À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Cancer Research

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Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

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Abstract

Métastase vers des sites secondaires , tels que le poumon, le foie et l' os est un événement traumatique avec un taux d'environ 1 à 90% de mortalité. Parmi ces sites, le poumon est le plus difficile à évaluer en utilisant l'imagerie optique intravitale en raison de sa position fermée dans le corps, la nature délicate et rôle vital dans le maintien de la physiologie appropriée. Bien que les modalités cliniques (tomographie par émission de positons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomodensitométrie (CT)) sont capables de fournir des images non invasives de ce tissu, ils manquent de la résolution nécessaire pour visualiser les premiers événements d'ensemencement, avec un seul pixel constitué de près d'un millier de cellules. Les modèles actuels de poumon métastatique ensemencement postulat que les événements juste après l'arrivée d'une cellule tumorale déterministes pour la survie et la croissance ultérieure. Cela signifie que en temps réel des outils d'imagerie intravitale avec une résolution à une seule cellule 2 sont nécessaires pour définir les phénotypes de l'ensemencement cells et de tester ces modèles. Alors que l' imagerie optique à haute résolution du poumon a été réalisée en utilisant divers ex vivo des préparations, ces expériences sont généralement seule fois-point des tests et sont sensibles à des artefacts et des conclusions erronées possibles en raison de l'environnement considérablement modifié (température, profusion, cytokines, etc. ) résultant de la suppression de la cavité thoracique et le système circulatoire 3. Des travaux récents ont montré que l' imagerie optique intravitale time-lapse du poumon intact est possible en utilisant un vide stabilisé fenêtre d'imagerie 2,4,5 cependant, les temps typiques d'imagerie ont été limités à environ 6 heures. Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse à long terme du poumon en utilisant une telle fenêtre sur une période de 12 heures. Les time-lapse séquences d'images obtenues à l'aide de cette méthode permettent la visualisation et la quantification des interactions entre les cellules, la dynamique des membranes et de la perfusion vasculaire dans les poumons. Nous avons en outre dEscribe une technique de traitement d'image qui donne une vue sans précédent claire de la microvascularisation pulmonaire.

Introduction

L'imagerie haute résolution optique intravitale est avérée être essentielle à la compréhension de nombreux processus biologiques, ce qui permet une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaires qui doivent être mesurés et quantifiés. Dans la recherche sur le cancer, l' imagerie intravitale de cellules tumorales et stromales a conduit à la découverte de nombreuses interactions microenvironnementales 6-11 qui ne sont présents que chez l'animal intact.

Les découvertes sur microenvironnements associés à intravasation et la diffusion des cellules tumorales dans le cancer du sein par imagerie optique à résolution cellulaire unique in vivo a même conduit à de nouveaux marqueurs pour le pronostic et la réponse au traitement chez les patients atteints de cancer du sein 12-16. Les meilleures technologies d'imagerie disponibles pour la visualisation profondément dans les organes vitaux internes intacts sont les modalités cliniques (IRM, PET, CT) qui offrent d'excellentes vues de l'organe entier et peut révéler des pathologies avant même qu'ils produisent des symptômes cliniques. Ils sont incapables, houtefois, pour révéler les premiers stades de la métastase et les mécanismes cellulaires de conduite progression de la tumeur en raison de leur manque de résolution de la cellule unique. Au moment où les métastases pulmonaires sont visibles dans ces modalités, elles sont bien établies et la prolifération. Compte tenu de l'estimation selon laquelle 90% des cellules disséminées tumorales qui arrivent dans le poumon soit ne survivent pas à 17 ou initialement restent dormantes 18, et l'observation selon laquelle ils arrivent beaucoup plus tôt que prévu 19, imager les premières étapes de l' arrivée et la survie devient crucial de comprendre le processus d'ensemencement métastatique et la récurrence de la croissance tumorale sur des sites distants.

L'exécution de ces observations dans le poumon a prouvé cependant extrêmement difficile; la grande majorité des études d'imagerie ont utilisé ex vivo ou explants préparations 20-23, qui ne donnent une vue dans le poumon à des moments uniques. Bien que ces préparations fournissent des informations utilesrmation, ils ne donnent pas une compréhension complète des interactions, des relations de cause à effet, et la dynamique qui se produisent entre les diverses composantes du microenvironnement. L'absence d'un système adéquat circulatoire (et le déséquilibre concomitant de l' homéostasie) et la déconnexion du reste du système immunitaire de l'organisme, il est désireux de valider les conclusions que ces préparations génèrent dans le tissu intact in vivo.

De nombreux groupes ont effectué l' imagerie intravitale du poumon intact 2,4,5,24-33 avec Wearn et l' allemand étant le premier à chirurgicalement exposer la couche pleural 24 et Terry le premier à utiliser une fenêtre d'imagerie implantable 25.

imagerie à haute résolution dans le poumon est fortement entravée par le mouvement constant du poumon et plusieurs techniques ont été développées pour surmonter cette limitation. Wagner et Filley 27 ont étudié le mouvement naturel du poumon canineet conçu leur protocole chirurgical pour localiser leur fenêtre implantée sur une région relativement stationnaire tandis que Wagner a utilisé le vide dans sa fenêtre préparation chirurgicale pour immobiliser le tissu 28. Depuis ce temps, une variété de techniques ont été utilisées pour l' image du poumon , y compris: serrage des bronches, l' apnée séquentielle et imagerie fermée, acquisition suréchantillonné, collage du lobe du poumon et de vide 34. Chacun d'eux a ses avantages et ses inconvénients et pas une technique est apparue comme supérieur à un autre 34. Par exemple, la bronche de serrage et de l'apnée séquentielle modifie l'échange normal de gaz dans les poumons et peuvent provoquer une atélectasie. imagerie Gated et l'acquisition suréchantillonné ne souffrent pas de ces inconvénients, mais exigent à grande vitesse ou des équipements spécialisés d'imagerie pas largement accessible. Enfin, tant encollage du poumon et de la technique du vide éviter les deux inconvénients mentionnés ci-dessus, mais peuvent présenter des lésions induites par la force de cisaillement si les soins ne sont pas taken. Au cours des dernières années, la fenêtre de vide a été miniaturisé et adapté pour une utilisation dans des souris en utilisant confocale et multiphotonique microscopie 4,5,33 et une excellente imagerie à haute résolution a été atteint 2. Le tableau 1 résume cette riche histoire et met en évidence ces documents qui décrivent roman les progrès dans l'utilisation de fenêtres d'imagerie intravitale du poumon.

