eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
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Immunology and Infection

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Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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Abstract

Die Ätiologie und die Auswirkungen der Exposition des Menschen gegenüber Umwelt Erreger sind von großer Besorgnis weltweit und damit die Fähigkeit, Belichtung und Infektionen mit kostengünstige, High-Throughput-Ansätze unabdingbar wäre zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Entwicklung und Analyse eines bead-based multiplex Immunoassay Lage sind, die Anwesenheit von Antikörpern in menschlichen Speichel an mehrere Pathogene gleichzeitig messen. Saliva ist besonders attraktiv in dieser Anwendung, da sie nicht invasiv ist, billiger und leichter zu erfassen als Serum. Antigene aus Umweltpathogene wurden an carboxylierte Mikrokügelchen (Perlen) und verwendet, um Antikörper in sehr kleinen Volumina von menschlichen Speichelproben zu messen, eine Perlenbasis, Lösungsphasen-Assay. Die Perlen wurden in Verbindung mit Antigenen von Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviren (G I.1 und G II.4) und Hepatitis - A - Virus. Um sicherzustellen, dass die Antigene wurden ausreichend gekoppeltdie Perlen, Kupplung wurde mit biotinyliertem Anti-Spezies Sekundär Nachweis-Antikörper und Streptavidin-R-Phycoerythrin Reporter (SAPE) unter Verwendung von artspezifischen, von Tieren stammenden primären Fänger-Antikörper, gefolgt von einer Inkubation bestätigt. Als Kontrolle nicht-spezifische Bindung zu messen, wurde ein Beadset identisch zu den anderen behandelt, außer es nicht an Antigen gekoppelt wurde. Die antigen-gekoppelt und Kontrollkügelchen wurden dann mit prospektiv gesammelten menschlichen Speichelproben inkubiert, auf einem Hochdurchsatz-Analysator auf den Prinzipien Durchflusszytometrie basierend gemessen von und die Anwesenheit von Antikörpern gegen jedes Antigen wurde in mittlere Fluoreszenzintensitätseinheiten (MFI), gemessen . Dieser Multiplex-Immunoassay hat eine Reihe von Vorteilen, mehr Daten mit weniger Probe enthält; reduzierte Kosten und Arbeit; und die Fähigkeit, den Test zu viele Ziele von Interesse anzupassen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Speichel Multiplex-Immunoassay-fähig sein kann vorherigen Belichtungen und Infektionen zu identifizieren, die especia sein kannlly nützlich in Beobachtungsstudien großen menschlichen Populationen beteiligt sind.

Introduction

Eighty-acht Prozent der weltweiten Durchfall-Erkrankungen mit der Exposition des Menschen gegenüber kontaminierten Wasser, unsichere Lebensmittel und schlechte Hygiene / Hygiene verbunden ist, etwa 1,5 Millionen Menschen ums Leben kamen, die meisten davon sind 1 Kinder. Dies ist ein wichtiger Grund zur Besorgnis für Beamte des öffentlichen Gesundheitswesens und politische Entscheidungsträger. In dem Bemühen , mit wässrigen und anderen Umweltkrankheitserreger assoziiert Belichtungen und Krankheiten zu untersuchen, haben wir eine Multiplex - Immunoassay Antikörper in menschlichen Proben 2-4 zu messen. Dieses Verfahren kann auf epidemiologische Studien angewendet werden, die Exposition des Menschen auf diese Erreger zu bestimmen und zu einer besseren immunoprevalence und Incident-Infektionen zu definieren.

Saliva hält erhebliche Versprechen als Alternative für den menschlichen Biomarker-Forschung im Serum. Zu den Vorteilen der Verwendung von Speichel sind die Nicht-Invasivität und einfache Probenentnahme, niedrige Kosten, und die Proben leicht von Kindern 5-7 gesammelt werden kann </ Sup>. Serum und Speichelproben wurden ausgiebig für Antikörper gegen H. studierte pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, parvum Cryptosporidium 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, Hepatitis - Viren A und C 13-14, Noroviren 2-4,15, T. gondii 2-4, Dengue - Virus 16, human immunodeficiency virus (HIV) 17 und Escherichia coli O157: H7 18.

