værdi.
    2. Dæk prøverne med lukkeren, når Pt / C fordampningen er afsluttet.
    3. Tryk på knappen "Lag" for at flytte til "Layer 2 '. Gentag trin 2.8.1 og 2.8.2, med undtagelse af at vælge 'GUN2 «(for carbon) og en fordampningshastighed på ~ 0,1 nm / sek.
  9. Varm freeze sprækkesystemets etape til -120 ˚C.

3. Cryo-scanningselektronmikroskopi

  1. Forbered scanning elektron mikroskop til Cryo arbejde.
    1. Vælg Stage / Stage Initialiser fra hovedmenuen og bekræft.
    2. Vælg Funktioner / Goto Panel, og åbn "Luftsluse 'panel ved at vælge det fra listen. Klik på knappen 'Luk Column Chamber Valve'. Vent mikroskopet kammeret ved at klikke på knappen Vent under fanen 'Vacuum'.
    3. Vælg Funktioner / Goto Panel, og åbn "Stage Points List 'panel. Vælg kryo-exchange position til at flytte scenen til de korrekte koordinater for at acceptere holder prøven. Bemærk: Den "cryo-exchange position" er forudindstillet til at være på linie med positionen af ​​vakuum transfer enhed.
    4. Åbn prøven kammer med en ren par handsker og indsæt cryo-scenen på den vigtigste fase af mikroskopet. Kammeret lukkes, og klik på knappen Pump under den "Vacuum fanen '.
    5. Afkøl mikroskop til -120 C. Fyld mikroskopet Dewar med flydende nitrogen. Aktiver varme funktionen på kryo-transfer styreenhed til -120 ˚C når temperaturen af ​​scenen falder til under -120 C.
  2. AttACH kryo-transfer shuttle til mikroskopet og overføre prøveholderen hjælp tilbagetrækningskraften arm ind i mikroskopet kryo etape (som i trin 2.5). Frigør rumfærgen fra mikroskopet.
  3. Klik på knappen 'Åbn Column Chamber Valve' i Luftsluse Panel.
  4. Flyt forsigtigt prøven indehaveren tæt objektivlinsen (arbejdsafstand 1 - 2 mm) ved hjælp af joysticket. Vælg en 10-um åbning i "Åbninger" Tab. Dobbeltklik på EHT felt i fanen 'Gun'. Indtast 10 (kV) til EHT målet og klik på OK. Klik på fanen bunden EHT og vælg 'EHT On'.
  5. Vælg "InLens 'fra Detektorer rullelisten under fanen" detektorer ". Optimer imaging betingelser (fokus, lysstyrke og kontrast, lyshøjden, astigmatisme) som passende.
  6. Klik på fanen 'Scanning'. Vælg en hurtig scanning ( 'Scan Hastighed = 1', svarende til en opholdstid på 100 ns per pixel) for at minimere stråle skader, ogen "Store opløsning 'af 1.024 x 768 pixels. Vælg 'Linie Gennemsnitlig' i 'Noise Reduction' drop-down listen. Juster værdien af ​​N til 20 - 30 linjer for søgning. Flyt prøven ved hjælp af 'Centre Point' funktion (ved at trykke på kontrol-fanen på tastaturet) for at søge efter regioner med brækkede celler og kloroplaster (figur 2A og 2B).
  7. Anskaf billeder af brækkede grønkorn ved lave forstørrelser (50-70 KX) (Figur 2C og 2D). Brug 'Center Feature "funktion (ved at trykke på kontrol-shift-fanen på tastaturet) for at zoome ind interessante kloroplast brudfladerne og erhverve billeder ved høje forstørrelser (100-200 kX, figur 3 og 4). Brug de samme parametre som i trin 3.6 for erhvervelse billede, men forandring Gennemsnitlig værdi for N> 100 for støjreduktion 30.
    1. Tryk Frys på de vigtigste mikroskop styreenhed eller i fanen 'Scanning' for at stoppe scanning og gembilledet ved at trykke på knappen 'Gem TIFF «.