Ce protocole décrit l'utilisation de longue time-lapse multiphotonique intravitale microscopie à l'image des métastases dans le, du poumon intact en direct avec la résolution subcellulaire le plus élevé possible. Les images sont acquises pour un maximum de 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé d'une ouverture numérique objectif élevé et tube photomultiplicateur multiple (PMT) détecteurs. des modèles de souris transgéniques sont utilisés pour l'étiquette fluorescente macrophages natifs avec fluorescent dextran de poids moléculaire élevé et des cellules tumorales de protéines fluorescentes transfectées (pour marquer les cellules tumorales du système vasculaire et respectively). Bien que ce choix de cellules marquées par fluorescence permet la visualisation des interactions cellulaires-macrophage cellules endothéliales tumorales et la dynamique, ce protocole va travailler pour toute souche de souris fluorescent ou non fluorescent. Après l' acquisition, le mouvement de dérive résiduelle ( le cas échéant) est éliminé en utilisant un plug - in Fiji 35,36 et macros personnalisées moyenne temporelle du canal vasculaire pour éliminer le clignotement provoquée par des cellules non marquées du sang circulant.

Bien que ce protocole met l'accent sur l'imagerie des métastases, les techniques sont applicables à de nombreux autres processus biologiques observables avec imagerie à haute résolution à cellule unique dans le poumon.

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Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été réalisées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation des animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Génération de souris marquées par fluorescence des modèles et des cellules tumorales

  1. Préparer 100 ml (p / v) de sérum-albumine bovine / tampon du tampon phosphate salin (PBS / BSA) à 0,1% en mélangeant 0,1 g de BSA avec 100 ml de PBS.
  2. Préparer les cellules tumorales marquées par fluorescence par transfection stable.
    REMARQUE: On utilise ici les cellules E0771-LG, un dérivé hautement métastatique des cellules de souris E0771 adénocarcinome mammaire 37 qui ont été isolées à partir de tumeurs métastatiques développées dans le poumon de souris C57BL / 6 par voie intraveineuse une injection de cellules parentales 38 E0771.
    1. 24 heures avant la transfection, plaque 1 x 10 5 cellules EO771-LG sur une boîte de culture de tissu de 60 mm sur 2 ml de antibiogratuitement 10% de FBS (sérum fœtal bovin) DMEM tic (milieu de Eagle modifié par Dulbecco) et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
    2. Au moment de la transfection, laisser incuber 2 ug du vecteur de la protéine fluorescente avec 10 pi de réactif de transfection pendant 30 minutes avant d'ajouter 190 ul de milieu de sérum réduit.
    3. Laver les cellules EO771-LG avec phosphate solution saline tamponnée de Dulbecco (D-PBS) une fois et ajouter doucement le mélange de transfection.
    4. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 6 h.
    5. Laver les cellules transfectées et la culture dans 2 ml de DMEM complet (10% de FBS, du pyruvate 1 mM, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine) pendant 2 jours.
    6. Laver les cellules avec 2 ml de PBS stérile, ajouter 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA et on incube pendant 2 min à 37 ° C.
    7. Collecter suspension cellulaire et mélanger avec au moins 1 volume de DMEM complet et centrifuger à 280 x g.
    8. Resuspendre les cellules dans 1 ml de DMEM complet et développer la culture de cellules enune boîte de 10 cm pour culture de tissus.
    9. Démarrer la sélection des cellules transfectées par l'addition de 700 ug / ml d'antibiotique G418 sélectif à 8 ml de DMEM complet et la culture pendant une semaine, en changeant milieu tous les trois jours.
  3. Enrichir la population fluorescente à partir de cellules transfectées qui ont été sous sélection dans G418 par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 39,40.
    1. Laver les cellules avec 5 ml de PBS et on ajoute 1,5 ml de trypsine à 0,25%.
    2. Incuber pendant 2 min à 37 ° C et on mélange avec au moins un volume de DMEM complet.
    3. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 280 x g et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de solution stérile à 0,1% (p / v) de tampon PBS / BSA.
    4. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis de 40 pm et ajuster le volume à 1 ml avec du tampon 0,1% de BSA / PBS pendant le tri.
    5. FACS-trier la plus brillante population de 10% sur la base spectre de fluorescence en utilisant le trieur FACS 41.
    6. Culture des cellules triées pour une autre semaine usélection de nder (700 pg / ml de G418 dans DMEM complet).
    7. Resélectionnez cellules marquées par fluorescence par cytométrie en répétant les étapes 1.3.1 à 1.3.6 une fois de plus.
    8. Après un deuxième cycle de sélection, trypsiniser, filtrer et remettre en suspension les cellules dans 0,1% de BSA / PBS (comme décrit étapes 1.3.1-1.3.4). Ajuster la concentration de 2 x 10 6 cellules / ml pour le tri monocellulaire dans des plaques à 96 puits en utilisant le trieur FACS.
    9. Préparer 3-5 plaques à 96 puits avec 100 ul de DMEM complet pour la collecte. Pour améliorer la survie après le tri, ajouter 100 ul de milieu de culture filtré plats où les cellules EO771-LG ont été cultivées 42.
    10. Après le tri des cellules dans des plaques à 96 puits, le retour à la culture des cellules pendant 2 jours (37 ° C, 5% CO 2).
    11. Identifier les puits avec des clones individuels viables par l'examen au microscope inversé à grossissement 5x.
    12. Trypsiniser et développer des clones viables et congeler les cellules pour la sauvegarde.
      1. Laver les puits avec gren raison des clones avec 100 ul de PBS stérile. Ajouter 50 pi de 0,25% p / v de trypsine et incuber pendant 2 min à 37 ° C. Ajouter 50 ul de DMEM complet et transfert à plaque de 96 puits à fond à fond en V ou rond stérile pour centrifuger à 280 g pendant 5 min.
      2. Resuspendre les cellules dans 100 ul de 700 pg / ml de G418 DMEM complet et la plaque de chaque clone dans des plaques à 12 puits. Ajouter 400 ul de DMEM complet avec G418 et de la culture jusqu'à la confluence.
      3. Laver les puits avec 500 ul de PBS, ajouter 100 pi de trypsine à 0,25% et incuber pendant 2 min à 37 ° C. Ajouter 100 pi de DMEM complet et centrifuger pendant 5 min à 280 x g. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de DMEM complet avec G418 et de la plaque dans des plaques à 6 puits jusqu'à confluence.
      4. Une fois confluentes, Trypsiniser cellules, tournent vers le bas et remettre en suspension dans 10% de DMSO dans FBS à geler les stocks de cellules.
      5. Maintenir 10/01 des suspensions cellulaires en culture en les plaquant à 100 mm des plaques de culture tissulaire pour une évaluation de leur potentiel métastatique.
  4. Testez le potentiel métastatique des clones sélectionnés.
    1. Trypsiniser et remettre en suspension les cellules dans du sérum physiologique à une concentration de 2,5 x 10 6 cellules / ml et 200 pi injectent dans C57BL / 6 par voie intraveineuse à travers la veine caudale.
    2. Au bout de 2 semaines, de recueillir le tissu pulmonaire comme décrit précédemment 23 et de quantifier la charge tumorale par comptage de surface ou procédé stéréologique 43. Sélectionnez clones avec un potentiel métastatique élevé pour l'imagerie intravitale.
  5. Soulever MacBlue (un promoteur spécifique myéloïde conduite cyan protéine fluorescente (PCP) expression (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) des souris rapporteurs 44.
    NOTE: En règle générale, les souris entre 8 et 12 semaines sont utilisées, mais les souris aussi tôt que 7 et au plus tard jusqu'à 20 semaines ont été testés pour fonctionner aussi bien.