Ein Multiplex-Immunoassays ermöglicht die Analyse von mehreren Analyten gleichzeitig in einem einzigen Probenvolumen und innerhalb eines einzelnen Zyklus oder laufen. Multiplexed Antigene von C. jejuni, T. gondii, H. pylori, Hepatitis - A - Virus und zwei Noroviren wurden verwendet , um menschliche Speichel IgG 2-4 und IgA 3,4 und Plasma - IgG 2,3 Antikörper - Antworten auf diese Erreger zu messen unter Verwendung einesMultiplexen Immunoassay bead-basiert. Wenn sie in Verbindung mit epidemiologischen Studien der Exposition gegenüber Mikroben in Wasser, Boden und Nahrungsmittel verwendet wird, kann die Art des Assay in dieser Studie beschriebenen wertvolle Informationen liefern, das Verständnis von Infektionen durch Pathogene verursacht Umwelt zu verbessern. Außerdem Speichel Antikörper Daten aus solchen Untersuchungen erhalten wird, kann verwendet werden , um die Risikobewertung Modelle 19-22 verbessern.

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Protocol

Zustimmung wurde von der Institutional Review Board erhalten (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) für die Sammlung von stimulierter creviculare Speichelproben von beachgoers bei Boquerón Beach, Puerto Rico, als Teil der Vereinigten Staaten Environmental Protection Agency (US - EPA) Nationale Epidemiologische und die Umweltprüfung von Freizeit (Neear) Wasser Studie 23 zum Schwimmen im Zusammenhang Belichtungen und Krankheiten bewerten. Studienteilnehmer informierten Zustimmung zur Verfügung gestellt und wurden über die Verwendung der Speichelsammelvorrichtung durch geschultes USEPA Auftragnehmer angewiesen. Die Speichelproben wurden auf Eis transportiert und auf den Empfang, wurden sie bei -80 ° C zentrifugiert und gespeichert , wie 4 beschrieben.

1. Bead-Aktivierung

  1. Resuspendieren Beadset Bestände durch Verwirbelung und Beschallen für 20 Sekunden und Transfer ca. 5,0 x 10 6 der Lager - Perlen (400 ul) zu Mikrozentrifugenröhrchen.
    Hinweis: Ter Perlen werden in einer Konzentration von 12,5 x 10 6 Perlen / ml geliefert.
  2. Pellet die Lager Perlen durch bei 10.000 × g für 2 Minuten zentrifugiert.
  3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die pelletierten Perlen in 100 ul destilliertem Wasser (dH 2 O) durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden. Wiederholen Sie Schritt 1.2.
  4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die gewaschenen Perlen in 80 ul 100 mM monobasisches Natriumphosphat, pH 6,2 durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
  5. Unmittelbar vor dem Gebrauch machen eine 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) Lösung , die durch Zugabe von 200 & mgr; l dH 2 O auf 10 mg Sulfo-NHS - Aliquot. Mix von Wirbel.
  6. Fügen Sie 10 & mgr; l der 50 mg / ml Sulfo-NHS an die Kügelchen. Mix von Wirbel.
  7. Unmittelbar vor dem Gebrauch machen eine 50 mg / ml 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimidhydrochlorid (EDC) -Lösung durch Zugabe von 200 & mgr; l destilliertem Wasser (dH 2 O) an die 10 mg EDC aliquoten. Mix von Wirbel.
  8. In 10 ul 50mg / ml EDC-Lösung an die Kügelchen. Mix von Wirbel. Inkubieren der Perlen für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Mischen mit dem Vortex in 10 min Intervallen. Pellet die aktivierte Kügelchen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
  9. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Kügelchen in 250 ul 50 mM 2- [N - Morpholino] ethansulfonsäure (MES), pH 5,0 durch Vortexen und Ultraschall - Behandlung für 20 Sekunden.
  10. Pellet die aktivierte Kügelchen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 1.9 und 1.10.
    Anmerkung: Dies stellt insgesamt zwei Waschungen mit 50 mM MES, pH 5,0.
  12. Resuspendieren der Kügelchen in 100 ul 50 mM MES, pH 5,0 durch Vortexen und Ultraschall-Behandlung für 20 Sekunden.