4. Image Analysis

Bemærk: Dette afsnit beskriver en kort procedure for segmentering af membran-partikler fra fryse-fraktur SEM billeder ved hjælp af open source-pakken Fiji 31. Lignende resultater kan opnås med andre billedanalyse-software.

  1. Åbn billede med Fiji ved at trække billedfilen i de vigtigste programvinduet. Konverter billedet til 8-bit ved at vælge Billede / Type / 8-bit. Vælg billede / Juster / lysstyrke / kontrast og justere efter behov (figur 5A).
  2. Brug af lige linje værktøj, tegne en linje på størrelse med den integrerede billede skala bar. Vælg Analyze / Set Scale. Indtast oplysningerne korrekte skala (Kendt afstand og enhed længde) og klik OK. Gem dette justeres skaleret billede.
  3. Vælg Process / Filtre / Gaussian blur (1,5 nm radius) og klik på OK (figur 5B).
  4. Vælg billede / Juster / Auto Lokal Threshold (ved hjælp af Niblack metoden) og klik på OK (figur 5C).
  5. Vælg Edit / Invert og derefter Proces / Binary / Watershed (figur 5D).
  6. Tegn en kant rundt om området af interesse (ROI) med Freehand Selection værktøjet. Føj markeringen til ROI Manager ved at vælge Rediger / valg / Tilføj til Manager eller ved at klikke på 'T'.
  7. Vælg Rediger / Slet Outside (figur 5E).
  8. Vælg Analyze / Set Målinger, vælge de relevante parametre (f.eks område, fit ellipse).
  9. Vælg Analyze / Analyser Partikler. Indtast et passende interval for størrelsen af ​​partikler og markere 'Vis resultaterne «,» Tilføj til Manager ", og om nødvendigt, den' Udeluk på kanter 'og klik OK. Resultatet er vist i figur 5F.
  10. Åbn den gemte skaleret afbildede fil (trin 4.2). Vælg 'Vis alle' og fravælge "Labels" i ROI Manager. Gennemgå den valgte particles lagt på det originale billede og manuelt tilføje eller fjerne markeringer ved hjælp af "Tilføj" eller "Slet" knapperne på ROI Manager. Ret eventuelle markeringer nødvendige ved hjælp af Freehand Selection værktøjet og 'Opdater' knappen Manager ROI (figur 5G og 5H).
  11. Analyser data ved hjælp af de opnåede målinger. I resultaterne vinduet, klik Resultater / Opsummer at opnå, for eksempel den gennemsnitlige Samarbejdsområde, betyde større og mindre akser partiklerne anført i ROI Manager. Klik Resultater / Distribution, vælge en parameter (såsom Area) og klik på OK for at se et histogram for denne parameter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser cryo-SEM billeder af blodplader indeholder højtryks-frosne, fryse-brækkede Craterostigma pumilum blad stykker. I nogle prøver er store områder af frakturerede celler opnået (figur 1A). I andre forbliver det stykke blad tæt bundet til den øverste skive og bankede off sammen med det (figur 1B). Men selv i det andet tilfælde, nogle blad væv kan blive siddende på kniven riller på blodplader (figur 1B, pilespidser) og en rimelig mængde data kan stadig indsamles af imaging bladenes "rester", forudsat at de var sprunget. Efter en vellykket fraktur er fundet, er lav forstørrelse billeder af celler erhvervet for at identificere områder af interesse, i dette tilfælde kloroplaster (figur 2).

Højere forstørrelse billeder af thylakoid membraner i C. pumilum blade er vist i figurerne 3 og 4. De fire forskellige brudfladerne, elementærfiler, EFU, PF og Pfu, kan skelnes (figur 3). Fotosystem II (PSII), som er den største proteinkompleks fundet i membranerne, er beliggende i begge elementærfiler (grana) og EFU (stroma lameller). Ved hydratiserede betingelser, PSII tæthed er ~ 3 gange højere i elementærfiler end i EFU (~ 1.550 komplekser um -2 vs. ~ 550 komplekser um -2, figur 3). Dette er en basis for at skelne mellem disse to kontinuerlige ansigter. En anden er forskellen i deres baggrund. Mens elementærfiler baggrund forekommer glat, EFU ansigt er ru og indeholder huller, der er spor af fritliggende PSI komplekser, som brud til den komplementære ansigt, PFU 10 (figur 3). Et eksempel for segmentering af PSII komplekser fra elementærfiler flade af thylakoid membran er vist i figur 5.