2. multiphotonique Microscope Set et imagerie Préparation

NOTE: Bien que ce protocole peut être effectué sur tout multiphoton microscope, le système utilisé pour acquérir les données présentées dans ce protocole a été décrit précédemment en détail 45.

  1. Allumez tous microscope laser et composants, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs au moins une heure avant l'heure d'imagerie souhaitée.
  2. Juste avant la chirurgie, de mesurer la puissance de l'entrée de la lumière au microscope en plaçant la tête de l'appareil de mesure de puissance optique dans la trajectoire du faisceau juste avant le microscope et régler les boutons de miroir laser à cavité d'extrémité jusqu'à ce que l'intensité lumineuse maximale à 880 nm est lue sur l'appareil de mesure de puissance optique.

3. Système à vide Configurer

  1. Collez la lamelle dans la fenêtre d'imagerie (Figure 1 supplémentaire) avec cyanoacrylate. Prévoyez au moins 4 heures pour que la colle sécher complètement.
    REMARQUE: Cette étape peut également être fait à l'avance.
  2. Couper la pointe de pipette 100 pi à la première ligne de la petite ouverture et connectez l'extrémité non coupée à la mince vacuum tuyau.
  3. Connectez le système à vide selon la figure 1 et supplémentaire Figure 2.
  4. Avec le vide sur l'extrémité ouverte et bloquée, régler le régulateur de vide pour <3 poHg.
    REMARQUE: L' ajustement final du niveau de vide sera effectuée par l' observation du système vasculaire in vivo.
  5. Appliquer une fine couche de graisse de pétrole sur la face inférieure de la plaque d'imagerie pour empêcher le moyen lentille à immersion objectif d'être évacuée par la plaque d'imagerie.
  6. Placer la plaque d'imagerie sur la platine du microscope.
    NOTE: La plaque d'imagerie personnalisée (Figure supplémentaire 3) est une feuille de 1/8 "aluminium épais usiné à la fois pour tenir dans l'espace d'insertion de la scène et avec un trou de passage dans le centre de maintien de la fenêtre d'imagerie.
  7. Insérer la fenêtre vide dans la plaque d'imagerie avec la lamelle vers le bas.
  8. Stériliser toutes les surfaces et instruments, y compris plaque de stade de l'imagerie et l'imagerie gagnantdow avec 70% d'éthanol.
  9. Connectez l'extrémité de la pointe de la pipette à la fenêtre de vide de coupe et la bande du tuyau vers le bas sur la plaque d'imagerie.
  10. Apportez l'objectif près de la fenêtre d'imagerie et de placer une grosse goutte d'eau entre l'objectif et la lamelle.
  11. Veiller à ce qu'il n'y ait pas de fuites de la lamelle en bloquant l'ouverture centrale de la fenêtre de vide et de vérifier que la goutte d'eau entre l'objectif et la lamelle ne soit pas aspiré.
    NOTE: Une vieille boule de souris d'ordinateur de style placé sur la fenêtre est utile pour bloquer l'ouverture centrale.

