肾毒素显微注射斑马鱼到模型急性肾损伤
July 17th, 2016
从肾毒素，其中包括药品，从抗生素对化疗药物产生的肾损伤，可导致复杂的疾病，其发病机制尚未完全清楚。这个协议演示斑马鱼如何可以用于这些条件下，它可以被应用到的肾脏保护措施的识别疾病建模。
该方案的总体目标是使用斑马鱼观察庆大霉素或顺铂等肾毒素对急性肾损伤的影响。该技术的主要优点是斑马鱼模型能够对急性肾损伤后的细胞损伤和再生进行实时成像。要开始此程序，请准备一个胚胎作工具，通过在 5 英寸直解剖针的末端连接凝胶加载尖端来定位胚胎以进行显微注射，并用胶带或强力胶固定。
接下来，通过使用移液管拉拔器拉动带有细丝的火焰抛光硼硅酸盐玻璃，准备一些细锥形的微注射针。然后，使用剃须刀片或细镊子边缘切割针尖，以创建锋利的棱角分明的注射尖端。随后，将针头放在培养皿中的造型粘土条上，以保护针尖。
为了制作微量注射托盘，通过在微波炉中用 E3 溶解琼脂糖，在 100 毫升锥形瓶中制备 1.5% 琼脂糖 E3 溶液。然后，让混合物在室温下冷却约 10 分钟。将冷却的琼脂糖 E3 溶液倒入培养皿中，制成深度约为 0.5 厘米的基础。
凝固后，倒入第二层琼脂糖 E3 溶液。然后，将预制的胚胎孔模具以一定角度插入琼脂中，以避免任何气泡，并让琼脂糖在室温下凝固。整个微型注射托盘凝固后，缓慢而小心地将预制的胚胎孔模具提起，然后用 E3 溶液填充培养皿并在 4 摄氏度下储存。
在此过程中，通过将隔板放入交配室并填充系统水来设置斑马鱼交配箱。接下来，在隔板的每一侧放置一条鱼，使每个交配室包含一条雌鱼和一条雄鱼，并覆盖两个交配室。第二天早上，移除分隔线以启用产卵。
大约 30 分钟后，检查水箱底部是否有任何胚胎。然后，将鱼送回水族箱，并通过将配对水箱中的水通过细金属丝网过滤器工具来收集它们的胚胎。接下来，将过滤器倒置在培养皿上，并用 E3 冲洗以收集胚胎。
随后，将胚胎在 28.5 摄氏度下孵育过夜。当胚胎达到 24 至 26 体节阶段时，倒出大部分 E3 培养基。然后，通过添加 E3 培养基对它们进行去绒毛膜，然后在每皿胚胎中加入 100 微升每毫升 50 毫克的链霉蛋白酶，然后将胚胎在 28 摄氏度下孵育 15 分钟。
15 分钟后，用 E3 填充培养皿，然后轻轻旋转以将绒毛膜从胚胎中去除。然后，倒出 E3 链霉蛋白酶并用 25 毫升新鲜 E3.To 冲洗培养皿以阻止色素沉着的发展，受精后 25 小时用 25 毫升新鲜 E3 PTU 代替 E24。对于持续数天的实验，每天一次用新鲜培养基更换 E3 PTU 溶液，以保持培养皿清洁。
在注射当天，使用适当的载体对照制备所需的肾毒素溶液。涡旋或轻轻混合。然后，检查管的侧面和水柱的顶部，以确保药物溶解在溶液中。
通过将细凝胶加载尖端穿入针头后部，在修剪过的微量注射针头中加入 2 到 3 微升肾毒素，然后用一条胶带垂直悬挂针头，让溶液在重力作用下充满修剪过的针尖。针尖装满后，将加载的针头固定到微型纵器中。将一滴矿物油滴在千分尺载玻片上并注入油中以评估液滴大小，以测试微量注射体积。
接下来，从培养箱中取出胚胎培养皿，并在胚胎培养皿中加入 5 毫升 0.2% 三卡因对其进行麻醉。随后，用移液管将胚胎转移到注射模具中。将每个胚胎纵到模具的不同孔中，将头部放在孔的最深区域，使躯干沿着凹陷休息，尾巴稍微伸出。
现在，将装满的针头插入微型机械手，并将针尖放在胚胎旁边。轻轻地将针头插入尾静脉进行显微注射。该程序最关键的步骤是显微注射。
为确保成功，必须以锐角切割针头，必须小心地将其移动到胚胎旁边的位置。如果注射成功，您应该会看到液体进入循环。肾毒性物质与荧光共轭糊精的共同注射将使研究人员能够在手术后验证注射是否成功。
然后，轻轻地从胚胎中取出针头。将胚胎转移到干净的培养皿中，用新鲜的 E3 PTU 冲洗以去除三卡因。然后，将胚胎孵育至所需的时间点以评估形态，这可以通过在甲基纤维素封固剂中摄影来记录。
或根据需要进行实验分析。请注意，注射后应每 12 至 24 小时评估一次胚胎恢复情况，以确定水肿个体的百分比，这通常表明肾损伤。斑马鱼胚胎的透明度有利于显微注射程序，并且可以通过 24 hpf 的 PTU 化学处理进一步增强，以减少典型实验过程中色素沉着的发展。
在这里，胚胎标本被允许通过 72 hpf 阶段发育，然后进行模拟注射、微量注射生理盐水载体或微量注射每毫升 2.5 毫克庆大霉素。随后在注射后 1 天和 2 天使用立体显微镜的透射照明进行实时观察。与模拟或盐水注射的胚胎相比，只有注射庆大霉素的个体表现出水肿的发展。
在这种情况下，心包水肿表明正常肾功能的消除与先前发表的观察结果一致。按照此程序，可以进行其他方法，例如全安装 C2 杂交，以了解肾毒素暴露后基因表达的变化。
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概述
本协议展示了使用斑马鱼作为研究肾毒素（如庆大霉素和顺铂）引起的肾脏损伤的模型。斑马鱼模型允许对急性肾脏损伤后的细胞损伤和再生进行实时成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 肾脏学
- 药理学
- 模型生物
背景
- 肾毒素引起的肾脏损伤可能导致复杂的疾病。
- 这些疾病的发病机制尚未完全了解。
- 斑马鱼为疾病建模提供了独特的机会。
- 实时成像能力增强了肾脏损伤的研究。
研究目的
- 使用斑马鱼模拟急性肾脏损伤。
- 观察肾毒素对肾功能的影响。
- 识别潜在的保护肾脏措施。
使用的方法
- 准备微注射所需的胚胎操作工具。
- 制作细尖微注射针。
- 定位胚胎进行注射。
- 细胞损伤和再生的实时成像。
主要结果
- 证明了使用斑马鱼进行肾毒素研究的可行性。
- 提供了关于损伤后再生过程的见解。
- 突出了实时成像在研究中的优势。
- 促进了潜在治疗方法的识别。
结论
- 斑马鱼是研究肾毒性的宝贵模型。
- 实时成像可以增强对肾脏损伤机制的理解。
- 这种方法可能导致保护肾脏策略的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Zebrafish models enable real-time visualization of nephrotoxin-induced kidney injury, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. This approach provides predictive confidence by linking compound exposure to quantifiable phenotypic outcomes such as edema formation, facilitating go/no-go decisions in lead optimization. The system’s transparency and genetic tractability allow for scalable screening of nephroprotective candidates, reducing late-stage attrition due to renal toxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking nephrotoxin exposure to observable renal dysfunction phenotypes.