2. Bead Kupplung

  1. Paar die Antigene zu den Bead - Sets mit den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen.
  2. Fügen Sie jedes Antigen an die aktivierten Perlen und bringen das Gesamtvolumen auf 500 & mgr; l in 50 mM MES, pH-Wert 5,0. Mischen Sie die Antigene eind Perlen durch Wirbel.
  3. Inkubieren der Antigene und Perlen für 2 Stunden unter Mischen durch Rotation (~ 15 Upm) bei Raumtemperatur im Dunkeln. Pellet die gekoppelten Kügelchen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
  4. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Kügelchen in 500 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -bovine Serumalbumin (BSA) -polyoxyethylenesorbitan Monolaurat (Tween-20) -natrium Azid (PBS-TBN) pH 7,4 durch Vortexen und Ultraschall. Pellet die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand.
    Vorsicht: Natriumazid ist eine akut toxische Chemikalie. Es ist fatal, wenn sie verschluckt oder kommt in Kontakt mit der Haut. Staub / Rauch / Gas / Nebel / Dampf oder Aerosol nicht einatmen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PPE) beim Umgang mit und entsorgen in Übereinstimmung mit den entsprechenden Gesetzen.
  5. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS-TBN von Vortexen und Ultraschall-Behandlung für 20 Sekunden.
  6. Pellet die Perlen durch Mikrozentrifugieren bei 10.000 × g für 2 min.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6.
    Anmerkung: Dies stellt insgesamt zwei Waschungen mit PBS-TBN.
  8. Resuspendieren der gewaschenen Kügelchen gekoppelt und in 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% Azid, pH 7,4. Lagern Sie die gekoppelten Kügelchen in einer 2-8 ° C Kühlschrank im Dunkeln.

3. Bead Graf

  1. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:10 der gekoppelten Kügelchen in Wasser oder PBS-Puffer.
  2. Last 10 ul der Wulst Verdünnung auf einem Hämozytometer an der Probeneinleitungspunkt.
  3. Zählen Sie die gesehen Perlen in einem der 4 x 4 Ecke Gitter. Berechnen der Gesamtzahl der gekoppelten Kügelchen mit der folgenden Formel: Count (1 - Ecke von 4 x 4 Gitter) x (1 x 10 & sup4 ; ) x (Verdünnungsfaktor) x Resuspension Volumen in ml.

4. Bestätigung von Antigen Kupplung

  1. Resuspendieren Lager Mischung von Kügelchen gekoppelt Antigene von Interesse durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
  2. Bereiten Sie eine Arbeits Perlen-Mischung durch die gekoppelten Wulst Aktien bis zu einer endgültigen VerdünnungKonzentration von 100 Perlen / ul jeder einzigartige Perle in PBS-1% BSA-Puffer (PBS-1% BSA, pH 7,4) eingestellt.
  3. Bereiten Sie mindestens 7 zweifache serielle Verdünnungen von Anti-Spezies-IgG primärer Antikörper gemäß den Empfehlungen des Herstellers in 96-Well-Rundbodenplatte mit PBS-1% BSA-Puffer.
  4. Vorbefeuchtenden eine separate 8-Well-Säule (8 Zeilen) einer 96-Well-Filterbodenplatte für jedes Antigen Kupplungsbestätigungstest mit 100 ul Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Werden 50 & mgr; l Arbeits bead Mischung (antigen-gekoppelten Kügelchen) zu den vorbefeuchtenden Brunnen.
  5. Zugabe von 50 & mgr; l der Antikörperverdünnungen auf Zeilen 1-7 von jeder Spalte der 96-Well - Filterplatte , und 50 ul PBS-1% BSA - Puffer 8 anstelle des verdünnten Antikörpers zu Zeile als Hintergrundvertiefungen dienen. Mischen Sie mit einem Multi-Kanal-Pipette pipettiert, nach oben und unten 5-mal. Führen Sie die gleiche Prozedur für jedes Antigen-gekoppelte Beadset bestätigt werden.
  6. Zudecken und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubierteratur für 1 h auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei 500 rpm. Überstand entfernen durch Vakuum.
  7. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen 1x. Resuspendieren der Kügelchen in 50 & mgr; l PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
  8. Verdünnter biotinylierter anti-Spezies-spezifischen IgG sekundären Detektionsantikörper zu 16 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
  9. In 50 ul des verdünnten sekundären Antikörper zu jeder Vertiefung durch Auf- und Abpipettieren 5-mal.
  10. Bedecken Filterplatte und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
  11. Resuspendieren der Kügelchen in 50 & mgr; l PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
  12. Verdünnte Streptavidin-R-Phycoerythrin reporter (SAPE) bis 24 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
  13. In 50 ul Reporter in jede Vertiefung und mischen durch Pipettieren auf und ab 5 mal.
  14. CFilterplatte über und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
  15. Resuspendieren Perlen in 100 ul PBS-1% BSA und 50 ul analysieren 29 mit dem Analysator.
    Hinweis: Die Ergebnisse des Wulstes basierten multiplex-Immunoassay gemessen in mittlere Fluoreszenzintensität (MFI). Bezieht sich immer auf die neueste Version der Software-Handbuch, falls vorhanden, Fehler zu vermeiden.