4. Surgery

  1. Préparer la zone chirurgicale stérile.
    1. Placez tous les instruments à portée de main. Stériliser toutes les surfaces et les instruments, y compris la zone chirurgicale, et les outils chirurgicaux avec 70% d'éthanol.
  2. Attachez une longueur de 3 pouces de 2-0 suture au cathéter, ¼ pouce au-dessus de la douille avec un double noeud.
  3. Préparer la queue fol veine de cathéterLowing le protocole publié par Harney et al. 46.
  4. L'utilisation d'un infrarouge (IR) lampe chauffante, chauffer l'animal dans sa cage pendant environ 5 min pour augmenter le débit sanguin dans la veine caudale et pour aider à l'insertion du cathéter. Il est recommandé de garder l'animal chauffé à des températures physiologiques tout au long de la procédure chirurgicale en utilisant soit une lampe chauffante ou un coussin chauffant.
  5. Anesthésier l'animal avec 5% d'isoflurane et de vérifier qu'il n'y a pas de réponse à un pincement de l'orteil.
  6. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de l'animal.
  7. Appliquez une lotion dépilatoire pour 10-30 sec pour enlever les poils du côté gauche de l'animal; à partir de la ligne médiane de la poitrine à un quart du dos et de la région axillaire juste sous la cage thoracique.
  8. Nettoyer tout excès de lotion et stériliser la peau exposée avec 70% d'alcool.
  9. Fixer une seringue stérile remplie de PBS à la veine cathéter de queue et insérer et bande en place suivant le protocole publié par Harney et al. 46. Assurez-vous que le ruban est bien collé à l'aiguille elle-même et ne sont pas libres dans l'intervalle entre la queue et la bande.
  10. Intuber la souris suivant soit le protocole publié par Das et al. 47 ou par DuPage et al. 48
  11. Allumez le ventilateur et le mettre à fournir 135 respirations par minute et 200 pi de mélange isoflurane-oxygène.
  12. Connecter le cathéter trachéal au ventilateur.
  13. Déplacez la souris vers la zone chirurgicale. Prenez soin de ne pas déloger le cathéter.
  14. Attachez le 2-0 suture autour du museau de la souris sous la dents de devant.
  15. Tape le cathéter pour le museau.
  16. Tape le forelimb gauche au cathéter pour le garder hors du champ opératoire.
  17. Abaisser l'anesthésie isoflurane à un niveau de 2,5% de l'entretien et vérifiez qu'il n'y a pas de réponse à un pincement de l'orteil.
  18. À l' aide des ciseaux pointus, retirer 1 cm 2 de peau au- dessus de la paroi thoracique gauche.
  19. Ascenseur til mammaires pad graisse et cautériser des vaisseaux sanguins exposés avec la plume de cautérisation.
  20. Réséquer le coussinet adipeux en coupant avec les ciseaux pointus.
  21. Retirer la couche musculaire vers la cage thoracique en découpant avec des ciseaux tranchants. Prenez soin de ne pas couper la veine axillaire en cours d'exécution à la base de la patte antérieure.
  22. Utilisez une pince pour saisir et soulever le 6 ème côte. À l'aide des ciseaux pointus tenue à un angle faible (~ 5 °) couper la nervure près du bord de l'ouverture dans la peau. Prenez soin de ne pas toucher le tissu pulmonaire exposée.
  23. Élargir l'ouverture dans la paroi thoracique afin d'exposer le lobe pulmonaire entier en retirant quatre nervures consécutives.
    Remarque: Gardez l'ouverture d'au moins 5 mm du sternum pour éviter le cœur.
  24. Soulevez délicatement la souris en saisissant la queue et trachéale cathéter et déplacer la souris à l'étape d'imagerie du microscope.
  25. Avec l'arrêt de vide, remplir la chambre de la fenêtre sous vide avec du PBS.
  26. Inversez la souris et positionnez le exposéspoumon sur la fenêtre d'imagerie sous vide.
  27. Tournez lentement le vide à environ 3-5 pouces de mercure en utilisant la vanne à boisseau sphérique.
  28. Placez un harnais de retenue en papier tissu plié en deux à deux reprises sur la poitrine de la souris et du ruban adhésif à la plaque de platine comme le montre la figure 2 supplémentaire.
  29. Fixez le capteur de la cuisse de l'oxymètre de pouls à la cuisse de l'animal et démarrer le logiciel.
  30. Placez la chambre de l'environnement sur la scène et allumer la chaleur pour maintenir la souris à une température physiologique.
  31. Réduire le niveau de l'isoflurane à 1 à 1,5% pour maintenir l'anesthésie et de maintenir le flux sanguin.