ove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Under dehydrering af C. pumilum, tætheden af PSII i grana membraner (elementærfiler) aftager gradvist og nåede omtrent halvdelen (~ 700 komplekser um -2 på ~ 15 % RWC, figur 4C) af deres densitet ved hydrerede betingelser (100% RWC, Figur 4A) Især efter yderligere dehydrering, til 5 -. 10% RWC, PSII komplekser organisere sig i rækker og arrays (pile, figur 4D og 4E). for fuldstændig datasæt, se 24. Dannelse af sådanne PSII arrays nødvendiggør, at nogle af deres bundne antenne komplekser, LHCII, løsnes fra PSII. Et eksempel på LHCII komplekser organiseret i rækker i PFS, der ville være et supplement til organiserede PSII komplekser (i elementærfiler ) er vist i figur 4E (pilespids). PSII komplekser i arrayene samt den fritliggende LHCII, sandsynligvis vil være i en fotokemisk standset tilstand, der betjener en foto-beskyttende rolle. Disse strukturelle omlejringer er en del af de mekanismer, der anvendes af opstandelsen planten C. pumilum at beskytte sig i dehydreret tilstand 24.

figur 1
Figur 1. Lav forstørrelse Cryo-SEM Billeder af blodplader med Freeze-brækkede C. pumilum Leaf Pieces. (A) En stor region efter brud celler (stiplet omrids) af en C. pumilum blad. (B) Stykket blad blev slået med den øverste blodplader, men nogle bladvæv forblev fastgjort til kniv mærker nederst blodplader (pilespidser markerer nogle af disse). Regionerne omkring bladet stykker er frosset 1-hexadecen (asterisk). Scale barer:. 200 um Klik her for at se en større version af dette tal.

