Name: Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Messung der Phagosom-Geschwindigkeit in HIV-1-infizierten Makrophagen mittels Spinning-Disk-Konfokal-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung zellulärer Bewegungen in Echtzeit.

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Wir danken Dr. Jamil Jubrail für das Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des CNRS, des Inserm, der Université Paris Descartes, der Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 einschließlich eines Promotionsstipendiums für GLB) und der Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, einschließlich eines Postdoktorandenstipendiums für CD) an die FN unterstützt. A. Dumas wurde durch Promotionsstipendien der Université Paris Descartes und der Sidaction unterstützt.

Das Protokoll muss in strikter Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Gesetzen und örtlichen Vorschriften durchgeführt. Blut von gesunden Spendern, die ihre Zustimmung Blut für Forschungszwecke zu spenden gab wurde von Bluttransfusionszentren erhalten, mit denen die Institutionen Vereinbarung unterzeichnet haben. Besondere Schutzmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn menschliches Blut verwendet wird. Experimente mit HIV-1 muss in einem Biosicherheitsstufe 3 oder 2 (BSL-3 oder 2) Labor nach den örtlichen Vorschriften durchgeführt werden. 1. Herstellung von Human-Monozyten abgeleiteten Makrophagen (hMDMs) durch Dichtegradientenzentrifugation und Auswahl durch Adhesion <ol><li> Beginnen Sie mit frischem Blut von gesunden Spendern (9 ml). Verdünne das gesamte Volumen von frischem Blut mit sterilem 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+ ein Endvolumen von 70 ml zu erhalten , und sanft das verdünnte Blut in zwei 50 ml konische Röhrchen (35 ml pro Röhrchen) hinzuzufügen , oben auf 15 ml eineutral, stark verzweigten, hoher Masse, hydrophile Polysaccharid in Lösung bereits in jedem Röhrchen. </li><li> Zentrifuge beide Rohre von Blut bei 537 xg für 20 min bei 20 ° C ohne Bremse. Dann sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in den bewölkten Zelle Ring an der Schnittstelle enthalten sind, und übertragen sie in eine neue 50 - ml - Röhrchen mit 15 ml 1x PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 218 · g für 5 min bei 20 ° C und das Pellet in 45 ml 1x PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 218 · g für 5 min bei 20 ° C, Resuspendieren des Pellets in 10 ml 1x PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+ und die Zellen zählen , indem zu einer Endverdünnung von 1/200 in Trypan Blau verdünnt. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 218 xg für 5 min bei 20 ° C und das Pellet in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 100 ug / ml Penicillin-Streptomycin 7 x 10 6 PBMCs in 2 ml Medium in jeder Vertiefung einer 6 - Well-Platte pro Vertiefung zu haben. </li><li> Inkubiere die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2 Std. Nach 2 Stunden wird die Monozyten an den Kunststoff eingehalten. </li><li> Damit frisch isolierten Monozyten in hMDMs zu unterscheiden, aspirieren das Medium und ersetzen Sie es mit 2 ml hMDM Medium (RPMI 1640, 10% decomplemented Fetale Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin), ergänzt mit rekombinantes humanes M-CSF (RHM-CSF) in einer Endkonzentration von 10 ng / ml. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 11 Tage (Abbildung 1). </li><li> Am Tag 11 das Medium abgenommen und gewaschen werden 2 mal mit 2 ml kaltem hMDM Medium pro Vertiefung. Weiter waschen jeder Vertiefung 2 mal mit 1 ml kaltem 1x PBS. </li><li> Zum Abnehmen ausdifferenzierten hMDMs, waschen Sie sich gut 1 mal mit 1 ml kaltem 1x PBS mit 2 mM ethylenediaminetetraacetatic Säure (EDTA) und die Zellen in 2 ml kaltem 1x PBS mit 2 mM EDTA pro Vertiefung für 15-60 min bei 4 ° C inkubieren. HINWEIS: Alternative Methoden die Zellen existieren (zB Trypsin oder Trypsin-ähnliche Aktivitäten) zu lösen , die gute Ergebnisse 11 geben könnte. </li><li> Nach Ablösung (wird von sanft bis Pipettieren und nach unten in das Bohrloch), um die Zellen zu sammeln und sie in einem 50-ml-Röhrchen auf Eis 10 ml kaltem hMDM Medium enthält. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 218 · g für 5 min bei 20 ° C, das Pellet in 10 ml kaltem hMDM Medium und die Zellen zählen, indem 1/20 in Trypan Blau verdünnt. </li><li> Seed die Zellen bei 1 x 10 6 hMDMs pro 35 mm Mikroskopie Glasbodenschale und Inkubation der Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 1 Tag. </li></ol> 2. Herstellung und Quantifizierung von HIV-1-Virus Stocks HINWEIS: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (Green Fluorescent Protein) trägt eine R5-trop Umschlag, Geschenk von M. Schindler 10 wird verwendet , Makrophagen zu infizieren und infizierte Zellen in Echtzeit zu sehen. <ol><li> Produzieren viralen Bestände durch Transfektion von humanen embryonalen Nieren 293T Zellen (2 x 10 6 in 100 - mm - Schale) mit 6 ug des entsprechenden provirale DNA Kommerzielle Transfektionsreagenz verwenden. </li><li> Quantifizierung der Infektiosität der Virusstämme mit den Indikatorzellen HeLa TZM-bl (das ß-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des HIV-1 LTR trägt) unter Verwendung von seriellen Verdünnungen der viralen durch eine ß-Galactosidase Färbung der Zellen und das Zählen gefolgt Bestände der blauen Zellen 12. </li></ol> 3. Die Infektion von hMDMs mit HIV-1 <ol><li> Füge das Virus bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,02 bis 0,03 in 1 ml Medium zu hMDM hMDMs (plattierten Zellen in 1,13). Um zu steuern , Brunnen hinzufügen nur 1 ml hMDM Medium und Inkubation das Geschirr bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2 Tage (Abbildung 1). </li><li> Am Tag 2 waschen Sie die Zellen mit hMDM medium 3 Mal und 1 ml frisches hMDM Medium pro Schale. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 6 Tage (Abbildung 1). </li></ol> 4. Opsonisierung von roten Blutkörperchen vom Schaf <ol><li> Zur Herstellung von 7 x 10 6 pro Schale SRBCs, wäscht den SRBCs zweimal in 100 ul Lösung , die 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS mit Zentrifugation bei 600 xg für 4 min enthält. </li><li> Resuspendieren der gewaschenen SRBCs in 500 ul 1x PBS / BSA 0,1% mit Kaninchen-IgG anti-SRBCs bei einer sub-agglutinierende Konzentration pro 5 ul SRBCs und Inkubation für 30 min mit Rotation bei RT. HINWEIS: Um die Unter agglutinierend Konzentration von anti-SRBCs IgG, bereiten serielle Verdünnungen von IgG (Stammkonzentration bei 13,1 mg / ml) von 1/50 bis 1 / 25.600 in 20 &amp; mgr; l in einer 96-Well-Platte bestimmen. In 2 x 10 6 SRBCs in 20 &amp; mgr; l in jede Vertiefung und stellte den Teller in einem dunklen Raum während mehrerer Stunden. Der Teil agglutinierende Konzentration ist dieVerdünnung der gut, kurz bevor die gut mit Agglutination (IgG + SRBCs ein Netzwerk bilden). </li><li> Nach der Drehung Zentrifugation der IgG-opsonisierter-SRBCs bei 600 × g für 4 min und Waschen mit 100 ul 1x PBS / BSA 0,1% mit Zentrifugation bei 600 × g für 4 min. </li><li> Resuspendieren der IgG-opsonisiertes-SRBCs in vorgewärmten Phenolrot-freiem RPMI-Medium mit 2 mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin (1 ml / Schale). </li></ol> 5. Live Cell Videomikroskopie Phagozytose Assay <ol><li> Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems , wie beispielsweise einem Spinnplattensystem mit einer Heizkammer ausgerüstet bei 37 ° C mit CO 2 mit Wasser für die Befeuchtung durch eine Flasche vorbei. </li><li> Schalten Sie die Heizkammer vor dem Experiment das Mikroskoptisch zu haben, bei 37 ° C vor dem Beginn des Phagocytose-Assay. Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und laden Sie die Bildbearbeitungssoftware. </li><li> Optimieren Sie die Imaging-Einstellungen wie Scangeschwindigkeit, magnificatIon, Auflösung usw. mindestens eine Zelle pro Feld zu haben und Bild eine jede Minute zwischen 60 bis 120 min - Rahmen. HINWEIS: Hier wird die Probe ein Rahmen jede Minute während 60 min mit 63X Objektiv abgebildet wird. </li><li> Setzen Sie die Druckschale auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie den Fokus und die Lage zu finden, nur eine ganze HIV-1-infizierten Makrophagen in das Feld ein. Verwenden Sie geeignete Anregungs- / Emissions-Einstellungen auf der Basis des verwendeten Abbildungssystems und der Sonde. Fügen Sie ein helles Feld (BF) Kanal phagosomes (Abbildung 1II) zu beobachten. Optimieren das Aussehen der verschiedenen Kanalbilder, indem der Prozentsatz von durchgelassenem Licht und die Belichtungszeit eingestellt wird. HINWEIS: Hier NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP war begeistert , eine 491 - nm - Laser mit 50 ms Zeitbelichtung mit 20% der Laser (Abbildung 1 i) verwendet wird . </li><li> Nehmen Sie die Bildschale und 1 ml SRBC - Suspension bei 7 x 10 6 SRBCs / ml in die Schale (Abbildung 1). </li><li> Zentrifuge bei 500 × g für2 min bei RT Phagozytose, notieren Sie die Zeit am Ende dieser Zentrifugation und Rück die Schale auf die Bühne zu synchronisieren. </li><li> Optimierung des Fokus und capture GFP und BF Bilder in Z-Stapel (über die Dicke der Zelle mit einem Schritt-Abstand von 0,3 um - in der Regel 20-Ebenen) mindestens 1 Stunde jede Minute für. Speichern Sie die Zeitraffer-Video im nativen Dateiformat des verwendeten Abbildungssystems. HINWEIS: Hier Zeitraffer-Filme im nativen Format gespeichert wurden, * .STK Dateien. </li></ol> 6. Die Analyse der Zeitraffer-Filme <ol><li> Für Videobearbeitung, klicken Sie auf das Dropdown-Menü &quot;Apps&quot; und auf der Registerkarte &quot;Bewertungs Multi Dimensional Data&quot; in der Video-Editing-Software. <ol><li> Um die Datei zu öffnen, klicken Sie auf &quot;Select Base-Datei&quot; und dann auf &quot;Select Directory&quot;. In der &quot;Datensätze&quot; Feld, wählen Sie den Erwerb (in .ND-Format) zu analysieren, und klicken Sie auf &quot;Ansicht&quot;. Die Daten werden in einer Tabelle mit der Zeit in der Spalte ein repräsentiertd Z-Plan in der Leitung. </li><li> Um die Infektion in einer Z-Projektion darstellen (Abbildung 2, links Platten), wählen Sie 491 nm Wellenlänge im &quot;Wavelengths&quot; und klicken Sie auf den &quot;Z Projektion&quot; Tab mit &quot;allen Ebenen&quot;. </li><li> Um eine zeitliche Abfolge analysieren, BF Wellenlänge im &quot;Wavelengths&quot; ein und wählen Sie die optimale Ebene , auf der Z-Achse wählen zu externen SRBCs unterscheiden (Abbildung 2, roten Pfeilspitze), interne SRBCs (Abbildung 2, roter Kreis) und den Kern ( Abbildung 2, blauer Kreis). </li><li> Um die Videomontagen speichern, klicken Sie auf &quot;Auswahl [X]&quot; und dann auf &quot;Load Image (s)&quot;. Schließlich die geladenen Bilder in .tif-Format speichern und Software als nächstes auf ImageJ öffnen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie das Plugin &quot;Manuelle Spur&quot; auf der ImageJ Software die Position des Kerns und die verschiedenen phagosomes in BF Kanal (Abbildung 3) beobachtet zu messen. <ol><li> Download das &quot;Manual-Tracking&quot; Plugin auf der ImageJ Website. Auf ImageJ, öffnen Sie das Plugin und die Bildfolge analysiert werden (Abbildung 3, Schritt 1 und 2). </li><li> Geben Sie die Einstellungen wie &quot;Time Interval&quot; , die zwischen benachbarten Rahmen Höhe der Zeit darstellt und die &quot;x / y - Kalibrierung&quot; , die den Abstand pro Pixel darstellt (Abbildung 3, Schritt 3). HINWEIS: Hier speichern Sie die Bildfolge mit einem Zeitintervall von 1 Minute zwischen jedem Rahmen und x / y Kalibrierung von 0,205 &amp; mgr; m , da die 63X - Zoom und eine Kamera mit Pixelgröße von 6,45 x 6,45 &amp; mgr; m 2 verwendet werden. </li><li> Um die Verfolgung zu starten, klicken Sie auf &quot;Add