5. Imagerie intravitale

  1. Porter le 25 x 0,95 ouverture numérique (NA) objectif à proximité de la lamelle et ajouter une grosse goutte d'eau entre eux.
  2. Utilisation du mode épifluorescence, voir le canal FITC et amener le tissu pulmonaire dans le foyer.
  3. Dans le cas contraire effectuée avant l'intervention chirurgicale, iles cellules tumorales nject à travers le cathéter dans la veine caudale.
    1. Déconnecter la seringue PBS du cathéter dans la veine caudale.
    2. Charger une seringue stérile avec 100 ul de suspension de cellules tumorales (2 x 10 7 cellules / ml dans du PBS au maximum).
      Remarque: Cette étape peut être effectuée à l'avance pour étudier les cellules du cancer du poumon à l'arrivée à différents points de temps.
    3. Connecter la seringue avec des cellules tumorales sur le cathéter dans la veine caudale.
    4. Injecter lentement les cellules tumorales dans la veine de la queue.
    5. Déconnecter la seringue avec les cellules tumorales du cathéter dans la veine caudale.
    6. Rebranchez la seringue PBS au cathéter veine de la queue.
      REMARQUE: identifier les emplacements de toutes les cellules tumorales avant d'injecter le dextrane car il devient difficile de distinguer les cellules tumorales à partir du signal de dextran par l'oculaire après l'injection.
  4. Repérez les cellules tumorales à l'image
    1. Pour l'imagerie des cellules tumorales individuelles, localiser toutes les cellules tumorales et enregistrer leurs emplacements avec ee multipoint panneau du logiciel.
      1. Localiser tous les champs de vision de l'image en observant les cellules tumorales dans l'oculaire du microscope.
      2. Dans le logiciel, passez à l'écran multipoint en cliquant sur le bouton Multi-Point et de stocker l'emplacement de la cellule en cliquant sur le bouton Ajouter Position.
    2. Pour l'imagerie mosaïque, localiser l'origine de la mosaïque et définir les coordonnées d'imagerie
      1. Localiser une position dans le coin supérieur gauche de la structure à capturer.
      2. Zéro coordonnées x, y et z de la scène en appuyant sur le bouton "Zero" sur le contrôleur de scène.
      3. Chargez la liste appropriée des coordonnées mosaïque en cliquant sur le bouton "Charger" et en sélectionnant la liste.
        REMARQUE: une liste d'exemples de 2 x 2 mosaïque avec un chevauchement d'un champ de vision de 500 um 20% serait: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0,400), Pos. 4 = (400,400).
  5. Retirez la seringue with PBS dans la veine cathéter de queue et le remplacer par la seringue contenant le dextran.
  6. Injecter lentement jusqu'à 100 ul de 20 mg / ml de rhodamine 155 kDa dextrane dissous dans du PBS dans la souris via le cathéter dans la veine caudale, suivie par l'injection de 50 ul de PBS stérile pour rincer la ligne. Ne pas introduire de bulles dans la ligne. Le cas échéant, l'injection de dextrane au moins une heure après l'injection des cellules cancéreuses de sorte que le volume total administré à la souris, ne dépasse pas 4 ml / kg / h.
  7. Mettre en place des paramètres d'imagerie.
    1. Mettez le microscope en mode multiphotonique.
    2. Réglez le zoom sur un facteur de 2X en cliquant sur le bouton des signaux de synchronisation et de mise à jour du champ Facteur Zoom.
    3. Réglez la puissance du laser à ~ 10% (~ 10-15 mW à l'échantillon) en cliquant sur le bouton Détecteurs et laser, puis en ajustant le curseur Tsunami Puissance à 10.
  8. Chaque emplacement d'image pour vérifier la présence de cellules tumorales et de visualiser l'écoulement et l'intégrité du Vasculateur.
    NOTE: Les navires doivent apparaître complètement perfusé avec des érythrocytes fluides et dextran fluorescent doivent être contenues dans les vaisseaux sans fuite vers les espaces extravasculaires. Environ 10 - 20 cellules tumorales sont censés se situer dans l'ouverture libre de la fenêtre à vide.
  9. Régler la profondeur de départ de chaque emplacement à imager.
    1. Pour chaque emplacement, régler la position z en tournant le bouton de mise au point sur le contrôleur de la scène à l'image de la tranche supérieure de la cellule tumorale.
    2. Placer la cellule dans le centre du champ de vision.
    3. Cliquez sur le bouton Multipoint, cliquez sur la position du champ de vision pour le mettre en surbrillance et cliquez sur Ajouter puis sur le bouton Supprimer pour remplacer la position mémorisée de la cellule dans la liste multipoint.
    4. Observer visuellement la luminosité relative de la cellule tumorale, dans chaque position.
  10. Enregistrer les nouveaux emplacements de chacune des cellules en cliquant sur le bouton Enregistrer dans le panneau un MultipointD spécifier un nom de fichier.
  11. Pour l'imagerie des cellules tumorales individuelles, choisir trois cellules de luminosité à peu près équivalente et supprimer tous les autres emplacements de la liste multipoint en cliquant sur leur emplacement dans la liste, puis en cliquant sur le bouton Supprimer.
  12. Cliquez sur le bouton Détecteurs et laser et ajuster les curseurs pour le gain du PMT des canaux vert et rouge 45 de sorte que les signaux sont en dessous de la saturation.
  13. Réglez le curseur pour le canal bleu 45 de sorte que les macrophages apparaissent cyan.
    NOTE: Tout signal de second harmonique apparaît seulement dans le canal bleu et peut être séparé des macrophages cyan en suivant la procédure canal de soustraction décrite précédemment 45.
  14. Réglez le début profondeur z-stack à 0 pm et la profondeur de fin à 24 um en déplaçant la phase de z à l'emplacement et en cliquant sur Démarrer et boutons de fin respectivement.
    NOTE: Les cellules au sein de cette profondeur sera visualisée avec le meilleur signal àle bruit et la résolution.
  15. Définissez la taille z étape à 3 pm.
  16. Réglez les paramètres d'imagerie suivants paramètres précédemment décrits 45,49.
    1. Pour l'imagerie des cellules tumorales individuelles, cliquez sur le bouton des signaux de synchronisation, puis entrez 4 V dans le champ de facteur de zoom (équivalent à un facteur de zoom de 1,5x), entrez 3 dans le domaine des moyennes de cadre et cliquez sur le bouton Time-Lapse et entrez 10 dans le champ Time-lapse.
      REMARQUE: Ces paramètres vont acquérir 1 image toutes les 3 secondes.
    2. Pour l'imagerie mosaïque, cliquez sur le bouton des signaux de synchronisation et entrez un facteur de zoom de 1,5 V (équivalent à un facteur de zoom de 4X), entrez 3 dans le nombre de moyennes de cadre et cliquez sur le bouton Time-Lapse et entrez 10 dans la Time- lapse champ de temporisation.
      REMARQUE: Ces paramètres vont acquérir 1 image toutes les 3 secondes.
  17. Activer le multipoint, z-stack et modes d'imagerie t-lapse en cliquant sur leurs boutons.
  18. Appuyez sur le bouton d'enregistrement pour acquérir des images.
    NE PASE: Le tissu pulmonaire est très délicate et sensible à la photo-dommages. Si après le temps du flux sanguin d'imagerie lapse arrête dans le champ imagé, le laser est le plus susceptible d'imagerie trop élevé et ultérieur d'autres champs doit être fait au plus faible puissance.
  19. Chaque 30 à 45 minutes, injecter lentement 50 ul de PBS ou de solution saline pour maintenir l'hydratation de l'animal.

6. euthanasie

  1. Augmenter le isoflurane à 5%.
  2. Gardez l'animal de moins de 5% d'isoflurane jusqu'au 30 sec après qu'il cesse de respirer et enlever l'animal de la scène.
  3. Effectuer la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie complète.

7. Analyse de l'image

  1. Pour les expériences d'imagerie cellulaire simples:
    1. Charger des images dans les Fidji et les formater comme un HyperStack.
    2. Pour chaque z-tranche dans le HyperStack, lire le film laps de temps et de regarder pour le mouvement xy résiduel. Si le mouvement xy résiduel est trouvé, appliquer le plugin appelé StackReg 36 à la pileéliminer le mouvement.
  2. Pour les expériences d'imagerie en mosaïque:
  3. Charger des images dans les Fidji et les assembler en ouvrant la mosaïque Stitching macro (fichier supplémentaire de code mosaïque Broder) et la saisie des informations sur les images telles que le répertoire, le nom de base de fichier, le nombre de champs x et y dans la mosaïque et le nombre des tranches et des points de temps.
    NOTE: En raison de la façon dont Java interprète les répertoires, les noms de dossier doit avoir deux barres obliques comme séparateurs de sous-dossiers. En raison de limitations dans le plug-in intégré Paires Brochage, les noms de fichiers de base ne doivent pas contenir de tirets.
  4. Pour obtenir une vue claire des limites de la vascularisation, en moyenne ensemble tous les points de temps pour le canal de sang en une seule image, puis répliquer cette image comme arrière-plan pour chaque image du film des autres canaux.
    NOTE: Cela se fait simplement en exécutant la macro Effectuer étalement du sang (fichier de code supplémentaire Effectuer étalement du sang).
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Representative Results

Pour démontrer le type de résultats qui peuvent être obtenus avec cette méthode, nous avons injecté des cellules tumorales E0771-LG étiquetés avec le Clover protéine fluorescente dans la veine de la queue de souris MacBlue 44 à différents points de temps avant la chirurgie. Après la chirurgie, 155 kD rhodamine dextran marqué a été injecté par voie IV pour marquer la vascularisation et imagerie time-lapse a été réalisée.