ent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2. zoomer ind Chloroplaster. (A) En gruppe af brækkede fotosyntetiske (mesophyll) celler (asterisker) af hydreret bladvæv. Det meste af cellevolumen består af et stort centralt vacuole, med alle cytoplasmatiske bestanddele omgiver vacuolen i en smal stribe. (B) To tilstødende brudte celler - cellevæggen (cw) markerer grænsen mellem cellerne. Fem chloroplaster (c) er synlige i billedet, hvoraf kun en er blevet afrevet (fraktureret plan markeret med pilespidsen). (C og D) Eksempler for enlige brækkede kloroplaster fra hydreret (C) og dehydreret (D, ~ 15% relativ vandindhold [RWC]) planter. De små hvide prikker (f.eks pilespidser) er membranproteinet komplekser inden de thylakoid membraner af kloroplast. Bemærk den massive vesikulation surrounding chloroplasten fundet i den dehydrerede blad (D). Scale bars: 10 um (A); 1 um (B); 200 nm (C og D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Supramolekylær Organisationen af thylakoid Membraner inden plantevæv En brækket chloroplast hvor de forskellige thylakoid brudfladerne kan ses:. De exoplasmic brudfladerne (EF) af både stablede (elementærfiler) og stakkede (EFU) membran regioner indeholder fotosystem II (PSII) komplekser; Den protoplasmisk frakturfladen af ​​stablede regioner (PFS) indeholder de perifere lys høst antenne komplekser af PSII, LHCII; Fotosystem I (PSI) og ATP syntase fraktur til protoplasmisk frakturfladen af ​​stakkede regioner (PFU); Cytochrom bs 6 f Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Ændringer i fotosystem II Organization under Dehydrering C. pumilum elementærfiler flader af thylakoid membraner af planter på forskellige RWC: (a) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, og (D og E) 5 - 10%.. Under dehydrering, tætheden af PSII i EFS står gradvist aftager fra ~ 1.500 komplekser um -2 (A) til ~ 700 komplekser um -2 (~ 15% RWC, C). Især på tørre betingelser (5 - 10% RWC), nogle PSII-komplekser organisere sig i rækker og arrays (D og E, pile). Den pilespids (E) markerer PFS ansigt, med LHCII antenne vises at også være organiseret i rækker, i mellem hvilke PSII rækker ville blive fundet i de komplementære elementærfiler. For yderligere oplysninger om disse data se 24. Scale barer:. 100 nm Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Et eksempel for Segmentering af fotosystem II Partikler. Brug af Fiji open source-pakken, protein-komplekser kan segmenteres fra billederne med et par skridt (komplet detaljeret procedure findes i del 4 i afsnittet Protocol). Billeder (A, original billede) er sløret med Gaussisk filter (B); billedet tærsklingsbehandlet anvendelse af en auto lokale threshold værktøj (C); billedet vendes om, og vandskel algoritmen anvendes for at separate genstande fundet i tæt kontakt (D); et område af interesse er valgt, og ydersiden er blokerede (E); partikler (inden for en brugerdefineret størrelsesområde) er valgt at bruge partikelanalysator funktion. Den resulterende maske er vist i (F). Partikler føjes til ROI Manager og overlejret på det oprindelige billede (G) for at kontrollere for fejl eller defekte eller mistede partikler. Listen over ROI'er kan redigeres manuelt, erstatter, slette eller tilføje nye ROI'er, hvad der er relevant. Slutbrugeren redigeret valg vises i (H). Målestok:. 200 nm Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den i dette dokument teknik tillader undersøgelse af fryse-brud membraner i forbindelse med velbevarede højtryks frosset plantevæv ved cryo-scanning elektronmikroskopi. Den største fordel ved anvendelse af disse procedurer er, at prøvefremstilling er rent fysisk; ingen trin involverer kemikalier eller dehydrering er nødvendige. Det tillader således studere biologiske strukturer på en nær-native tilstand 26,32. Fordelen ved at bruge bladvæv er, at man kan få oplysninger om den samlede cellulære organisation, samt undersøgelse specifikke membraner, såsom thylakoid membraner, inden for deres oprindelige fysiologiske sammenhæng, dvs. inden kloroplast. En anden fordel, bydende nødvendigt at studere C. pumilum planter på forskellige relative vandindhold (RWC), er, at deres hydrering tilstand ikke ændres under fremstillingen. Dette er i modsætning til at udnytte isolerede chloroplaster eller thylakoid membraner som udgangsmaterialefor en fryse-fraktur eksperiment. I sidstnævnte, man skal også tage hensyn til, at nogle strukturelle og / eller supramolekylære ændringer sandsynligvis finde sted i løbet organel / membran isolation.

Arbejde med plante vævsprøver, som er relativt tyk [> 50 - 100 um, og kan være betydeligt tykkere afhængigt af typen af ​​væv og arter], dikterer anvendelsen af ​​højtryks-frysning (HPF) for prøve forglasning. Anvendelse af højt tryk [2.100 bar], hvor smeltetemperaturen for vand er ca. -22 ° C, påvirker hydrogenbinding netværk af vand, således at det sinker hastigheden af ​​iskrystaldannelse. Derfor er muligheden for at opnå en sintret prøve er høj, selv ved relativt langsomme afkølingshastigheder. HPF er i øjeblikket den eneste metode til rådighed til forglasning af tykke, endnu ikke over 200 um, prøver. Et afgørende skridt for HPF af plantevæv er infiltration af deres intercellulære luftrum med et inaktivt4;. Space filler "inden frysning, for at forhindre vævskollaps under højt tryk (se anmeldelser 29,33) I tilfælde af C. pumilum blade, hvis tykkelse kan være op til 1 mm, bladene også skal trimmes eller fortyndet før HPF.