Track&quot; (Abbildung 3, Schritt 4) und klicken Sie auf ein SRBC Zentrum beim ersten Mal , wenn er internalisiert wird. Das nächste Bild erscheint automatisch. </li><li> Weiter auf der SRBC - Center in allen Frames klicken verschiedenen Positionen während der Zeit zu haben (Abbildung 3, Schritt 6 im roten Kasten). <ol><li> Starten Sie den Kern zu verfolgen seine Position durch einen Klick auf das Zentrum in allen Frames zu haben. Spur folgen die phagosomes (durch seine Mitte zu klicken) nacheinander zu der Zeit (Rahmen) ihrer Verinnerlichung, unterscheidet sich in Abhängigkeit von SRBCs. Der Einfachheit halber SRBC auf BF - Kanal zu sehen, verwenden Sie die &quot;Helligkeit und Kontrast&quot; Fenster während der Tracking (Abbildung 3, Schritt 5). </li></ol></li><li> Zwischen jedem SRBC - Tracking, klicken Sie auf &quot;Add Track&quot; (Abbildung 3, Schritt 4) eine neue Spur zu haben. Die Anzahl der Tracking wird in der zweiten Spalte &quot;Track n °&quot; der Ergebnistabelle (Abbildung 3, Schritt 6) geändert werden. </li><li> Speichern der Daten in einer Tabelle mit dem nächsten Schritt der Analyse fortzusetzen. </li></ol></li><li> Verwenden , Tabellenkalkulationssoftware , die zurückgelegte Strecke von Phagosomen enthält SRBCs Richtung Kern und der Geschwindigkeit der Phagosomen während der ersten 5 min nach der Internalisierung von SRBCs zu berechnen (FiAbbildung 4). <ol><li> Öffnen Sie die Tabelle Tabelle und eine neue Tabellenkalkulationsdatei. Transfer in diese neue Datei nur die folgenden Parameter, die Zeit, die x- und y- Koordinate des Kerns und alle SRBCs (4A). </li><li> Um den Abstand zwischen SRBCs berechnen und den Kern nur mit ihren Koordinaten betrachten den Kern und einen SRBC in einem XY-Koordinatenebene (4B). HINWEIS: Der Abstand zwischen zwei Punkten ist die Länge der Strecke, die sie verbinden. In der Ebene wird der Abstand zwischen SRBC und dem Kern durch den Satz des Pythagoras gegeben. <ol><li> Wenn c (der Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC) , um die Länge der Hypotenuse und A und b die Längen der beiden anderen Seiten bezeichnen exprimieren Pythagoras &#39;Theorem als pythagoreischen Gleichung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" /> HINWEIS: In der gleichen Zeit auf der orthonormal, der horizontale Abstanda (x - x Kern SRBC) und der vertikale Abstand b (y -y Kern SRBC). </li><li> So berechnen Sie den Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC (4A, lila Box) von: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" /> HINWEIS: Multiplizieren der Wert, der Abstand (in Pixeln) von x / y-Kalibrierung den Abstand in &amp; mgr; m zu haben. Hier wird die x / y-Kalibrierung ist 0,205 &amp; mgr; m. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt, zu subtrahieren , den Abstand zwischen dem Kern und dem SRBC auf den Anfangsabstand (4C). </li><li> Zeichnen Sie die Messung gegen die Zeit für den ersten 5 min. Tragen Sie eine lineare Trendlinie (5A) auf dem Grundstück und bestimmen die Steigung der linearen Trend-Linie, die die phagosome Geschwindigkeit in Richtung des Kerns während der ersten 5 Minuten nach der SRBC Internalisierung darstellt. </li><li> Collate die Daten den Durchschnitt und die statistischen Fehler von zu berechnendie Geschwindigkeitswerte und sie in geeigneter Form zeichnen die entsprechende Software (5B) verwendet wird . </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Technik hat mehrere wichtige Schritte. Zum einen ist die Herstellung von hMDMs und ihre Infektion durch HIV-1 wichtig, da der Prozentsatz der Infektion Spender abhängt. Bemerkenswert ist , haben wir beschlossen , Makrophagen zu verwenden , die in vitro vor der Infektion nicht polarisiert sind, weil der Status der Makrophagen durch das Virus in vivo angetroffen möglicherweise nicht gut , so weit charakterisiert. Wir überprüften die Expression verschiedener Oberflächenmarker, was darauf hinweist, d...

Makrophagen spielen eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem und in der Homöostase. Sie sind professionelle Fresszellen, die Krankheitserreger und Ablagerungen durch einen Prozess namens Phagozytose 1,2 internalisieren und eliminieren. Das Phagosom, das geschlossene Kompartiment, das sich nach der Verschlingung von partikulärem Material bildet, durchläuft eine Reihe von Fusions- und Spaltungsereignissen mit endozytären Kompartimenten, die zu einem abbauenden Kompartiment führen, das als Phagolysosom bezeichnet wird. Dieses Kompartiment hat aufgrund des Erwerbs protonenpumpender v-ATPasen einen sauren pH-Wert, enthält hydrolytische Enzyme und ist mit lysosomal-assoziierten Membranproteinen (LAMPs) angereichert. Die Reifung der Phagosomen geht einher mit ihrer Wanderung an Mikrotubuli 3,4 in Richtung des Zellzentrums, um einen perinukleären Ort zu erreichen, an dem Lysosomen akkumuliert werden.
Es wurde berichtet, dass viele Krankheitserreger die Phagosomenreifung kapern, einschließlich Bakterien mit intrazellulären Lebensstilen, die die vakuoläre Umgebung, in der sie sich befinden, verändern 5. Das Humane Immundefizienz-Virus (HIV)-1 zielt neben T-Zellen auch auf Makrophagen ab. Da Makrophagen im Gegensatz zu T-Zellen resistent gegen die zytopathische Wirkung des Virus sind, können sie als Reservoir für das Virus angesehen werden. Darüber hinaus weisen Makrophagen, die mit HIV-1 infiziert sind, fehlerhafte phagozytische Funktionen auf und tragen zur Entstehung opportunistischer Krankheiten bei. Insbesondere die schwere invasive nicht-typhusartige Salmonellenerkrankung, die durch Salmonella Typhimurium ST313 verursacht wird, ist seit drei Jahrzehnten bei Kindern oder Erwachsenen in Afrika südlich der Sahara weit verbreitet, die mit HIV infiziert sind 6. Es wird geschätzt, dass das Risiko, an Tuberkulose zu erkranken, bei Menschen mit HIV mehr als 20-mal höher ist als bei Menschen ohne HIV-Infektion. 
Aus all diesen Gründen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen, die den phagozytären Defekten in HIV-infizierten Makrophagen zugrunde liegen, besser zu definieren. Wir haben gezeigt, dass die Aufnahme von partikulärem Material, opsonisierten Partikeln, Bakterien oder Pilzen in HIV-infizierten Makrophagen gehemmt wurde 7. Da diese Hemmung partiell ist, machten wir uns daran, das Schicksal der internalisierten Phagosomen in HIV-infizierten menschlichen Makrophagen zu analysieren 8. Da die Phagosomenreifung eng mit der Migration zum Zellzentrum und der Fusion mit Lysosomen verbunden ist, kann ein Defekt in der phagosomalen Reifung auf Modifikationen der Transportmodalitäten in der infizierten Zelle zurückzuführen sein. Die hier beschriebene Methode verwendet IgG-opsonisierte rote Blutkörperchen von Schafen (IgG-SRBCs) als Modell, um auf die Rezeptor-vermittelte Phagozytose und insbesondere auf Rezeptoren für den Fc-Anteil von Immunglobulinen (FcR) abzuzielen. Diese Partikel sind im Hellfeld (BF) leichter abzubilden als Latexkügelchen, da extrazelluläre und intrazelluläre SRBCs unterschiedliche Brechungseigenschaften aufweisen 9. Um die Geschwindigkeit von Phagosomen zu messen, die sich in HIV-infizierten Makrophagen in Richtung Zellkern bewegen, haben wir ein fluoreszierendes Virus 10 verwendet und eine einfache manuelle Tracking-Methode eingerichtet, die hier beschrieben wird. Die Methode erfordert keine fortgeschrittene Programmierung und verwendet einfach ImageJ. Es ist für adhärente Zellen und jede Art von Partikeln oder Krankheitserregern geeignet, die mit Hellfeldmikroskopie oder mit Fluoreszenzbildgebung sichtbar gemacht werden können.