Lorsque l'imagerie souris après l'injection de 24 heures, des cellules individuelles sont visibles à l'intérieur de la vascularisation, l'interaction avec les macrophages et les monocytes. Un exemple de ceci est représenté sur la figure 2A (film supplémentaire 1). Voici une section optique unique d'une cellule tumorale solitaire (vert) de 12 um de profondeur déposée dans la vascularisation pulmonaire est imagé plus de 5 h et 20 min car il interagit transitoirement avec un macrophage résident (cyan). Vascularisation est marquée par dextrane de poids moléculaire élevé. La stabilité de laimagerie est telle que l' imagerie séquentielle z-stack du champ peut être acquis et une reconstruction en 3 dimensions peut être fait (figure 2B, Film supplémentaire 2).

Utilisation des réglages du microscope décrites dans le protocole pour l'imagerie mosaïque permet l'imagerie des structures plus grandes qu'un seul champ de vision. Par exemple, la figure 3 illustre l' acquisition d'une seule lésion métastatique, 12 jours après l' injection. Ce 5 x 5 mosaïque montre un champ de 890 um de vue plus de 205 min à 15 (figure 3A, panneau de gauche; Supplemental Film 3) et 25 um (figure 3A, panneau de droite) en dessous de la surface du poumon. Malgré le grand champ de vision, la haute résolution des images sous - jacentes qui composent la mosaïque permet la capture d'événements intracellulaires tels que la mitose d'une cellule unique comme en témoigne la séparation chromosomique (figure 3B, SupplementalFilm 4).

l'injection intravasculaire de haut poids moléculaire marqué par fluorescence les résultats de dextran dans l'étiquetage de la lumière vasculaire, mais non marqués circulant érythrocytes et des leucocytes occlure le dextran. Dans les petits capillaires du poumon, de l'occlusion est totale résultante dans un clignotement du signal de dextran et une perte de définition des limites du système vasculaire (figure 4, à gauche; film supplémentaire 5). La stabilité spatiale fournie par ce protocole permet l'étalement du temps de la voie sanguine, sans flou, rétablissant ainsi les occlusions temporaires. Les autres canaux de signaux peuvent ensuite être superposées sur la vascularisation de fournir une vision claire des limites du navire (figure 4, à droite; Supplemental Film 6).

Figure 1
Figure 1:. Structure du système de vide sous vide Maison est utilisé et mis à niveau défini avec un régulateur de vide. Dans un ballon de capture empêche la contamination du système de régulation et de vide par des fluides corporels. Un tube mince et flexible transmet le vide à une coupe de pointe de la pipette pour entrer dans l'orifice d'aspiration de la fenêtre d'imagerie. La fenêtre d'imagerie est en forme dans une rainure en retrait dans la plaque d'imagerie en maintenant sa stabilité de position par rapport à l'objectif de microscope. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Simple imagerie cellulaire dans le poumon (A) Toujours à partir d' un film laps de temps d'une seule cellule de tumeur dans le lit capillaire du poumon 24 h après veine de la queue.injection. (Vaisseaux sanguins Rouge =, cellules Vert = tumorales, Cyan = Macrophages) (B) imagerie stable permet trois reconstruction de dimension des données d'imagerie au fil du temps. Les vaisseaux sanguins ont été de temps en moyenne pour plus de clarté. (Vaisseaux sanguins Rouge =, Vert = cellules tumorales, bleu = Macrophages). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: La stabilité du poumon Permet à haute résolution, Grand-champ de vision d' imagerie dans le poumon par l'acquisition et Broder séquentielle Ensemble de Multiple Low Grossissement Fields (A) 5 x 5 mosaïque représentant un champ de vision de 890 um. une lésion métastatique dans les poumons 12 jours après l'injection dans la veine caudale des cellules tumorales prise à 15 um sous la surface du poumon(Panneau de gauche). Panneau de droite montre la même lésion métastatique à 25 um sous la surface du poumon. (B) Les champs de haute résolution individuelles révèlent des processus intracellulaires tels que l' alignement chromosomique (flèches jaunes) et de séparation (flèches rouges) pendant la division cellulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Injection intravasculaire de fluorescence Étiqueté haut poids moléculaire Dextran Marques Lumen de la vascularisation Sauf quand Unlabeled érythrocytes et d' autres cellules circulantes obturer les (A) les résultats de Occlusion Fluorescence Signal dans un étiquetage incomplet qui se déplace dans le temps résultant en un effet obscurcissant clignotant. les limites des navires. (B) La hautela stabilité spatiale de la fenêtre sous vide permet le canal de sang à moyenne dans le temps, en remplissant les occlusions temporaires et définissant clairement les limites des vaisseaux. Les autres canaux sont ensuite superposées sans moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

An Premier auteur / Dernier auteur Animal Chirurgie Type d'imagerie Remarques
1926 Wearn et Allemand Chats paroi thoracique coupé à la couche pleural. Deuxième ouverture faite à travers le diaphragme vers le bas pour plèvre pour l'éclairage. La microscopie à champ lumineux. Première «fenêtre» à travers la paroi pleural.
1939 Terry Chats Les côtes sont séparées, 1. Fenêtre implanté, air retiré du thorax avec le vide. microscope binoculaire et de la peau en utilisant un éclairage polarisé. Tout d'abord implanté fenêtre optique. vide utilisé pour dessiner des tissus à la fenêtre.
1963 de Alva & Rainer Lapins & Dogs Un ou deux nervures sont réséqués et 1. Fenêtre insérés et suturées à la paroi thoracique. Peau a été fermé sur la fenêtre et l'animal a permis de guérir. Avant l'imagerie, la peau a été disséqué pour exposer la fenêtre. haute vitesse cinématographie stroboscopique d'occasion à travers un bas mag (11X) objectif. Première fenêtre de survie.
1965 Wagner & Filley Chiens forelimb droit retiré, une coupe de la nervure et la fenêtre insérée et suturé. La microscopie de réflexion avec l'objectif 22X. Première fenêtre relativement libre mouvement sans vide.
Wagner Chiens Un Rib est réséqué, 3 po. Fenêtre implantée. vis à brides filetées sur la fenêtre pour former joint à la paroi thoracique. microscopie Brightfield avec fort grossissement objectif 100X d'immersion dans l'huile. Première fenêtre à utiliser le vide pour stabiliser le mouvement des tissus.
1992 Groh & Goetz Lapins Une nervure réséquée, 1.2. Fenêtre implanté. vis à brides filetées sur la fenêtre pour former joint à la paroi thoracique. Le vide appliqué. microscopie épifluorescence avec objectif 25X. La première utilisation d'une fenêtre à vide avec une épifluorescence.
1994 Fingar & Wieman Les rats 2 côtes sont réséqués, 1. Fenêtre implantés et suturées à la paroi thoracique et de la peau. microscopie épifluorescence avec objectif 40X. La première fenêtre de survie chez les rats.
2000 Fuňákoshi & Mitsui Souris paroi thoracique entière enlevée. anneau d'aspiration à vide attaché à poumon droit. La microscopie confocale avec un objectif 20X. Première utilisation de la fenêtre de vide chez la souris.
2005 Lamm & Glenny Les rats paroi thoracique entière enlevée, 1. fenêtre attachée au poumon. La réflexion et la microscopie épifluorescence avec un objectif 20X. Première utilisation de la fenêtre à vide chez le rat.
2008 Tabuchi & Keubler Souris 3 côtes sont réséqués, film plastique appliqué à l'ouverture pour sceller le trou dans la paroi thoracique. Air évacué par cathéter intrapleurale. microscopie épifluorescence avec objectif 20X. Tout d'abord à utiliser un film plastique pour sceller l'ouverture dans la paroi thoracique.

Tableau 1: Enquête historique de la Develloppement de Intravitale Lung Windows Imaging. Beaucoup de nouvelles fenêtres d'imagerie du poumon intravitale ont été développés au fil des ans par le plus récent étant miniaturisés pour une utilisation chez des souris, en utilisant le vide pour la stabilisation des tissus et d'atteindre une résolution suffisante pour être capable de révéler le détail subcellulaire.

Figure supplémentaire 1: Design Dessin de la fenêtre d' imagerie à vide S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 2: Photographies de configuration du vide S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 3: Conception Drawing de l' étape Plate Insert S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce chiffre.

Figure 1 supplémentaire
Film supplémentaire 1:. Film d'images fixes dans la figure 2A (clic pour télécharger).

Figure supplémentaire 2
Déplacer supplémentaire 2:. Film de reconstruction 3D montre la figure 2B montrant différents angles de vue et la progression au fil du temps (clic pour télécharger).


Film supplémentaire 3:. Film de 5x5 mosaïque représenté sur la figure 3A à 15 um sous la surface du poumon (clic pour télécharger).

Figure supplémentaire 4
Film supplémentaire 4:. Film d'une seule cellule représentée sur la figure 3B mitose dans le poumon (clic pour télécharger).

Figure supplémentaire 5
Film supplémentaire 5: Film de la figure 4, panneau de gauche montrant l' occlusion et farrimage. (clic pour télécharger).

Figure Supplemental 6
Film supplémentaire 6:. Film de la figure 4, panneau de droite montrant la récupération de la définition vasculaire après étalement du sang (clic pour télécharger).

Fichier de code supplémentaire. Mosaic Stitching S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de code supplémentaire. Effectuer étalement du sang S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Haute résolution en imagerie optique in vivo combinée avec des étiquettes fonctionnelles marquées par fluorescence tels que des protéines et des anticorps a augmenté de façon spectaculaire notre compréhension de la cascade métastatique. Elle a permis la visualisation directe et la quantification d'une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaire dans les cellules tumorales, des cellules hôtes et leur microenvironnement. Cette imagerie au sein de la tumeur primaire a conduit, par exemple, à la découverte de microenvironnements discrets qui soutiennent soit l' invasion de la croissance ou de la diffusion 6,7. Dans le cas de l' invasion, l' imagerie in vivo a mis en évidence le rôle privilégié de la co-migratoire en continu des macrophages et des cellules tumorales dans intravasculaire 7,50.

Dans les sites secondaires comme le poumon, la compréhension de la dynamique du comportement des cellules tumorales dans les premiers stades de la métastase, y compris l'étape d'ensemencement pré-micrométastases lorsque des groupes simples et petits de cellules tumorales arrivent etinteragir avec le vaisseau sanguin endothélium, ne sera réalisé en utilisant l'imagerie optique à haute résolution. Modalités d'imagerie standards cliniques ne possèdent pas la résolution nécessaire pour visualiser soit la structure fine du lit capillaire ou de la morphologie et de l'interaction des cellules à une résolution à une seule cellule. Les techniques d'imagerie présentées dans ce protocole d'accomplir cette tâche difficile.

Fenêtres d'imagerie intravitales telles que celles énumérées dans le tableau 1 offre un avantage significatif sur les préparations ex vivo du poumon par le maintien de la physiologie pulmonaire appropriée , y compris la perfusion, la connexion au système immunitaire et offrir plus que juste une vision statique de la dynamique cellulaire. Le vide stabilisé fenêtres en particulier offrent un niveau de stabilité des tissus qui permet l'acquisition d'images hautement enregistrés, ce qui permet trois reconstructions tridimensionnelles (figure 2B) et la capacité d' un grand domaine de l' imagerie vue de la mosaïque (Figure 3A). Ensemble , ceux - ci fournissent une gamme de points de vue du poumon, d'une vue à faible grossissement de type histologique qui donne à la morphologie des tissus, à une vue cellulaire sous qui peut même révéler la séparation chromosomique et discriminer les cellules tumorales dormantes et de division (Figure 3B). Plusieurs canaux d'acquisition permettent plusieurs types de cellules et de leurs interactions pour être visualisées simultanément (figure 2A).

Bien que le protocole ne prend une certaine habileté technique, la pratique et l'attention sur certaines étapes critiques et des points permettra d'améliorer le taux des temps de procédure et d'imagerie jusqu'à 12 h le succès peut être attendu. Il est essentiel de vous assurer que le tissu pulmonaire est bien centré sur la fenêtre (étape 4.25). Ceci assure que le vide est appliqué uniformément et complètement à travers le tissu pulmonaire (étape 4.27). Le défaut de centrage du tissu entraîne un mouvement du tissu. Le harnais de retenue (figure supplémentaire 2) est utilisé to réduire le mouvement induit par la constriction des muscles intercostaux pendant les respirations naturelles de l'animal prend. Il doit être bien ajusté sur la souris, mais pas compresser la poitrine. Trop de compression exerce une pression sur tous les lobes des poumons, ainsi que le coeur et se traduit par une diminution de la viabilité de la souris. Si dextran est pas observé circulant dans la vascularisation pulmonaire après injection (étape 5.8), le tissu pulmonaire est soit endommagé par une mauvaise manipulation lors de la chirurgie ou le niveau de vide est trop élevé. Abaisser le vide par .5-1 pouces Hg peut être tenté de voir si le débit est rétabli. Si le débit est pas rétablie, ou s'il y a écoulement, mais dextran est observé extravasculaire, le tissu pulmonaire a été endommagé dans cette région et il sera nécessaire à l'image d'un champ de vue différent. Maintien de la circulation sanguine dans la région d'imagerie est important de veiller à ce que la physiologie appropriée est mesurée. Etant donné que l'oxygène est fourni au tissu à l'intérieur des alvéoles et non à travers le canal déférentculature, l'hypoxie ischémique est peu probable. Pourtant, vasculature unperfused peut potentiellement conduire à l' oxygène altéré / CO 2 niveaux et permettra également d' éviter leucocytes circulants d'atteindre le tissu d'intérêt. Visualisation des érythrocytes fluides peut être utilisé comme un indicateur de la fonction appropriée du poumon. Le tissu pulmonaire est très délicate et également sensibles à la photo-dommages. Si après le temps du flux sanguin d'imagerie lapse arrête dans le champ imagé, le laser est le plus susceptible d'imagerie trop élevé et ultérieur d'autres champs doit être fait au plus faible puissance. Nous avons trouvé ~ 10-15 mW à l'échantillon pour produire des images suffisamment vives sans photodamage lors de l'utilisation soit GFP ou Clover (qui a quatre fois la luminosité moyenne) des cellules transfectées. les niveaux de luminosité minimum pour les protéines fluorescentes sont fortement dépendant des paramètres de microscope et les niveaux d'expression dans les cellules et doivent être testés de manière empirique.

Dans ce protocole, les cellules tumorales sont marquées avec un brillant cytoplasprotéine fluorescente micro qui offre une vue dégagée sur le corps de la cellule et des espaces intracellulaires qui excluent la protéine (ie noyau). Les macrophages sont marqués en utilisant un modèle de souris transgénique syngénique à des cellules tumorales. Étiquetage les deux types cellulaires permet la visualisation de leur interaction directe en temps réel. La durée prolongée de l'imagerie permet de quantifier la fréquence, la durée et de l'étendue avec laquelle les cellules cancéreuses interagissent avec les macrophages dans un contexte physiologique pertinent.

Quand elle est réalisée correctement, cette procédure permet une connexion à canaux multiples, haute résolution, imagerie de mouvement, une seule cellule dans le poumon intact pendant des périodes allant jusqu'à 12 heures. L'utilisation d'une ouverture numérique objectif élevé comme le 25X 0.95NA et les capacités de l'multiphotonique pour le zoom électronique permet l'imagerie optique la plus élevée de la résolution dans le poumon vu à ce jour.

Intravasculaire injecté fluorescent, haut poids moléculaire pe dextranrforms le double rôle de l'étiquetage de l'espace vasculaire et de vérifier son intégrité. 155 kDa dextran est utilisé pour prévenir la diffusion à travers les espaces interendothéliales. Tout signe d'un manque de flux vasculaire ou de fuite vasculaire dans l'espace extravasculaire indique des dommages aux tissus en raison d'une mauvaise manipulation ou une dépression excessive.

Enfin, des techniques uniques de traitement d'image peuvent être employés qui profitent de la stabilité spatiale de ce protocole. Étant donné que les érythrocytes non marquées et autres leucocytes excluent le dextran fluorescent quand ils passent à travers les capillaires, ce signal peut être en moyenne au fil du temps pour éliminer le clignotement qu'ils créent. Cette offre une vue bien défini de la vascularisation pas possible autrement.

Les limites de cette technique comprennent à la fois la nature invasive de la chirurgie, ce qui complique potentiellement son utilisation pour l' étude des maladies qui affaiblissent l'animal (par exemple , le cancer métastatique de stade tardif,anémie aiguë falciforme), et le fait que la chirurgie est la borne qui limite l'utiliser pour une seule, quoique longue (jusqu'à 12 h), session d'imagerie. En outre, étant donné la longue durée de la session d'imagerie et de la faible réserve de glycogène hépatique de souris 51, la supplémentation en glucose peut être donné pour éviter les sources potentielles de biais dans les expériences.

Ce protocole pourrait être modifié avec des anticorps marqués par fluorescence injectables, soit en lieu et place ou en plus du dextrane afin d'étiqueter d'autres structures ou des types de cellules en temps réel. Cela permettra d'élargir les capacités d'analyse et de disséquer le microenvironnement de la tumeur en visualisant directement cellule-hôte interactions et la dynamique des cellules tumorales en temps réel.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

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References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6, (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4, (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179, (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12, (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5, (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15, (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112, (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106, (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14, (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7, (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13, (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58, (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6, (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475, (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24, (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90, (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2, (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26, (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192, (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98, (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25, (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212, (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16, (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12, (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158, (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6, (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2, (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, (1), C1-C18 (2000).

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