5. Speichel- Multiplex-Immunoassay

  1. Entfernen Sie Speichel aus dem -80 ° C Gefrierschrank und bei Raumtemperatur auftauen.
  2. Resuspendieren Antigen gekoppelt Wulst Aktien durch Wirbel und Beschallung für 20 Sekunden.
  3. Bereiten Sie eine Arbeits Perlen-Mischung durch die gekoppelten Wulst Aktien bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 Perlen Verdünnung / ul jeder einzigartigen Beadset in PBS-1% BSA-Puffer.
  4. Bereiten Sie eine 1: 4-Verdünnung des Speichels with PBS-1% BSA-Puffer in einer 96-Well, Deep-Well-Platte.
  5. Vornässen Filterplatte mit 100 ul Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum.
  6. Werden 50 ul einer Arbeits bead Mischung und ein gleiches Volumen von verdünntem Speichel zu 95 Wells der 96-Well-Filterplatten für eine 1: 8 Endverdünnung. Mischungs Reaktionen mit einem Mehrkanal-Pipettor. Zum einen Steuer gut, fügen Sie 50 ul Antigen-gekoppelten Kügelchen plus 50 ul PBS-1% BSA-Puffer (als Ersatz für Speichel).
  7. Zudecken und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 h auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei 500 rpm inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
  8. Resuspendieren Perlen in 50 ul PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
  9. Verdünnte biotinyliertem Ziege-anti-human IgG sekundären Detektionsantikörper zu 16 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
  10. In 50 ul zu jeder Vertiefung sekundären Antikörper verdünnt und mischen Inhalte mitein Mehrkanal-Pipettor.
  11. Bedecken Filterplatte und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
  12. Resuspendieren Perlen in 50 ul PBS-1% BSA mit einem Mehrkanal-Pipettor.
  13. Verdünnte Streptavidin-R-Phycoerythrin reporter (SAPE) bis 24 & mgr; g / ml in PBS-1% BSA.
  14. In 50 ul Reporter in jede Vertiefung und mischen mit einem Multi-Kanal-Pipette.
  15. Bedecken Filterplatte und lassen Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert. Überstand entfernen durch Vakuum. Waschen Vertiefungen mit 100 & mgr; l Waschpuffer und entfernen Überstand durch Vakuum. Wiederholen Sie waschen 1x.
  16. Resuspendieren Perlen in 100 ul PBS-1% BSA und 50 ul analysieren 29 mit dem Analysator.
    Hinweis: Die Ergebnisse des Multiplex-Immunoassays sind in mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) -Einheiten gemessen. Informieren Sie sich beidie neueste Version der Software-Handbuch, falls vorhanden, Fehler zu vermeiden.