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Für die Virusproduktion</td></tr><tr><td>Glasbodenschalen 35 mm unbeschichtet 1,5</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Gehäuse</td><td>Für die Anschaffung</td></tr><tr><td>Falcon Gewebekulturplatten 6-well</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>Für humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>ein neutrales, stark verzweigtes, hochmassereiches, hydrophiles Polysaccharid in Lösung für die Dichtezentrifugation</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, flüssig (High Glucose)</td><td>GIBCO, Molekulare Sonden</td><td>31966-021</td><td>Konserviert bei 4 > C ; für HEK-Zellen</td></tr><tr><td>Kultur RPMI 1640 Medium GLUTAMAX&nbsp; Ergänzung</td><td>Lebenstechnologien</td><td>61870-010</td><td>Konserviert bei 4 > C; für hMDMs Kultur</td></tr><tr><td>F&oelig; Tal Kälberserum (FCS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>Konserviert bei -20 Grad; C ; dekompiliertes</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Konserviert bei -20 &de; C ; für hMDMs Kultur</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot (10x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &deg; C Wasserbad vor Gebrauch ; für Phagozytose-Assay</td></tr><tr><td>FuGENE6 Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Konserviert bei 4 > C ; für die Virusproduktion</td></tr><tr><td>Rote Blutkörperchen (SRBCs) von SchafenEurobio</td><td></td> <td>DSGMTN00-0Q</td><td>Konserviert in Alsever Puffer bei 4 &deg; C vor der Anwendung</td></tr><tr><td>Anti-Schafe rote Blutkörperchen IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Konserviert bei 4 > C</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin-Hitzeschockfraktion, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>konserviert bei -20 > C</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Spinning-Disk-Einheit&nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW Laser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objektiv</td><td>Leica</td><td></td><td>Objektiv ; Vergrößerung 100X ; Numerische Apertur 1,40 ; Immersionsöl</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Kamera</td><td>Photometrie</td><td></td><td>Pixelgröße 6,45 &Mikro; m x 6,45 &Mikro; m ; Definition: 1.392 x 1.040 ; Kodierung des Bildes in der</td></tr><tr><td>14-Bit-Software Metamorph 7.7.5</td><td>Molekulare Geräte</td><td></td><td>Für die Steuerung des Mikroskops</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td></td><td></td><td>Für die statistische Analyse</td></tr></tbody></table>

phagosom migration und geschwindigkeit gemessen in live-primären humanen makrophagen mit hiv-1 infizierten

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die eine wichtige Rolle an der Schnittstelle zwischen angeborener und spezifischer Immunität spielen. Sie können mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1 infiziert sein und können aufgrund ihrer Resistenz gegen dessen zytopathische Wirkung als persistente virale Reservoire angesehen werden. Darüber hinaus weisen HIV-infizierte Makrophagen defekte Funktionen auf, die zur Entstehung opportunistischer Krankheiten beitragen.