Væsentlige, kan også anvendes teknikken med replika fremstilling 18 til fryse-brud bladvæv. Men vores erfaring, tilstrækkeligt udbytte af intakte brækkede områder blev ikke opnået, da reproduktioner ofte fragmentere til små stykker. Desuden kan søge efter en specifik region af interesse, såsom kloroplaster være upraktisk inden fragmenteret kopier af plantevæv. Dette er hovedsageligt fordi mesophyll (fotosyntetisk) celler består af et stort centralt vakuole omgivet af en smal strimmel cytoplasmatisk (figur 2A), som omfatter kernen, chloroplaster og alle andre organeller. Således kloroplaster kun udgør en meget lille del af den samlede brækkede områdemesophyll væv. Cryo-SEM billeddannelse af fryse-brud prøver tilbyder en løsning på dette problem, da prøverne direkte visualiseres efter fraktur (og coating / shadowing). Men denne metode lider den begrænsning, at frosne hydreret prøver stråle-følsomme og dermed scanning ved høje forstørrelser lettest skader prøven på første scanning. Double-layer belægning (DLC) 27,28 tilbyder en løsning på dette alvorlige ulempe.

I DLC, er frakturerede prøver overtrækkes på en måde svarende til, hvordan de er for replika forberedelse. Først et tyndt lag - er (1 3 nm) af Pt / C inddampet på prøven, der giver kontrast og ledningsevne. Dette efterfølges af en tykkere (5 - 10 nm), beskyttende lag af carbon. DLC kombineret med en høj accelerationsspænding (10 kV) blev anvendt til at afbilde prøver under anvendelse af reflekteret elektrondetektion (BSE) signal 28. BSE-signalet, der stammer fra platin lag tillader opnå overflade oplysninger gennem kulstofog eventuelt vanddamp forurenende lag, som er næsten transparent for BSE ved høje acceleration spændinger (vandforurening akkumuleres i forsøg, hvor et vakuum-cryo transfer enheden ikke anvendes, og brudfladen udsættes for atmosfæren, selv om dette er for en brøkdel af et sekund). Desuden billedbehandling ved hjælp af BSE signal minimeret problemet med opladning virkninger, som er tydelig i sekundær elektron (SE) afsløring 27. Med mikroskopet setup beskrives her, billedbehandling af SE signal med In-linse SE detektor ved 10 kV gav oplysninger, der svarer til den, der opnås, når prøverne kun er belagt med 2 - 3 i nm af Pt / C og afbildet ved lav accelererende spændinger. Forskellen er, at prøver udarbejdet af DLC og afbildet som beskrevet var betydeligt mindre stråle-følsomme. Dette gjorde det muligt at scanne dem ved store forstørrelser og i mange tilfælde endda flere gange, og tillod at få værdifulde oplysninger om fotosyntetiske protein supramolecular organisation og andre cellulære bestanddele (figur 2 - 4) 24.

Endelig kan her beskrevne procedurer modificeres til at studere strukturen og / eller membranprotein organisation i andre typer prøver. Vi har med succes anvendt teknikken til at studere supramolekylær ordning af fotosyntetiske membraner i cyanobakterielle og algeceller (Shperberg-Avni et al. Upublicerede data). Den største overvejelse er at finde balancen mellem at have så tynd en prøve som muligt, for at øge chancen for forglasning, samtidig med at prøve intakthed. For forskellige typer prøver, som kan være suspensioner eller dyre- / plantevæv, bør forskellige emballager anvendes (fx i form af den type blodplader anvendes til højtryks-frysning). Når vellykket cryo-immobilisering opnås, at kombinationen af ​​fryse-fraktur, DLC og cryo-SEM billedbehandling giver et glimrende middel til at opnå oplysninger om membranprotein organisation ved stor forstørrelse med minimal stråle skader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi takker Andres KAECH (Zürich Universitet) for hans gode råd om scanning elektronmikroskopi billeddannelse. Dette arbejde blev støttet af Forsknings- og Udviklingsfond USA-Israel Binational Landbruget (bevilge nr. US-4334-10, ZR), Israel Science Foundation (bevilge nr. 1034/12, ZR), og Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). De elektron mikroskopi blev udført på Irving og Cherna Moskowitz Center for Nano og Bio-Nano Imaging på Weizmann Institute of Science.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol abs Bio-Lab 052505
Isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 Platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
Cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
Cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
Image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26, (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55, (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190, (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48, (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31, (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71, (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592, (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546, (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68, (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44, (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59, (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851, (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70, (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76, (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70, (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178, (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13, (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46, (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23, (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43, (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69, (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167, (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1, (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. Springer. New York. 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19, (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184, (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics