Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

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Biology

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Summary

Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

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Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

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Abstract

Introduction

Dieses Dokument bietet einen zuverlässigen Assay, um die relative Zelloberflächenexpression der Membranproteine ​​wie Ionenkanäle exprimiert in rekombinanten Zellen unter Verwendung der bestehenden Technologie Durchflusszytometrie zu melden. Ionenkanäle sind porenbildende Membranproteine, die durch Gating den Fluss von Ionen durch die Zellmembran zum Steuern elektrischer Signale verantwortlich sind. Sie werden durch den Aktivierungsmechanismus, der Natur klassifiziert und Selektivität der Ionenspezies durch die Pore queren, wo sie lokalisiert sind. Auf zellulärer und Gewebespiegel, die makroskopischen Ionenflüsse durch Ionenkanäle sind das Produkt von biophysikalischen (Gating und Permeation), biochemische (Phosphorylierung) und Biogenese (Synthese, Glykosylierung, Menschenhandel und Abbau) Eigenschaften 1. Jedes dieser Verfahren ist einzigartig für jede Art von Ionenkanälen und optimiert wird, um die physiologische Rolle des Ionenkanals zu erfüllen. Folglich Veränderungen in jedem dieser fein abgestimmten Prozesse durch einevererbte oder eine genetische Modifikation, die oft als "Ionenkanal" kann zu Zellhomöostase schädlich sein. Es ist wichtig zu betonen, dass an der Zelloberfläche, die "richtige" Menge an Ionenkanälen liefern zu Zellhomöostase kritisch ist. Selbst kleine Erhöhungen (Gain-of-function) und geringe Abnahmen (loss-of-function) in Ionenkanalaktivität haben das Potenzial, eine ernsthafte Pathologie im Laufe eines Lebens zu verursachen. Defekte in der Zelloberfläche Lieferung von reifen Ionenkanäle ist ein wichtiger Faktor in zahlreichen channelopathies, wie zystischer Fibrose (CFTR Ionenkanal) 2 und Herzrhythmusstörungen des Long - QT - Syndrom Form (kardiale Kaliumkanäle) 3.

Kanalopathien sind mit Herz plötzlichen Tod 4 verbunden. Die aktuelle weltweite Prävalenz aller Herz channelopathies wird angenommen , mindestens 1: 2,000-1: etwa die Hälfte des plötzlichen Herztods arrhythmic ca. 3.000 pro Einzel 5 und sind verantwortlichses 6. Dysfunction in Herzspannungsabhängigen Natrium-, Kalium- und kalzium selektive Ionenkanäle sind dafür bekannt, eine Schlüsselrolle in diesem Prozess spielen. Der L-Typ - Ca V 1.2 spannungsabhängigen Calcium - Kanal erforderlich synchronisiert Herzmuskelkontraktion zu initiieren. Der Herz L-Typ - Ca V 1.2 - Kanal ist ein Multi-Untereinheiten - Proteinkomplex , bestehend aus dem Hauptporenbildenden Ca V α1 - Untereinheit und Ca V SS und V Ca α2δ1 Hilfsuntereinheiten 7-12. Beachten Sie, dass die volle Ergänzung der Hilfsuntereinheiten funktionellen Ca V 1.2 Kanäle an der Plasmamembran und dynamische Wechselwirkungen zu erzeugen erforderlich ist zwischen diese Untereinheiten sind wichtig , die normale elektrische Funktion des Herzens 13 zu unterstützen. Ca V ß fördert die Zelloberflächenexpression von Ca V 1.2 Kanäle , durch eine nicht-kovalente nanomolar hydrophobe Interaktionschromatographie 14. Die Co-Expression des Ca V α2δ1 Untereinheit with Ca V ß-gebundene Ca V α1 stimuliert Spitzenstrom Ausdruck (5 bis 10-fach) und fördert Kanalaktivierung bei negativeren Spannungen. Gain-of-function Mutationen des porenbildende Untereinheit Ca V 1.2 haben mit einer Form von ventrikulären Arrhythmien sogenannte Long - QT - Syndrom 15 , während eine Vielzahl von Punktmutationen in den drei Hauptuntereinheiten bilden , die L-Typ - Ca V 1.2 Kanal zugeordnet worden wurden bei Patienten leiden unter Arrhythmien des Short - QT - Syndrom Form 16,17 identifiziert. Ionenkanäle sind Membranproteine, die aus biochemischer Sicht (Proteinchemie) oder mittels elektro Tools (Stromerzeugungsmaschinen) und häufig diese komplementären Ansätzen untersucht werden können. Electrophysiology, insbesondere Ganzzell - Patch-Clamp ist ein geeigneter Ansatz , um die Funktion von Ionenkanälen 15 zu erläutern , aber nicht lösen können Modifikationen in den Proteintransport durch Veränderungen in ihren biophysikalischenEigenschaften. Proteinchemie hat jedoch häufig den Einsatz aufgrund der relativ geringen Expression großer Membranproteine ​​in Bezug auf kleinere lösliche Proteine ​​beschränkt. Robuste Hochdurchsatzverfahren Fluoreszenzablesung unter Verwendung müssen entwickelt werden, um gezielt Defekte in Proteinbiogenese adressieren Veränderungen in der Zelloberflächenexpression von Ionenkanälen verursacht.

Die Durchflusszytometrie ist ein biophysikalischen Technologie in Zellzählung eingesetzt, das Sortieren, den Nachweis von Biomarkern und Protein - Engineering - 18. Wenn eine Probenlösung von lebenden Zellen oder Partikel in einem Durchflusszytometer eingespritzt wird, werden die Zellen in einen einzigen Strom bestellt, die von der Maschine des Detektionssystems (Figur 1) untersucht werden können. Die erste Durchflusszytometer Instrument 1956 erzeugt 19 detektiert nur einen Parameter , aber moderne Durchflußzytometer weisen mehrere Laser und Fluoreszenzdetektoren, die den Nachweis von mehr als 30 Fluoreszenzparameter 20,21 ermöglichen.Filter und Spiegel (Emissionsoptik) lenken das Licht streuen oder Fluoreszenzlicht von Zellen an ein elektronisches Netzwerk (Photodiode und Detektoren), die das Licht proportional zu seiner Intensität umwandeln. Digitale Daten werden mit spezieller Software analysiert und die primäre Ausgabe wird als Punkt - Diagramm 21 angezeigt.

Abbildung 1
Abb . 1: Biophysical Prinzipien der Durchflusszytometrie Sortieren einzelner Zellen werden durch eine Düse unter hohem Druck in einem Strom von Hüllflüssigkeit geschoben , der sie bewegt sich über eine oder mehrere Laserabfragepunkten. Der Lichtstrahl wird durch die vorbeifahrenden Zellen umgelenkt und das Licht in der Vorwärtsrichtung gesammelt (Forward Scatter, FCS) auf eine Fotodiode geschickt, die das Licht in ein Signal proportional zur Größe der Zelle umwandelt. Das Licht wird auch in einem 90 ° Winkel zu dem Laserpfad und an Detektoren (auch als Photomultiplier (PMT)) gesammelt.Dieses Licht wird durch den dichroitischen Spiegel geleitet, die die Erkennung des Seitenstreusignal (SSC) zu ermöglichen, die die Granularität innerhalb der Zellen widerspiegelt, und die Fluoreszenzemissionen, wenn erregt Fluorochrome in der Zelle vorhanden sind. Drei Detektoren (grün, gelb und rot) mit unterschiedlichen Wellenlängen-Bandpassfilter dargestellt, so dass die gleichzeitige Detektion von verschiedenen Fluorochromen. Die unterschiedlichen Signale werden von einem externen Computer digitalisiert und in Daten umgewandelt, die die Eigenschaften der Zellen zu quantifizieren analysiert werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Hochdurchsatzkapazität von Durchflusszytometer wurde die relative Membranexpression von rekombinanten Wildtyp und des Handels-defizienten spannungsabhängigen L-Typ - Ca V 1.2 Kanäle und die damit verbundenen Untereinheiten in lebenden Zellen zu quantifizieren ausgebeutet. cDNA-Konstrukten coding für die Proteine ​​wurden doppelt markiert, um gleichzeitig eine extrazelluläre nichtfluoreszierenden Epitop tragen, die durch eine undurchlässige fluoreszierenden konjugierten Antikörper und einem intrazellulären Fluorophor die konstitutiv fluoresziert detektiert werden kann. Sowohl das extrazelluläre Epitop in einer extrazellulären Schleife des Proteins eingeführt ist, und die intrazelluläre Fluorophor, eingesetzt nach dem C-Terminus mit dem Protein translatiert. In dieser Serie von Experimenten wurde die Ca V α2δ1 proteintechnisch eine extrazelluläre Hämagglutinin (HA) -Epitop (YPYDVPDYA) durch eine undurchlässige FITC (Fluorescein - Isothiocyanat) -konjugiertem anti-HA und mCherry als Intrinsische intrazellulärem Fluorophor detektiert auszudrücken. Um die relative Zelloberflächenexpressionsniveau des mCherry-Ca V α2δ1 HA-markiertes Protein, rekombinante Zellen, die das Fusionsprotein bestimmen , wurden nach der Transfektion geerntet, und gefärbt mit FITC-konjugierten monoklonalen Maus - anti-HA - Epitop - Tag Antibody (Abbildung 2). FITC ist eine organische Fluoreszenzverbindung, die wesentlich kleiner als Enzym-Reporter ist und deshalb nicht so wahrscheinlich mit biologischen Funktion zu stören. mCherry- Ca V α2δ1-HA überexprimiert in Tsa-201cells, erzeugt eine signifikante 3-log Anstieg der FITC - Fluoreszenz und mCherry Fluoreszenz auf zweidimensionalen Plots 22. Da die HA-Epitop in der extrazellulären Teil des Proteins befindet, erhalten die Fluoreszenzintensität für FITC in Gegenwart von intakten Zellen spiegeln die relativen Index der Zelloberflächenexpression von HA-markierten Proteins. Die Zugänglichkeit des HA-Epitops in den Konstrukten wird durch Messung des FITC Signals nach Zellpermeabilisierung systematisch validiert. Auch diese Maßnahme dient der normalisierten Gesamtproteinexpression zu untermauern, da die relativen Fluoreszenzintensitäten für FITC in permeabilisierten Zellen geschätzt sind qualitativ vergleichbar mit den relativen Fluoreszenzwerte for mCherry gemessen unter permeabilisiert und nicht-permeabilisierten Bedingungen 22,23. Es ist wichtig zu beachten, dass die intrinsische Fluoreszenzspektrum zu höheren Werten nach Permeabilisierung verschoben wird, sondern daß der einzige Wert angegeben wird, ist die Änderung in der Fluoreszenzintensität in Bezug auf die Kontrollkonstrukt verglichen. Relative Änderungen in der Fluoreszenzintensität für die Testkonstrukte werden geschätzt die ΔMean Fluoreszenzintensität unter Verwendung von (ΔMFI) Werte für jedes Fluorophor (mCherry oder FITC). Experimente werden die Fluoreszenzintensität des Testkonstrukts relativ zur Fluoreszenzintensität des Kontrollkonstrukts unter den gleichen Bedingungen exprimiert zu messen experimentellen Variationen in der intrinsischen Fluoreszenz des Fluorophors-konjugierten Antikörper zu begrenzen. Zwei Membranproteine wurden erfolgreich mit diesem Test untersucht: das porenbildende Untereinheit des L-Typ spannungsabhängigen Calcium - Kanal - Ca V 1.2 14,22 und in einer anderen Reihe vonExperimente, 22,23 die extrazelluläre Hilfs Ca V α2δ1 Untereinheit. Das folgende Protokoll wurde verwendet , um die Zelloberflächenexpression des Ca V α2δ1 Untereinheit des Herz L-Typ - Ca V 1.2 Kanal unter Kontrollbedingungen und nach Mutationen zu bestimmen , die posttranslationale Modifikation des Ionenkanals beeinflussen. Unter genormten Versuchsbedingungen erhöht die Zelloberfläche Fluoreszenz von FITC quasi-linear mit der Expression der cDNA kodierend für die mCherry-Ca V α2δ1-HA - Proteine (Abbildung 5 aus Lit. 22).

Figur 2
Abbildung 2:. Schematische Darstellung der gesamten und der Membran Kennzeichnung in der Durchflusszytometrie Versuchsprotokoll Das Schema beschreibt einige der wichtigsten Schritte notwendig , um die relativen Gesamt und Zelloberflächenexpression von rekombinanten Ionenkanäle durch fl zu quantifizierenow-Zytometrie. Zellen werden mit dem doppelt markiert Konstruktion mCherry-Ca V α2δ1-HA in TSA-201 - Zellen transfiziert (1) und gefärbt vor oder nach der Permeabilisierung (2). Multi Daten werden in einem Durchflusszytometer (3) für multivariate Analyse (4) übernommen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protocol

1. Doppelt Tagged DNA-Konstrukte

  1. Legen Sie die HA - Epitop (YPYDVPDYA) in der extrazellulären Linker von Ca V α2δ1 zwischen D676 und R677 durch ortsgerichtete Mutagenese (3B) 20. Verwenden Vorwärtsprimer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC und Reverse-Primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
  2. Subklonierung der cDNA - Sequenz des markierten HA Ca V α2δ1 in den Säuger pmCherry-N1 - Expressionsvektor , der das Protein an den N-Terminus von mCherry zwischen den SacI- und SalI - Stellen (3B) 20 verschmolzen auszudrücken.
    HINWEIS: Geeignete Kanalfunktion muss mit dem Kontrollkonstrukt unter Verwendung von Standard - elektrophysiologischen Methoden 24 getestet werden.

2. Liposom-vermittelte transiente Transfektion (30 min, sind alle Schritte ausgeführt unter Laminar Flow Hood)

  1. Tag 1: Platte, die eine halbe Million von tsa-201-Zellen (oder HEKT) in35 mm Kulturschalen mit 2 ml Dulbeccos hohem Glucoseminimalmedium (DMEM-HG), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS) Kulturmedium. Zählen von Zellen einen Standard Hemacytometer verwenden. Beurteilen, die Lebensfähigkeit der Zellen von einem Bruchteil der Zellprobe unter Verwendung von Trypan Blau. Platte genügend Zellen 90% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen.
  2. Tag 2: Ändern Kulturmedium mit 2 ml frischem vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium ohne PS.
  3. Für jede Transfektion Probe, bereiten zwei 1,5-ml-Röhrchen. In Rohr 1, verdünne 4 ug DNA in 250 ul reduzierten Serummedium. Im Rohr 2, Mischungs 10 ul der Liposomen-vermittelte Transfektion Reagenzes mit 250 & mgr; l serumreduziertes Kulturmedium. Vorsichtig mischen die Transfektionsreagenz vor dem Gebrauch.
  4. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Kombinieren des Inhalts des Rohres 1 und dem Rohr 2, vorsichtig mischen und Inkubieren mindestens 20 min bei Raumtemperatur.
  6. Fügen Sie die Liposomen / DNA-Komplexe zu den kultivierten Zellen und sanft die Kulturschale Rock zu mischen.
  7. Unter 5% CO 2 -Atmosphäre für 24 h bei 37 ° C inkubieren.

3. Anfärben von Zellen für die Durchflusszytometrie (3 Stunden)

  1. Vorbereiten von Zellproben
    1. Tag 3: Entfernen Medium aus der Kulturschale vorsichtig und wasche die Zellen mit 400 & mgr; l vorgewärmtes (37 ° C) 0,05% Trypsin-EDTA 1x (Ethylendiamintetraessigsäure).
    2. Werden 400 & mgr; l Trypsin-EDTA und Inkubation die Schale bei 37 ° C unter 5% CO 2 -Atmosphäre für 5 min Zellen zu ermöglichen , von der Schale zu lösen.
    3. Stoppen Sie die Enzymverdauung durch Zugabe von 1 ml kaltem Kulturmedium ohne PS und auswaschen alle Zellen von der Oberfläche durch Pipettieren vorsichtig 4-5 mal. Vermeiden Sie Über Verdauung und über Pipettieren Zelltod zu reduzieren.
    4. Sammeln Zellen in 1,5-ml-Röhrchen und legen Sie sofort auf Eis. Verwenden Sie eiskalten Lösungen und halten Sie die Zellen bei 4 ° C, um die Internalisierung zu verhindernvon Oberflächenantigenen. Verringern Beleuchtung Photobleaching des Fluoreszenzsignals zu begrenzen.
    5. Zentrifugenröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. absaugen und entsorgen Sie vorsichtig den Überstand.
    6. Resuspendieren des Pellets in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung 1x (PBS), um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
    7. Kurz die Röhrchen Wirbel sehr sanft und wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 und 3.1.6 vollständig Kulturmedium zu entfernen.
    8. Resuspendieren des Pellets in 600 ul 1x PBS und stellen die Zellkonzentration auf ein Minimum von 3 x 10 6 Zellen / ml.
    9. Teilen Sie die Zellen in zwei neue 1,5-ml-Röhrchen für extra- und intrazellulären Färbung. Fügen Sie die entsprechenden Kontrollen spezifische Färbung von nicht-spezifische Färbung zu unterscheiden.
      HINWEIS: Die Isotypkontrollantikörper hilft das Niveau der Hintergrundfärbung zu bewerten und im Idealfall jeder primären Antikörpers Wirtsarten, Isotyp und Fluorophore übereinstimmen sollte. Verwenden Sie Isotypenkontrolle und konjugierte Antikörper mit der gleichenProteinkonzentration.

Tabelle 1
Tabelle 1: Durchfluss-Zytometrie Experiment Kontrollproben für nicht-permeabilisierten und permeabilisierten Zellen Jedes Experiment benötigt folgende negative Kontrollen enthalten: (1) . Untransfizierten Zellen (ohne Antikörper, mit dem Isotyp oder mit dem konjugierten Antikörper). (2) Die transfizierten Zellen mit dem Protein von Interesse , subkloniert in ein Plasmid ohne konstitutive intrazelluläre Fluoreszenz Fluorochrom (pCMV- Ca V α2δ1-HA) oder mit dem doppelt tagged Konstruktion (pmCherry-Ca V α2δ1 beimpft und ohne Antikörper, mit dem Isotyp oder der konjugierte Antikörper). Einfarbige Kontrollen werden zur Kompensation von Fluorochrom Emissions Überlappung verwendet. Die gleichen Kontrollen laufen für Nicht-permeabilisierten und permeabilisiert Bedingungen in jeder Reihe von Experimenten.

  1. Zelloberflächenfärbung von Intactlebenden Zellen
    1. Aliquot 1 x 10 6 Zellen / 100 ul in 1,5 - ml - Röhrchen.
    2. Fügen Sie die FITC-konjugierten monoklonalen anti-HA-Antikörper mit 5 ug / ml und vortex, bevor die Zellen auf einem Schüttler (200 rpm) im Dunkeln bei 4 ° C für 45 min inkubiert wurde.
      HINWEIS: Die optimale Konzentration des Antikörpers in der Vortitration Experimenten bestimmt (Abbildung 4).
    3. Entfernen Sie die Zellen, die aus der Dunkelheit und fügen 900 ul 1x PBS / Rohr. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C.
    4. Aspirieren den Überstand und das Pellet in 1 ml 1x PBS, Vortexen und Zentrifugieren bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C.
    5. Wiederholen Sie den Wasch (Schritt 3.2.4) zweimal um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Wenn ein unkonjugiertes primären Antikörper verwendet wird, mit dem geeigneten sekundären Antikörper inkubiert.
    6. Nach dem letzten Waschen, um die Zellen in 500 ul 1x PBS resuspendieren und die Einzelzellsuspension in 5 übertragen ml-Zytometrie Rohre fließen. Halten Sie die Zelles im Dunkeln bei 4 ° C, bis die Probe läuft.
    7. Führen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer. Für die besten Ergebnisse analysieren, um die Zellen auf dem Durchflusszytometer so bald wie möglich und spätestens 24 Stunden nach.
  2. Intrazelluläre Färbung: Fixierung, Permeabilisierung und Anfärben
    1. Aliquot 1 x 10 6 Zellen / 100 ul in 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 400 g für 5 min bei 4 ° C.
    2. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 100 ul Fixierung-Permeabilisierung Lösung direkt ab Lager.
    3. im Dunkeln inkubieren 20 min bei 4 ° C.
    4. Zugabe von 100 ul frisch 1x Permeabilisierung Waschpuffer hergestellt (verdünntes 10x Permeabilisierung-Waschpuffer in destilliertem H 2 O). Zellen Vortex und Sediment einer Tischzentrifuge bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C verwendet wird.
    5. Absaugen und den Überstand verwerfen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.4 und 3.3.5.
    7. Hinzufügen FITC-konjugierten monoklonalen anti-HA-Antikörper bei 5& mgr; g / ml in 100 & mgr; l Waschpuffer Permeabilisierung-1x und vortex bevor die Zellen im Dunkeln bei 4 ° C für 30 min inkubiert wurde.
      HINWEIS: Die intrazelluläre Färbung wird nach dem gleichen Verfahren wie die für die Zelloberflächenfärbung verwendet, durchgeführt. Saponin-vermittelte Zellpermeabilisierung ist jedoch ein schnell reversibler Prozess, daher ist es wichtig, 1x PBS mit 1x Perm / Waschpuffer zu ersetzen während die intrazelluläre Färbung der Zellen in der ständigen Gegenwart von Saponin zu halten.
    8. Entfernen Sie die Zellen, die aus der Dunkelheit und fügen 100 ul Permeabilisierung-Waschpuffer. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C.
    9. Aspirat vorsichtig der Überstand und das Pellet in 100 & mgr; l Permeabilisierung-Waschpuffer, Vortexen und Zentrifugieren bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C.
    10. Wiederholen Sie die Wäsche (Schritt 3.3.9) noch einmal um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
    11. Nach dem letzten Waschen, um die Zellen in 500 ul 1x PBS resuspendieren und die Sünde übertragengle Zellsuspension 5 ml Durchflusszytometrie Rohre. Halten der Zellen in der Dunkelheit bei 4 ° C bis Zytometer die Probe in den Strömungs einzuspritzen.
    12. Führen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer. Führen Sie die festen Proben auf dem Zytometer so bald wie möglich, jedoch spätestens 1 Woche nach dem Färben. Führen Sie die nicht-permeabilisierten und Zellen am selben Tag permeabilisiert.

4. Durchflusszytometrie

  1. Durchflusszytometer Cell Sorter Täglich Einrichtung
    1. Schalten Sie die Durchflusszytometrie-Software. Vor experimentieren, zu kalibrieren und das Setup der Durchflusszytometer Zellsortierer optimale Geräteleistung sicherzustellen (dh Laser und Optik Spezifikation durchführen, die Laser und Zelle fließen richtig ausgerichtet sind ) durch Geräteeinstellung Perlen verwenden.
    2. Verwenden Sie die 100 & mgr; m Düse mit 20 psi Hülle Druck.
      HINWEIS: Die Düse nicht auf einer Bank Durchflusszytometer geändert werden muss.
    3. Stellen Sie die Fördermenge der Zytometer nach der Hersteler Spezifikation. Außerordentlich hohe Strömungsgeschwindigkeiten wird die Empfindlichkeit bei der Erfassung von Variationen in der Fluoreszenz verringern.
    4. Wählen Sie Blau (488 nm Fluorescein Isothiocayanate oder FITC zu erregen) und gelb-grün (561 nm bis mCherry erregen) Laser. Sammeln FITC und mCherry Fluoreszenzwerte mit einem 530/30 nm und mit einem 610/20 nm Bandpassfilter sind.
    5. Erwerben Sie die Vorwärtsstreuung (FCS) im Vergleich zu Seitenstreuung (SSC) Dot-Plot für ungefärbte Zellen lineare Skala. Stellen Sie die einzelnen Verstärkung der Detektorzellen in der linken unteren Quadranten des Dot-Plot zu visualisieren.
  2. Beispiel Lesen von Intact Nicht-permeabilisierten Zellen
    1. Stellen Sie die P1gate lebende, nicht-permeabilisierten Zellen durch eine freie Form der Abgrenzung um die Zellen ohne Zelltrümmer und Zellaggregate analysiert werden, wodurch das Fluoreszenzsignal zu intakten Zellen zu begrenzen.
      Hinweis: Live / Dead-Ausschluss Farbstoffe können verwendet werden, Gate-Platzierung an lebenden Zellen zu erleichtern. Stellen Sie 10.000 Ereignisse aufzeichnenin dem Stopp Gatter P1. Setzen Sie diese auf eine höhere Anzahl von Ereignissen, wenn nötig.
    2. Erwerben Sie mCherry gegen FITC zweiparametrige Konturplot Basisautofluoreszenz von ungefärbten Zellen zu erkennen. Verwenden Sie bi-logarithmischen Skala negative Werte zu zeigen und zu verbessern Auflösung zwischen den Populationen 25. Stellen Sie die einzelnen Spannung des Detektors die ungefärbten negativen Zellen innerhalb des unteren Abschnitts der ersten zehn Einheiten der Log-Fluoreszenzintensität Plots zu setzen.
    3. Erwerben Sie alle intakten nicht-permeabilisierten Proben etabliert mit den Einstellungen auf 4.1.5 und 4.1.6 und sammeln FSC, SSC und Signale in den Fluoreszenzdetektoren.
    4. Export und speichern * .fcs Dateien zur Analyse verwendet werden soll unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse-Software.
  3. Beispiel Lesen von permeabilisierten Zellen
    1. Bewegen Sie den P1-Gate lebenden Zellen in den permeabilisierten Proben wählen und einstellen FSC und SSC-Spannung wie in 4.1.5 und 4.1.6 gezeigt.
    2. Erwerben Sie alle permeabilisiert Proben und sammeln FSC, SSC einnd Signale in den Fluoreszenzdetektoren.
    3. Export und speichern * .fcs Dateien zur Analyse verwendet werden soll unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse-Software.
  4. Datenanalyse
    1. Starten Sie die Durchflusszytometrie-Analyse-Software und Import * .fcs gespeicherten Dateien in 4.2.4 und 4.3.3.
    2. Klicken Sie auf das erste im Arbeitsbereich Fenster aufgelistet Probe. Ein neues Fenster nach dem Rohr ID-Nummer genannt wird automatisch geöffnet. Starten Sie den Gating-Prozess in der Handlung von SSC gegen FSC. Zeichnen Sie ein Tor (P1) mit dem Symbol Ellipse um lebende Zellen und beseitigen alle Ablagerungen, abgestorbene Zellen oder Aggregate, die unterschiedliche Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung als lebende Zellen haben
    3. Um die Zwei-Parameter-Konturdiagramm der mCherry (y-Achse) gegen FITC (x-Achse) Fluoreszenzintensität der lebenden Zellen zeichnen, klicken Sie zuerst auf der x-Achse und wählen Sie das FITC-A-Kanal und klicken Sie dann auf der y -Achse und die PE-mCherry-A-Kanal wählen. Klicken Sie auf das "Quad" Symbol, um den Quadranten Markierung am Rand eines zu positionierenutofluorescent Zellen in jeder Fluoreszenzkanal.
      HINWEIS: Das Tor gesetzt um die FITC und mCherry positiven Zellen ist die P2-Gate. Die Fluoreszenz negativen Zellpopulation wird als P3-Gate bezeichnet. Siehe Abbildung 5 für die repräsentative Gating - Methode in diesem Artikel verwendet.
    4. Wählen Sie P2 und P3 Tore und klicken Sie auf "Hinzufügen Statistics" Symbol im ursprünglichen Arbeitsbereich Fenster. Klicken Sie auf "Count" (Anzahl der positiven Zellen) und klicken Sie auf "Mean" (mittlere Fluoreszenzintensität jedes Fluorochrom) oder "Median" (Median Fluoreszenzintensität jedes Fluorochrom) Statistiken unter der Liste der Optionen. Klicken Sie auf "Hinzufügen Statistics" Symbol wieder. Alle diese Werte werden automatisch auf den ursprünglichen Arbeitsbereich Fenster übertragen.
      HINWEIS: Die "mittlere" wird nur verwendet, wenn die Fluoreszenzintensität einer Normalverteilung folgt. In jedem anderen Fall, klicken Sie auf den "Median" aus. so konnte MFI beziehen Fluoreszenz Intensit Meany oder Median der Fluoreszenzintensität.
      HINWEIS: Der nächste Schritt ist es, die Tore "Parameter und Statistiken für alle Proben durch das Zytometer sondiert anzuwenden.
    5. Im Arbeitsbereich Fenster, benutzen Sie die Maus, um die Tore und Statistiken Parameter per Drag & Drop auf die Linie alle Proben markiert.
    6. Generieren Sie einen Batch - Report von zweidimensionalen Konturplots (mCherry vs FITC) und Histogramme (Zelle im Vergleich zu Fluoreszenzintensität zählen) für nicht-permeabilisierten und permeabilisierten Zellen (6A - B).
    7. Aus den erzeugten Statistiken in Schritt 4.4.4, berechnen die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes Fluorochrom für die gefärbten Zellen. Aus diesem Wert subtrahieren Sie den MFI-Wert aus ungefärbten Zellen erhalten, die Oberfläche und die Gesamt Expression des Proteins von Interesse zu quantifizieren.
    8. Melden Sie die ΔMFI Werte für jeden Fluorophor (mCherry und FITC) (6C - D). Normalisieren der ΔMFI für die Ca gemessen HINWEIS: Der Absolutwert der Fluoreszenzintensität kann variieren stark in Abhängigkeit von der Charge von Antikörpern und die technischen Fähigkeiten jedes Laborant, daher die Notwendigkeit, die Fluoreszenzintensität des mutierten Konstrukt mit dem WT-Konstrukt zu normieren.

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Representative Results

Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Protokoll Gesamt- und Zelloberfläche von rekombinanten Ionenkanäle in Tsa-201cells durch eine Zweifarben-Durchflusszytometrie-Assay ausgedrückt zu quantifizieren. Als Beispiel wurde die relative Zelloberfläche und die Gesamtproteinexpression für die Ca V α2δ1subunit quantifiziert. Um wurde die Zweifarben - Durchflusszytometrie - Assay, Ca V α2δ1 doppelt auszuführen getaggt eine extrazelluläre nichtfluoreszierenden Epitop HA zu exprimieren , das von einem anti-HA FITC-konjugierten Antikörper und einem konstitutiven fluoreszierendes intrazellulärem mCherry Fluorophor detektiert werden kann. Die Anregungs- und Emissionsspektren für FITC und FITC mCherry zeigen, dass mit 88% Wirkungsgrad durch den 488 nm-Laser angeregt wird, aber die Effizienz verringert sich auf 0% mit dem 561-nm-Laser. Die mCherry zeigt 63,9% seiner maximalen Fluoreszenz , wenn sie mit dem 561 - nm - Laser , aber nur 7,6% mit dem 488 - nm - Laser (3) angeregt wird . Die Anregungs- und Emissions spectra für beide Fluorophore weisen eine optimale Lichtsammlung und eine minimale Überlappung mit den verschiedenen Lasern und ausgewählten Filter. Durchflußzytometrie - Assays quantitative Informationen über die relative Expression von Membranproteinen aus einer großen Zellpopulation , solange der MFI für die gegebene Fluorochrom liefern könnte , ist direkt proportional zur Proteinexpression von Ca V α2δ1 an jeder Zelle eher als die Anzahl der fluoreszierenden Zellen. Dies beinhaltet eine Konzentration von Fluoreszenz-konjugierte Antikörper jenseits der Sättigung verwendet wird. Die Titrationskurve für die anti-HA FITC-konjugierten Antikörperbindung an Ca V α2δ1 (Bild 4) zeigt drei Phasen. Während keine Fluoreszenz in der ersten Phase festgestellt wurde, stieg die Fluoreszenzintensität exponentiell Antikörperkonzentration in der zweiten Phase mit zunehmendem. Nach dem Sättigungspunkt (dritte Phase) hat die Konzentration des Antikörpers Erhöhung keine Wirkung auf die relative Fluoreszenz intensität (RFI) von FITC. Die anti-HA FITC-konjugierten Antikörper Sättigungspunkt wurde bei 5 & mgr; g / ml festgelegt, wodurch sichergestellt wird, dass die Konzentration des konjugierten-Antikörper wird in den Experimenten, die die MFI nicht beschränkend.

Das markierte Ca V α2δ1was in Tsa-201cells exprimiert und Durchflußzytometrie - Assays wurden in Gegenwart des FITC-konjugierten anti-HA in nicht-permeabilisierten Zellen (Figur 5) durchgeführt. Geeignete Kontrollen (Tabelle 1) wurden auf dem Durchflusszytometer analysiert , die xy - Werte für jede Zelle , die durch den Laserstrahl Attributen. Die Zellverteilung auf Dot - Plots (5A) sichtbar gemacht . FCS / SSC Dot - Plots bestätigen , dass die Herstellung von Zellproben bietet eine einzige Zellsuspension mit hoher Rentabilität (Abbildung 5Ba). Die ausgewählte Gate für lebende Zellen (P1) stellt 75% der Gesamtzahl der untersuchten Zellen. Die Gesamtproteinexpression of Ca V α2δ1 in tsa-201 - Zellen wurde als zur mCherry Fluoreszenz proportional zu sein. Wie in den mCherry gegen FITC Konturdiagramme und Histogramme gesehen (Abbildung 5Bb - Bc), 47 2% tsa-201 Zellen , die mit pmCherry-Ca V α2δ1-HA wurden deutlich zum Ausdruck bringen mCherry Fluoreszenz sowie die signifikante FITC Fluoreszenz aufgrund gefunden die Bindung an das externe HA tag von Ca V α2δ1 in nicht-permeabilisierten Zellen. Negative Kontrollexperimenten ohne Antikörper oder mit dem Isotyp durchgeführt wurden, zeigen, dass das FITC nur oder vor allem auf den positiv transfizierten Zellen bindet.

Dieses Protokoll wurde verwendet , um die Rolle der N-Glykosylierung auf Gesamt- und Zelloberflächenexpression von Ca V α2δ1 in Tsa-201cells 23 zu charakterisieren. Experimente wurden in nicht-permeabilisierten Zellen durchgeführt, die Zelloberflächenexpression zu beurteilenund in permeabilisierten Zellen, die Gesamtproteinexpression zu bewerten, sowie die Zugänglichkeit des HA-Epitops bestätigt. Relative Expression von Ca V α2δ1 wurde berechnet auf der Grundlage der MFI für jeden Fluorophor geschätzt (mCherry oder FITC). ΔMFI Werte für die Mutanten wurden auf den Maximalwert normiert am selben Tag gemessen mCherry-Ca V α2δ1-HA WT unter den gleichen Bedingungen ausgedrückt. Dies ist wichtig, um Schwankungen im Laufe der Zeit in der absoluten Fluoreszenzintensität der anti-HA FITC konjugierten Antikörper zu berücksichtigen. Wie in 6A zu sehen ist , war die ΔMFI für FITC in nicht-permeabilisierten Zellen stark für die WT und die 4xNQ konstruieren , aber nahe dem Hintergrundfluoreszenzniveau für den 16xNQ Konstrukt angibt , dass das Protein , das aus der Plasmamembran nahezu abwesend ist. Assays nach Zellpermeabilisierung durchgeführt, zeigte, daß die Gesamtproteinexpression des 16xNQ Konstrukt wurde ebenfalls deutlich, ob es vermindertaus der FITC - Fluoreszenz in permeabilisierten Zellen oder aus dem konstitutiven mCherry Fluoreszenz wurde in nicht-permeabilisierten und in permeabilisierten Zellen (- D 6C) gemessen gefolgert. Wie in 6B zu sehen ist , erhöhte die zelluläre Autofluoreszenz - Spiegel nach Zellpermeabilisierung, der Vergleich der absoluten Fluoreszenz - Werte zwischen intakten nicht-permeabilisierten und permeabilisierten Zellen verhindert. Die ΔMFI Fluoreszenz für mCherry gemessen war bei beiden nicht permeabilisiert und permeabilisierten Zellen bedeutet, dass die Permeabilisierung Lösung nicht die relative Fluoreszenzsignal von mCherry verändern. Mutationen der N-Glykosylierungsstellen wurden mit einer Abnahme in der Fluoreszenzintensität zugeordnet ist, um mCherry Stütz der veröffentlichten Beobachtung , dass das Protein Biogenese / Stabilität wurde 23 reduziert. In dieser Serie von Experimenten stellte sich die relative Fluoreszenzsignal für FITC gemessen in permeabilisierten Zellen heraus zu be noch kleiner als die relative Signal für mCherry was darauf hindeutet, dass der N-Typ-Glykosylierung Status des Proteins die Fluoreszenzintensität durch die FITC-konjugiertem anti-HA-Antikörper in der extrazellulären Domäne erkannt beeinflussen könnten. Insgesamt sind die Veränderungen der relativen Fluoreszenz von FITC vor dem nach dem Zellpermeabilisierung eine zuverlässige metrische Proteinexpression zu quantifizieren.

Figur 3
Abbildung 3:. FITC und mCherry ein geeignetes Paar von Fluorochromen für Zweifarben - Zytometrie Assays Anregung (leere Kurven) und Emissionsspektren (gefüllte Kurven) für FITC Anregung mit 488 nm blauen Laser (Aa) und mCherry angeregt mit 561 nm gelb- bilden grünen Laser (Ab). FITC und mCherry Fluoreszenz wurden mit einem 530/30 gesammelt nm und einem 610/20 nm bandpass-Filter sind. Die Wellenlänge der verschiedenen Lasern (farbige senkrechte Linien) und die Filter (farbige Rechtecke) werden für eine optimale Lichtsammel und minimaler Überlappung gewählt. (B) Schematische Darstellung der mCherry-Ca V α2δ1-HA - Protein. Ca V α2δ1 doppelt markiert wurde eine extrazelluläre nicht-fluoreszierende Epitop HA auszudrücken , die von einem Anti-HA FITC-konjugierte Antikörper und einem konstitutiven fluoreszierenden intrazellulär mCherry Fluorochrom nachgewiesen werden können. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abb . 4: Titration von Anti-HA FITC-konjugierten monoklonalen Antikörper - Bindung an Ca V α2δ1 Tsa-201 - Zellen wurden mit pmCherry-Ca V & transient transfizierten # 945; 2δ1-HA und mit einer Reihe von anti-HA FITC-konjugierten Antikörper oder Isotyp inkubiert. Es wird nur das FITC-Signal in diesem Panel analysiert. (A) Einzelparameter - Histogramme zeigen die relative Anzahl von Zellen auf der y-Achse und der FITC Fluoreszenzintensität auf der x-Achse für die anti-HA FITC-konjugierten Antikörper Bereich von Konzentrationen (0,01-20 ug / ml). (B) halblogarithmischen Diagramm für den anti-HA FITC-konjugierter Antikörper als Funktion des MFI von FITC. Die Titrationskurve wurde mit One - Site - Gleichung angepasst Bindung mit einem Trendlinie Wert R 2 = 0,99561. Titration für die Isotyp-Antikörper durchgeführt, zeigten keine Fluoreszenz, wie erwartet. Die Konzentrationen von 0,001 bis 0,01 g / ml sind zu unterscheiden von dem Hintergrundrauschen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1 "> Abbildung 5
Abbildung 5: Repräsentative Durchflusszytometrie Analyse von nicht-permeabilisierten Tsa-201cells transfiziert mit pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Schematische Darstellung der Gating - Strategie verwendet in der Durchflusszytometrie Analyse Probe.. Die Daten wurden nach der Akquisition mit der entsprechenden Software analysiert. Die erste Gating-Strategie nutzt eine Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Dot-Plot ein Tor (P1) um lebende Zellen anzuzeigen, und alle Ablagerungen, abgestorbene Zellen zu beseitigen, oder Aggregate, die unterschiedliche Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung als lebende Zellen haben . Zwei-Parameter - Konturplots des mCherry (y-Achse) gegen FITC (x-Achse) der Fluoreszenzintensität wurden für die Population P1 angezeigt. Rechteckige Tore wurden am Rande der Autofluoreszenz der Zellen angeordnet, um die positiven Population P2 (FITC und mCherry) und die negative Bevölkerung P3 auszuwählen. Die Höhe der Fluoreszenz für ter Zellen innerhalb der Region P2 und P3 wurden mit nachfolgenden Zelle im Vergleich zu FITC oder mCherry Fluoreszenzintensität Einzelparameter - Histogramme zählen visualisiert. Eine Verschiebung in der Fluoreszenzintensität auf der y- und x-Achse stellt einen zuverlässigen Index der Gesamt und Membranexpression von Ca V α2δ1 sind. Die Intensität des Fluoreszenzsignals erhöht in Abhängigkeit von der Anzahl der Moleküle Fluorochrom. (Ba) Repräsentative FCS / SSC Dot-Plots für jede Bedingung, wie angegeben. Insgesamt 10.000 Ereignisse wurden für die Analyse erworben. Die Ellipse Tor (P1) durch Auge um lebende Zellen gezogen Ereignisse mit niedrigen FSC (tote Zellen) oder hohe SSC (Aggregate) ausgenommen. (Bb) Representative zweiparametrige Konturplots des mCherry (y-Achse) gegen FITC (x-Achse) der Fluoreszenzintensität. Tore wurden am Rand der Autofluoreszenz der Zellen platziert abzusondern Populationen von FITC-mCherry positive Zellen (P2 Gate ) und negativen fluoreszierenden Zellen (P3). (Bc) Einzel-parameter Histogramme der relativen Zahl (oder% der max - Zellen) gegen die Fluoreszenzintensität (FITC oder mCherry). Die Verteilung der Fluoreszenzintensität für die Zellen innerhalb der P2 - Gate (Fluoreszenz-positive Zellen) gemessen sind grau dargestellt, und die Verteilung der Fluoreszenzintensität von Zellen , die in der P3 - Gate (Fluoreszenz-negativen Zellen) als eine Überlagerung in ein angezeigtes transparent grau Grundstück. Wie zu sehen ist , war die Fluoreszenzintensität für eine starke sowohl mCherry und FITC darauf hinweist , dass Ca V α2δ1 gut exprimiert wird und klar , die an der Zellmembran. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Gleichzeitige Mutationen von N -glycosylation Standorten gestört Zelloberfläche abpression von Ca V α2δ1. Stabile tsa-201 Ca V β3 - Zellen wurden vorübergehend gleichzeitig mit pCMV-Ca V 1.2 WT und pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT oder Mutanten transfiziert. Nicht-permeabilisierte (A) und permeabilisierten Zellen (B) wurden mit anti-HA FITC-konjugierten Antikörper gefärbt , wie oben beschrieben. Representative zweiparametrige Konturplots von mCherry gegen FITC - Fluoreszenz (linke Felder) und der Histogramm Plot Darstellung der Verteilung der Fluoreszenzintensität für die anti-HA FITC konjugierten Antikörper - Färbung (rechtes Feld) für N -glycosylation Mutanten (NQ) , nachdem der gezeigten Unterbrechung von vier Standorten (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) und 16 Stellen (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) in intakten nicht-permeabilisierten oder NP - Zellen (A) und in permeabilisierten Zellen oder P (B). Die distribution der Fluoreszenzintensität für die Zellen innerhalb der P2 - Gate (Fluoreszenz-positive Zellen) werden in grau gezeigt gemessen, und die Verteilung der Fluoreszenzintensität für Zellen , die in der P3 - Gate (Fluoreszenz-negativen Zellen) als eine Überlagerung in einem transparenten angezeigt grau Grundstück. Wie in (B) zu sehen ist , erhöht sich die Eigenfluoreszenz Spiegel nach Zellpermeabilisierung. Die Fluoreszenzintensität für FITC gemessen für alle transfizierten permeabilisierten Zellen erhöht (als eine Verschiebung nach rechts auf der x-Achse gesehen) , was anzeigt , dass alle transfizierten HA-markiertes Ca V α2δ1 Proteine wurden gefärbt und durch den anti-HA Antikörper FITC nachgewiesen. (C) Balkendiagramm zeigt die normierte in Gegenwart von FITC gemessen MFI in intakten nicht-permeabilisierten (Oberflächenexpression) oder permeabilisierten Zellen (Gesamtausdruck). Die relative Fluoreszenzdichte wurde in dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung (30.000 Zellen) und in drei verschiedenen Chargen von Zellen gemessen transfecfür jede Bedingung ted über einen Zeitraum von 1 Monat daher werden die Daten für 90.000 Zellen als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Peak-Fluoreszenzintensität wurde zwischen 24 und 36 h nach der Transfektion erreicht. Die ΔMFI Werte für FITC gemessen in intakten nicht-permeabilisierten Zellen wurde als ein Index der Zelloberflächenexpression von Ca V α2δ1-HA und ΔMFI Werte für FITC gemessen in permeabilisierten Zellen spiegeln die Gesamtproteinexpression (Zelloberfläche und intrazellulären Proteinexpression verwendet ). ΔMFI für FITC wurde durch Subtrahieren der FITC Fluoreszenzintensität des FITC-negativen Zellen (P3) von der Fluoreszenzintensität der FITC-positiven Zellen (P2) berechnet. Die gleiche Methode wurde verwendet, um die für ΔMFI mCherry zu berechnen. MFI - Werte wurden normiert auf den Maximalwert am selben Tag gemessen mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) Balkendiagramm zeigt die normalisierte ΔMFI mCherry gemessen in nicht-permeabilisierten oder permeabilisierten Zellen (total Ausdruck). Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± SEM Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Diese Durchflusszytometrie basierenden Assay wurde zur Messung der relativen Gesamt und Zelloberflächenniveaus von fluoreszenzmarkierten porenbildenden und die zugehörigen Untereinheiten von spannungsabhängigen Calciumkanälen 14,22,26 erfolgreich angewendet. Es wird verwendet, am besten, wenn die Wirkung der genetischen Mutationen zu untersuchen und somit erfordert, daß die intrinsische Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten markierten Wildtyp-Konstrukt sein, mindestens 10 bis 100-fach größer ist als die Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten unmarkierte Konstrukts . In diesem speziellen Fall das Konstrukt mCherry-Ca V α2δ1-HA hierin beschrieben ergab ein größeres Signal - Rausch - Verhältnis und einen größeren dynamischen Bereich als das, was für die bisher veröffentlichten Ca V 1.2-HA und Ca V 2.3-HA - Konstrukte wurde gemessen. Es gibt viele denkbare Gründe. Es kann spekuliert werden , dass die lokale Umgebung des HA - Epitop in der extrazellulären Domäne des Ca & V# 945; 2δ1 Protein maximiert das Signal-Rausch-Verhältnis des FITC-konjugierten anti-HA-Antikörper.

Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass diese Methode nicht einen Absolutwert in der Anzahl von Proteinen an der Zelloberfläche liefert. Die relative Expression des markierten Konstrukts erforderlichen Funktionskanalexpression zu erhalten , kann jedoch erhalten werden , indem nebeneinander patch-clamp Durchführung und Durchflusszytometrie Experimente unter den gleichen Bedingungen wie in Abbildung 7 der Referenz 22 gezeigt. Aus diesen Daten geht hervor, daß die Spitzenstromdichte geschätzt werden, eine globale Messung der Ionenkanalaktivität, die allgemein als eine Funktion erhöht der Oberflächenexpression der Untereinheit V Ca α2δ1 markiert. Die Hauptbeschränkung dieses Stromzelloberflächenexpression Assay bleibt, dass es zu diesem Zeitpunkt nicht auf die Untersuchung von endogenen Ionenkanäle angewendet werden kann. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass nur wenige kommerziell erhältliche Antikörperbekannt sind, vorhergesagt externe Domänen von Ionenkanälen spezifisch zu binden. Es erfordert somit genetische Manipulation der Primärsequenz des Proteins in einer undifferenzierten rekombinanten Zelllinie, wie Tsa-201-Zellen exprimiert werden, untersucht.

Kritischen Schritte bei der Optimierung des Assays: Die Identifizierung des entsprechenden Paares von Fluorophoren, die Auswahl des externen Epitop, und die Lokalisierung der Insertionsstelle sind entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, da die Insertion des Epitops nicht stören sollte mit Proteinfunktion. Verschiedenen Fluorophor Kombinationen wurden getestet. Zwei externe Epitope: das Hämagglutinin (HA) Epitop (YPYDVPDYA) und der Bungarotoxin-Bindungsstelle Epitop (WRYYESSLEPYPD) 27 und drei undurchlässige fluoreszierende konjugierte Antikörper wurden ausgewertet, nämlich die FITC (Fluoresceinisothiocyanat) -, die R-Phycoerythrin - und die PE-konjugiert Cy7--Antikörper. Darüber hinaus werden mehr als 10 verschiedene EinfügungStellen für die externen HA - Epitop wurden innerhalb von Ca V α2δ1 getestet. In Hinblick auf die Insertion des Epitops, die ortsgerichtete Mutagenese und rekombinante DNA-Techniken, ist es ratsam, zu entwerfen mindestens drei Sätze von Primern innerhalb der gleichen Region erfordert. Mit 9 Resten, ist das HA-Epitop eines der kleineren Epitope, für die im Handel erhältlichen fluoreszierenden konjugierten Antikörper, aber die Erfolgsrate Nukleotiden des Einsetzens 27 besteht, ist geringer als bei Punktmutation. Tetracysteinmotiv Motive (Reste Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) sind 2-Rückstand kleiner als das HA - Epitop , aber die Fluorescein arsenical hairpin Bindemittel Membran permeierenden und nicht geeignet für die Analyse von membrangebundenen Proteine 28. Vorversuche wurden mit zwei intrazellulären Fluorophore mCherry und Green Fluorescent Protein (GFP) durchgeführt. Drei Kriterien wurden verwendet, um das erfolgreiche Paar von Fluorophoren mit Ionenkanälen zu unterscheiden: 1) Emissionsspektren der Fluorophore Bedürfnissenicht zu überlappen (siehe Referenzen 20,21 für Details); 2) die Expression des markierten Konstrukts erzeugt funktionellen Ionenkanal in rekombinanten Zellen, wie durch Standard-elektrophysiologischen Methoden validiert; und 3) die Expression des Kontrollkonstrukts erzeugt ein robustes Fluoreszenzanzeige. Wenn eines dieser Kriterien nicht erfüllt, so zum Beispiel, wenn das Einfügen des Tags oder der Fluorophore mit Kanalfunktion stört, muss man ein bis Platz zurück und ändern Sie entweder die Stelle der Insertion des externen Epitop und / oder der Insertionsstelle des Fluorophors. Ein Linker aus 5-Glutaminresten zwischen dem C-Terminus des Proteins und des Fluorophors könnte dazu beitragen, die Proteinfunktion zu verbessern. Darüber hinaus kann es helfen, das externe Epitop in großen Schleifen einzufügen, die nicht eine kritische Rolle in der Proteinfunktion und / Protein-Glykosylierung zu spielen, sind bekannt. Man muss sich auch bewusst kleinere technische Aspekte zu sein.

Die Erfolgsrate der Liposom-vermittelten transfection in TSA-201 - Zellen konnten nach dem Einsetzen der beiden Epitope innerhalb Ca V α2δ1 verringert werden. Daher wird vorgeschlagen, die Transfektionseffizienz mit den erfindungsgemässen DNA-Konstrukte zu rekalibrieren. Dies geschieht, weil die Einfügung eines 30 kDa-Protein, das Molekulargewicht der DNA verändert. 2 bis 1: 3, wenn notwendig oder inkubieren, die Zellen bei 37 ° C für einen längeren Zeitraum (24-72 Stunden) konnte man die DNA-Liposomen-Verhältnis auf 1 ändern. Es ist wichtig, die richtige Formulierung zur Permeabilisierung der Zellen zu wählen. Die meisten hausgemachten Lösungen für dieses Projekt begutachtet stellte sich heraus, die Zellen zu bewirken, dass die Durchflusszytometer zu aggregieren und verstopfen.

Borten während der Belichtung die Zelle mit dem Fluorophor konjugiert Antikörper-Färbung ist wichtig, Photobleaching und Signalverlust zu begrenzen. Zur Minimierung der fluoreszierenden Hintergrund ist es wichtig, den Überschuss an konjugierte Antikörper vor dem Gebrauch zentrifugiert werden. Schließlich ist es der größter Bedeutung t zu analysierener Zellen auf dem Durchflusszytometer so schnell wie möglich, wie und spätestens 24 Stunden nach. Die gefärbten Zellen über Nacht bei 4 ° C zu halten wird das Signal und beeinträchtigen das Überleben der Zelle wahrscheinlich verringern. Variationen in der intrinsischen Fluoreszenz des Fluorophors-konjugierter Antikörper von Charge zu Charge zu diktieren, dass die Fluoreszenzintensität des Testkonstrukts berichtet werden muss, als eine Funktion der Fluoreszenzintensität des Kontrollkonstrukt unter identischen experimentellen Bedingungen ausgedrückt.

Um ein insgesamt gutes Signal - Rausch - Verhältnis zu erreichen, wird es empfohlen , Zell Pipettieren zu minimieren Zelltod zu reduzieren und zu resuspendieren sanft die Zellen , so dass eine 3 x 10 6 Zellen / ml in dem Durchflusszytometer injiziert. Hüten Sie sich vor, dass eine höhere Zellkonzentration der Zellfluss zu reduzieren und könnte die Durchflusszytometer verstopfen. Auf der anderen Seite, eine untere Zellkonzentration eine längere Verarbeitungszeit erfordert. Man kann somit muss die Konzentration einzustellen in Abhängigkeit von der type von Zellen untersucht werden.

Alternative Assays: Weitere Methoden zur Bewertung der Gegenwart von Ionenkanälen an der Zelloberfläche der Plasmamembran fallen in vier große Kategorien zu dokumentieren eingesetzt: 1) Konfokales Abbildungsverfahren die hochaffine Wechselwirkung zwischen dem Fluorophor-konjugierten Antikörper und das Zielprotein zu nutzen; 2) Proteinchemietechniken ruht auf der kovalenten Modifikation des Zielproteins durch Biotinylierung Reagenzien; 3) Die elektrophysiologischen Maßnahmen nicht stationärer Rauschanalyse; und 4) Photoaffinitätsmarkierung des Zielproteins mit radioaktiven Sonden. In dem Fall der spannungsabhängigen Calciumkanal, Photoaffinitätsmarkierung mit tritiiertem (±) - [3 H] PN 200-100, ein hochaffiner Liganden der Dihydropyridin - Familie wurde ausgiebig in den 1980er Jahren 31 verwendet. Es bleibt ein hochsensitiver Assay beinhaltet aber die Handhabung des radioaktiven Materials 31, das aus der Mode nach dem Aufkommen gefallen istvon hochempfindlichen Fluoreszenz und Lumineszenz-Sonden vor allem bei jüngeren Forscher. Darüber hinaus ist es unmöglich, Ionenkanalaktivität in der Anwesenheit des Antagonisten, derart, dass die Korrelation zwischen der Oberflächenexpression und Funktion außerhalb der Grenzen dieses Ansatzes zu messen ist. Am anderen Ende des Versuchs Kontinuum, nicht-stationäre Geräuschanalyse von Ionenkanälen erfordert eine hohe Qualität Gigaseals Patch-Clamp-Aufnahmen mit einer stabilen Basis für minutenlange Aufnahmen. Mit diesem Ansatz kann man die Anzahl der offenen Ionenkanäle in einer einzelnen Zelle aus der Steigung der grafischen Extrahieren der Rauschvarianz als Funktion des Durchschnittsstrom zu einem gegebenen Potential 32-34 gemessen Plotten. Es zeigt die gleichen Insignien Standard elektro Ansätze. Es ist eine arbeitsintensive und niedrige Durchsatzverfahren , die 32-34 zusätzlich eine gute Vertrautheit mit Spektralanalyse erfordert, nicht ein fester Bestandteil des Zellbiologen. Außerdem ist diese Art von analysis bezeichnet die Anzahl der aktiven Ionenkanäle (im offenen Zustand), die an der Membran als die Anzahl der gesamten Proteine ​​unterschiedlich sein könnten. Markierung von Zelloberflächenproteinen mit Biotin-Reagenzien ist ein relativ leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Proteinen, die an der Plasmamembran. Dieses Verfahren nutzt die kovalente Modifikation von Membranproteinen durch Biotin und weiter mit hoher Affinität und hoher Spezifität nicht-kovalente von Biotin an Membran-impermeant Streptavidin oder Avidin-Moleküle binden. Dieser Ansatz ist qualitativ zuverlässig, ist jedoch behindert oder durch Quantifizierung Fragen begrenzt regelmäßig im Zusammenhang mit Proteinen enthüllt die Western-Blot-Technik. Konfokale Bildgebung und seine Derivate sind weit verbreitet , die Co-Lokalisierung von Membranproteinen mit der Zellfläche 35 zur Dokumentation verwendet. Qualitative Plasmamembran Isolierung bleibt möglich mit differenzieller Zentrifugation Techniken mit oder ohne Sucrosegradienten 36. Wie in der oben beschriebenen Durchflusszytometrie ASSAy, stützt sie sich auf die hochspezifische Interaktionen zwischen dem Zielprotein und einem Fluorophor-konjugierten Antikörper. Eine innere Totalreflexion Fluoreszenzbildgebung Insbesondere ist ein leistungsfähiges Konzept, das die Verteilung und molekulare Verhalten von einzelnen Ionenkanälen an der Membranoberfläche 37,38 berichten kann. Die Anzeige ist auf jeden Fall ins Auge fallend, sondern bleibt ein geringer Durchsatz kleinvolumigen Ansatz. Alle diese Tests haben ihren wissenschaftlichen Wert. Der High-Throughput-Durchflusszytometrie basierende Test ist überlegen in Bezug auf Auslese Reproduzierbarkeit und quantifizierbare Metriken erfordert aber einen einfachen Zugang zu Multi-Laser-Durchflusszytometrie Zellsortierern, die Teil von Kernanlagen in großen Institutionen sind. Fluoreszenzbasierte Plattenleser sind billiger und leichter zugänglich, aber das Signal-Rausch-Verhältnis erhalten, gemessen mit den gleichen Konstrukten unter den gleichen Versuchsbedingungen deutlich niedriger lag im großen Teil auf eine höhere Fluoreszenzhintergrund. Die Kosten des fluorophorkonjugierten eintibodies kann auch vor allem durch die Anzahl der entsprechenden Kontrollexperimenten berücksichtigt werden, die mit den Testkonstrukten verarbeitet werden müssen. Variationen über das gleiche Thema umfassen das Ändern des Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte Antikörper für kosteneffektive Meerrettich - Peroxidase oder alkalische Phosphatase - Antikörper - Enzym - Reporter , die Enzymaktivität kann durch Chemilumineszenz 29,30 getestet werden.

Schlussfolgerung: Zweifarben-Fluoreszenz-Assays entwickelt wurden, um die relative Zelloberflächen-Expression von rekombinanten Proteinen in kultivierten Zellen exprimiert abzuschätzen Durchflusszytometer verwendet wird. Obwohl nur zwei Fluoreszenzparameter in diesem Strom-Assay verwendet wurden, Durchflusszytometrie ist offen für die gleichzeitige Erfassung von mehr als 30 Fluoreszenzsonden auf einer einzelnen Zelle, die eine hohe Flexibilität dieses Ansatzes zu demonstrieren. Dieser High-Throughput ultrasensitiver Assay kann angepasst werden , um die Auswirkungen der genetischen Mutationen 22,26 oder posttranslationale modificati zu untersuchen23 ons sowie das pharmakologische Profil von Chaperonen für die Oberflächenhandel von Membranproteinen Techniken 39 studieren. Die treibende Kraft hinter diesem Protokoll aus der Notwendigkeit entstanden in Isolation um die Auswirkungen von genetischen Mutationen auf die Membranexpression von Ionenkanälen in rekombinanten Zellen zu bewerten. Es ist jedoch wichtig zu beachten , dass die Schwere der mutierten Kanalstörungen bei Modellzelllinien nicht immer mit der Schwere der klinischen Symptome bei Mutationsträgern 5 teilweise korrelieren , da eine Kombination von Mutationen in verschiedenen Allelen erforderlich sein könnte plötzlichen Herztod 40 auslösen , 41. In diesem Zusammenhang kann dieser Assay ersten Stufe eine schnelle Annäherung die Bereitstellung einzelne oder mehrere Mutationen in einem Gen des Studierens mit loss-of-function Mutationen 22 zugeordnet betrachtet werden. Es ist jedoch plausibel in Zukunft das Virus-vermittelte Expression der gleichen Konstrukte in differenzierten Zellen von cardiomyocy vorstellente Linie. Insgesamt, wie bei anderen bildgebenden oder lumineszenten Techniken verglichen, Durchflusszytometer Sortierer lebenden Zellen in Suspension und Bericht Fluoreszenzintensität einer homogenen Zellpopulation behandeln. Dieses Verfahren wird ohne die Notwendigkeit einer Fixierung mit Paraformaldehyd durchgeführt, ein Prozess, der lokale Plasma Membranpermeabilisierung induziert, selbst unter milden Bedingungen 42. Der Test ist schnell, spezifisch und bequem mit der Analyse von bis zu mehreren hundert Proben pro Arbeitstag. Zusätzlich zur Analyse kann schließlich die Zellen mittels Durchflusszytometrie sortiert werden, um das Funktionspotential von Zellen zu beurteilen, höheren oder niedrigeren Ebenen der gleichen Membranprotein exprimieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

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References

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