Der genaue Mechanismus, durch den HIV-1 die phagozytäre Reaktion von Makrophagen beeinträchtigt, war unbekannt. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die Aufnahme verschiedener partikulärer Stoffe durch Makrophagen gehemmt wurde, wenn sie mit HIV-1 infiziert waren. Diese Hemmung war nur partiell und es bildeten sich Phagosomen in HIV-infizierten Makrophagen. Daher konzentrierten wir uns auf die Analyse des Schicksals dieser Phagosomen. Die Reifung der Phagosomen geht mit einer Wanderung dieser Kompartimente in Richtung des Zellzentrums einher, wo sie mit Lysosomen verschmelzen und Phagolysosomen erzeugen, die für den Abbau des aufgenommenen Materials verantwortlich sind. Wir verwendeten IgG-opsonisierte rote Blutkörperchen von Schafen als Ziel für die Phagozytose. Um die Geschwindigkeit der zentripetalen Bewegung von Phagosomen in einzelnen HIV-infizierten Makrophagen zu messen, verwendeten wir eine Kombination aus hellfeld- und fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie. Wir haben eine Methode entwickelt, um den Abstand der Phagosomen zum Zellkern zu berechnen und dann die Geschwindigkeit der Phagosomen zu berechnen. HIV-infizierte Zellen wurden dank eines GFP-exprimierenden Virus identifiziert, aber die Methode ist auf nicht infizierte Zellen oder jede Art von Infektion oder Behandlung anwendbar.

FcR-vermittelte Phagozytose durch HIV-1-infizierten und nicht-infizierten hMDMs wird hier beschrieben unter Verwendung von IgG-opsonisiertes SRBCs als Modellzielen (Abbildung 1). Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die Herstellung von hMDMs und die Infektion mit HIV-1. Tatsächlich variiert die Ausbeute und die Qualität der differenzierten Makrophagen unter den Gebern sowie die Infektionsrate mit einem Wirkungsgrad im Bereich von 10-40%. Darüber hinaus ist die ...

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Geschwindigkeit von Phagosomen, die sich in lebenden Zellen in Richtung des Zellzentrums bewegen, die mit oder ohne das humane Immundefizienzvirus (HIV) Typ 1 infiziert sind, wobei die konfokale Fluoreszenzmikroskopie der Spinning-Disk zur Identifizierung fluoreszierender infizierter Zellen und die Hellfeldmikroskopie zum Nachweis von Phagosomen verwendet wird.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Das übergeordnete Ziel dieser Analyse ist es, die Phagosomen-Geschwindigkeit in HIV-1-infizierten Makrophagen mithilfe einer einfachen manuellen Verfolgungsmethode zu quantifizieren. Der Vorteil dieses Protokolls liegt darin, eine einfache Methode bereitzustellen, um die relativen Bewegungen von Objektgruppen innerhalb einer Zelle zu berechnen, die sich entweder bewegen oder verformen können. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Bewegung von Phagosomen in GFP-positiven infizierten Makrophagen, könnte jedoch auch für andere intrazelluläre Kompartimente in fluoreszenzmarkierten Zellen verwendet werden.Nach der Infektion humaner, aus Monocyten abgeleiteter Makrophagen und der Opsonisierung von Schafsblutzellen gemäß dem Textprotokoll ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines konfokalen Abbildungssystems, wie beispielsweise eines Spinning-Disk-Mikroskops, das mit einer Heizkammer bei 37 Grad Celsius und Kohlendioxid ausgestattet ist, durchführen. Vor Beginn des Experiments die Heizkammer einschalten, um die Mikroskopierbühne auf 37 Grad Celsius aufzuheizen. Anschließend das Mikroskop und den Computer einschalten und die Bildgebungssoftware laden.Optimieren Sie die Bildgebungspa

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Die Motilität phagokinetic Spur Assay ist ein Verfahren verwendet, um die Bewegung von Zellen beurteilen. Insbesondere misst der Test Chemokinese (random Zellmotilität) über die Zeit in einer quantitativen Weise. Der Assay nutzt die Fähigkeit von Zellen, um eine messbare Spur ihrer Bewegung auf kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern erstellen.

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung...

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Der phagosomale pH-Wert beeinflusst die Phagosomenreifung, die Produktion von Oxidationsmitteln, die phagosomale Abtötung sowie die Antigenpräsentation. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ratiometrische Methode zur Messung von Zeitverlaufs- und Endpunkt-pH-Veränderungen in einzelnen Phagosomen in lebenden Fresszellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Erfahren Sie die Messung der Phagosom-Geschwindigkeit in HIV-1-infizierten Makrophagen mittels Spinning-Disk-Konfokal-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung zellulärer Bewegungen in Echtzeit.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

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