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Representative Results

Eine einzigartige Perle Set wurde als Kontrolle zur Messung der unspezifischen Bindung und Probe Variabilität zu probieren. Diese Kügelchen wurden identisch zu den Antigen gekoppelten Kügelchen mit der Ausnahme behandelt, daß sie nicht mit einem Antigen in der Kopplungsschritt inkubiert. MFI-Werte> 500 von den Kontrollkügelchen mit allen Speichelproben inkubiert erhalten wurden von der weiteren entfernt Analysen aufgrund vermuteter Kontamination von Serum und die restlichen Antworten wurden verteilt log. Der Speichel kann mit Serum verunreinigt werden, wenn das Zahnfleisch zu stark mit dem Schwamm an der Sammelvorrichtung oder der Studienteilnehmer hat Parodontitis gerieben werden. Das Protokoll transformiert wurden MFI-Daten verwendet, um eine immunopositive Abschaltpunkt von 505 MFI berechnet basierend auf dem Mittelwert plus 3 Standardabweichungen der log MFI-Werte. Zusätzlich Antigen-gekoppelte Kügelchen wurden auf spezifische Vertiefungen gegeben, die in jeder Art und Weise außer dil als Testnäpfen behandelt wurdenausgeschüttete Speichel wurde mit PBS-1% BSA ersetzt Hintergrundfluoreszenz und Kreuzreaktivität zu bewerten. Die MFI-Werte in diesen Hintergrund Brunnen erhalten wurden aus den MFI-Werte von jedem Antigen-gekoppelte Beadset für jede Speichelprobe abgezogen.

Bead Kupplung wurde unter Verwendung von Tier abgeleitet artspezifischen primäre Nachweis Antikörper, die spezifisch für jedes Antigen bestätigt. Um sicherzustellen , dass die Antigen gekoppelten Kügelchen der Annäherung an den dynamischen Bereich des Assays der Lage waren, definierten wir die richtige Kopplung als MFI ≥18,000, Beobachtung der Dosis - Wirkungs - und Kreuzreaktivität zwischen primären Antikörpern und nicht-Ziele von <10% als 2 beschrieben . Repräsentative Kupplungsbestätigungen für C. jejuni und T. gondii der Antigene in dem Assay sind in Abbildung 1 dargestellt.

Basierend auf dem Grenzpunkt festgelegt (505 MFI), die immunoprevalence Rates für die Proben (n = 2,078) lag im Bereich von etwa 2% (n = 41) für T. gondii auf fast 50% (n = 1,009) für norovirus GI.1 (Abbildung 2). Die Daten zeigen , dass die immunoprevalence Rate am höchsten war für die Noroviren gefolgt von Hepatitis - A - Virus und H. pylori.

Während 32% (n = 672) der Proben für alle von den Pathogenen in dem Assay immunonegative waren, 68% (n = 1.406) wurden in einen oder mehrere Krankheitserreger immunopositive. 3 zeigt die Verteilung der immunopositivity einem oder mehreren der Pathogene.

Abbildung 1
Abbildung 1: Kupplungsbestätigungsanalysen für zwei der Organismen in dem Multiplex - Immunoassays Kupplungs Bestätigung für alle der Antigene durchgeführt wurde , und die Kurven für C.. jejuni und T. gondii in dieser Figur sind REPREtreter der Kupplungsbestätigungen für die Antigene in den Multiplex - Immunoassay. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Fig . 2: Immunoprevalence auf spezifische Pathogene Immunoprevalence auf spezifische Krankheitserreger in dem Multiplex - Immunoassays lag im Bereich von etwa 2% für T. gondii auf fast 50% für Norovirus GI.1. Antikörper gegen die Norovirus - Antigene wurden mehr beobachtet häufig gefolgt von HAV (Hepatitis A - Virus) und H. pylori. T. gondii und C. jejuni Antikörper erschien weniger häufig in den Speichelproben analysiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen thFigur.

Figur 3
Fig . 3: Aufteilung der immunopositivity an mehrere Pathogene gleichzeitig die Multiplex - Immunoassay ermöglicht die Analyse von immunopositivity auf mehrere Pathogene gleichzeitig in einer 50 & mgr; l Probenvolumen. Fast ein Drittel der Speichelproben getestet wurde immunonegative für Antikörper gegen alle Antigene in den Multiplex. Etwa 31% der Proben war immunopositive für ein Antigen, während ein Viertel auf beiden Antigene positiv war. 9,4% war auf drei Antigene immunopositive. 3% positiv auf vier oder mehr Antigene gleichzeitig. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Antigen Bead Set Kopplungspuffer Ag - Konzentration (ug) Anzahl der Perlen in 1 - Ecke # Von Perlen / ul Vol. 100 B / & mgr ; l für 4 ml (ul)
C. jejuni 8 MES 5.0 50 64 6.400 94
H. pylori 33 MES 5.0 25 71 7100 85
Hepatitis A 42 MES 5.0 100 91 9.100 66
T. gondii 30 MES 5.0 25 85 8.500 71
Norovirus GII.4 55 MES 5.0 5 72 7.200 83
Norovirus GI.1 67 MES 5.0 5 63 6.300 95
Ungekoppelte 80 MES 5.0 60 6000 100
Das Gesamtvolumen der Perlen (ul) 594
Das Gesamtvolumen des Puffers benötigt (ul) 3406