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time imaging of cell damage and regeneration processes.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing quantitative, morphology-based readouts of kidney injury severity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible biological systems for compound screening with quantifiable edema endpoints.
- Scalability: Facilitates high-content screening through automated embryo handling and imaging compatibility.
- Translational Continuity: Produces disease-relevant readouts aligned with human AKI pathology, supporting biomarker discovery efforts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Recapitulates conserved nephron structure and function, enabling mechanistic studies of AKI pathways.
- Risk Assessment: Allows longitudinal monitoring of injury and recovery, informing dose-response and safety margin evaluations.
- Mechanistic De-risking: Supports gene expression analysis (e.g., via whole mount C2 hybridization) to clarify molecular mechanisms of nephrotoxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The zebrafish microinjection assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing a bridge between in vitro screening and mammalian models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of nephrotoxin mechanisms and pathway clarification in a vertebrate context.
- Screening: Delivers standardized, quantitative phenotypic outputs (e.g., edema incidence) suitable for hit confirmation and SAR studies.
- Analytics: Provides morphometric and gene expression readouts that support comparative condition analysis and mechanism of action elucidation.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through conserved injury and regeneration phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for renal safety profiling across therapeutic modalities and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nephrotoxin action.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled microinjection and environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of renal liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through translatable, phenotype-based safety profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and phenotypic screening.
- Dependent on microinjection instrumentation, agarose tray preparation, and environmental control systems (e.g., 28.5°C incubation).
- Necessitates standardization across teams for embryo staging, injection accuracy, and edema scoring criteria.
- Adaptation considerations include species-specific nephron variability and the need for orthogonal validation in mammalian systems.
- Practical limitations include embryo throughput constraints and the requirement for specialized training to ensure injection consistency.