Tabelle 1:. Arbeits Beadgemisch für die Multiplex - Immunoassays Nach der Kupplung und Bestätigung abgeschlossen wurden, ein Master - Mix jeder Perle bestehend wurde gezeigt hergestellt. Der Master-Mix wurde unter einem verteiltenll der Vertiefungen in der 96-Well-Platte. Alle der Vertiefungen wurden mit Speichel mit Ausnahme eines Hintergrundkontrolle, die nur gut inkubiert Perlen und PBS-1% BSA-Puffer enthielt.

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Discussion

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Multiplex-Immunoassay-Verfahren ist nützlich zum Unterscheiden zwischen Speichelproben, die immunopositive oder immunonegative sind. Um zu bestimmen, immunopositivity wurde durch Berechnung der Mittelwert plus drei Standardabweichungen der log transformierten MFI Reaktionen der Steuerung abgekoppelt Perlen eine einzige Grenzpunkt mit all den Speichelproben getestet entwickelt. Der Cut-off-Punkt die Fähigkeit zur Beurteilung der Belichtung und immunoprevalence entweder eine einzelne oder mehrere Krankheitserreger gewährt. Diese Diskriminanzfähigkeit kann nützlich in Bevölkerungsstudien sein Gesundheitsrisiken mit Exposition gegenüber Umwelt und andere Krankheitserreger im Zusammenhang zu untersuchen.

Es gibt einige andere Methoden, die verwendet werden können, einen Cut-off-Punkt zu bestimmen, in Abhängigkeit von der Verteilung der MFIs, abgekoppelt Kontrollen und welche Frage die Studie, ist zu beantworten. Einige Beispiele für die Bestimmung cut-offs sind endliche gemischte Modellierung 24-26, Mittelwert plus 3Standardabweichungen von Antworten auf Kontrollen, plus 2 Standardabweichungen von Antworten auf Kontrollen bedeuten, und dreimal den Mittelwert der Antworten auf Kontrollen 27,28. Für einfache Screenings, weniger strenge Kriterien verwendet werden können, aber für epidemiologische Studien, kann es sinnvoller sein, eine strengere Definition zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit der Berichterstattung Fehlalarme zu reduzieren. Unsere erste Anwendung ist bei immunoconversion und immunoprevalence zwischen Schwimmer und Nichtschwimmer zu suchen. In dieser Studie wurden die entkoppelten Steuer MFIs nicht normalverteilt und die Ergebnisse wurden log transformiert.

Vorteile eines Wulstes basierten multiplex Immunoassay durchführt, umfassen die Verwendung von sehr geringen Probenvolumina, Verringerung der Zeit und Arbeit, und die Fähigkeit, Reaktionen zu messen, für bis zu 500 Analyten gleichzeitig, während eine minimale Menge an Reagenzien erfordert. Im Gegensatz dazu traditionellen Methoden der Antikörperspiegel indikativ Expositions Beurteilung und / oder Infektion (zB

Einschränkungen eines Multiplex-Immunoassays umfassen die Notwendigkeit einer strengen Optimierung der optimalen Konzentrationen von primären und sekundären Erfassung Erkennung Antikörper, Antigene und Reporter zu bestimmen. Kreuzreaktivität ist auch ein wichtiges Anliegen bei Immunoassays als Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen kann mit Antigenen aus anderen Organismen kreuzreagieren und dadurch zu falsch positiven Lesungen. Optimierung, eine Kreuzreaktivität und eine unspezifische Bindung wurden die zuvor 2-4 adressiert. Der Erfolg eines solchen Assays ist weitgehend abhängig von der Fähigkeit, hoch immunogene Antigene zu erhalten, sowie spezifische Antibostirbt an dieser Antigene zur Verwendung in den Wulst Kupplung und Kupplungsbestätigungsschritten. Eine weitere Einschränkung ist die begrenzte Verfügbarkeit charakterisiert (diagnostisch positiv und negativ) Proben, die die Tests zu bestätigen.

Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in dem Protokoll. Dazu gehören: die Antigene zu gewährleisten, die an die Kügelchen gekoppelt werden, enthalten keine Fremdproteine, Azid, Glycin, Tris oder alle primären Amine. Wenn eines dieser Mittel in dem Antigenpräparat vorhanden sind, sollten sie durch Dialyse oder Chromatographie entfernt werden. Es wird empfohlen, dass man mit 5 ug Antigen pro 5 Millionen Perlen beginnen sollte und titriert die optimale Konzentration zu finden. Wählen Sie den optimalen Nachweis der Antikörperkonzentration, die die beste Empfindlichkeit und Dynamik verleiht. Beachten Sie, dass Signale neigen dazu, zu verringern als Antigen und Nachweis-Antikörper-Konzentrationen erhöhen (Hook-Effekt). Zum Beispiel verringert sich, wenn das Signal als Antigenkonzentration erhöht, dann erfassenIonen Antikörper Begrenzungs werden kann. Im Gegensatz dazu kann, wenn die Signale verringern als Nachweis-Antikörper steigt dann Reporter (SAPE) Begrenzung sein. Überprüfen Sie die Multiplex für Kreuzreaktivität durch die optimale Kopplung für jedes Protein Kombinieren (5000 jeder Perle pro Vertiefung festgelegt). Testen Sie die Multiplex-Bead-Sets durch die optimale Erkennung Antikörpermenge kombiniert. der Reporter zu optimieren und eine Standardkurve des Antigens zu machen, indem jedes Antigen einzeln zu testen.

ein Multiplex-Immunoassay Fehlerbehebung Empfindlichkeit zu verbessern und die mittlere Fluoreszenzsignal sind von entscheidender Bedeutung, zu erhöhen. Zur Verbesserung der Empfindlichkeit verringern entweder die Menge an Antigen, die an die Kügelchen oder die Detektionsantikörperkonzentration. Die Verwendung eines Antikörpers mit höherer Affinität für das Einfangen und / oder Detektion kann auch die Empfindlichkeit zu verbessern. Die Erhöhung der Menge des Antigens an die Kügelchen gekoppelt kann die mittlere Fluoreszenzsignals zu erhöhen. Eine Studie zeigte, dass Vorinkubationsgefäß Serumproben mit polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon (PVX) Puffer ist in der Lage in serologischen Assays unspezifische Bindung zu unterdrücken , unter Verwendung der bead-based multiplex Assay 30 wie die , die wir hier beschreiben werden. Jedoch fand eine andere Studie, die von unseren Mitarbeitern keine signifikante Wirkung zwischen PBS-BSA und PVX-Puffer. Sie folgerten weiter , daß aufgrund der höheren Viskosität des PVX - Puffer, es erzeugt Probleme mit bead Akquisition in dem Analysator und gebildete Schaum in die Mikrotitervertiefungen 3.

Zusammenfassend haben wir ein Verfahren vorgestellt, das zur Messung der Anwesenheit von humanem Speichel-IgG-Antikörper gegen mehrere Pathogene gleichzeitig in einem sehr kleinen Probenvolumen kann. In Zukunft wird dieser Test verwendet, um die Anwesenheit von Speichel-Antikörper mit Schwimmen im Zusammenhang mit Forderungen oder Infektionen zu erkennen und zu helfen, Risikobewertungsmodelle informieren. Zusätzlich kann der Assay verwendet werden, um Antikörper mit der Luft und durch Lebensmittel übertragene exposur zu bemessenes, Incident-Infektionen oder immunoconversions bestimmen und kritische immunologische Informationen zu Epidemiologen bieten Fragebogen-Typ Bevölkerung Studien.

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Disclosures

Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung finanziert und verwaltet die Forschung hier beschrieben. Es hat sich Agentur administrative Überprüfung unterzogen und zur Veröffentlichung freigegeben. Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten stellt keine Billigung oder Empfehlung für den Einsatz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

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References

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