February 22nd, 2017
这项研究涉及到的方法来揭示继抗生素皮肤和肠道微生物群落组成的改变模型鱼主机上的影响。
该实验系统的总体目标是检查抗生素治疗后对宿主生物体的负面影响。因此,这种方法可以帮助回答微生物组领域的关键问题,例如由被破坏的微生物组介导的 enbac 相关对宿主健康的副作用。因此,该技术的主要优点是该系统在检查脊椎动物宿主的生理表型方面简单、成本低廉,并允许对粘膜微生物组进行无创破坏。
这项技术的含义描述了动物微生物组的破坏如何导致主要的副作用。首先,将先前获得并冷冻的 Edwardsiella ictaluri 感染菌株划线到 E.Ictaluri 选择性和差异培养基琼脂上。将培养物在 27 摄氏度下孵育两天。
从培养物中转移一个纯分离的菌落,并在含有 40 mL 营养肉汤的 150 mL 培养瓶中接种。将培养瓶置于 27 摄氏度、150 RPM 的振荡培养箱中两天。孵育后,为了校准 E.Ictaluri 培养物以获得所需的感染剂量体积,使用 PBST 将培养物样品稀释至 OD 650 为 0.2。
收集 Gambusia affinis 并在水柱中用利福平处理鱼 3 天后,将抗生素处理和未处理的对照组转移到装有 130 毫升新鲜人工池塘水 (APW) 的单独塑料杯中约 10 小时,以便从鱼组织中清除药物。然后,再次将鱼分装到装有 130 毫升干净 APW 的 8 盎司塑料杯中。对每条鱼施用致死剂量的 E.Ictaluri 培养物,并在 27 摄氏度下孵育鱼 24 小时。
在 E.Ictaluri 浴后,将每条鱼转移到一个装有 130 毫升 APW 的新杯子中。在不喂鱼的情况下,记录一周内的鱼死亡率。将收集的粪便收集到无菌塑料袋中,然后将其转移到无菌的 15 毫升锥形管中,然后使用 PBST 制备 500 至 800 毫克/毫升的粪便储备浓度,使用 1 毫升或更大的塑料移液器,切掉尖端,制备每杯 130 毫升的 15 毫克/毫升或 10 毫克/毫升的粪便 APW。
将经过抗生素处理或未处理的鱼转移到单独的溶液杯中,然后将鱼在 25 摄氏度下孵育两天,密切观察和记录在此期间的死亡率。要用土壤处理鱼,请收集 1 到 公斤的肥沃有机表土,大约 7 公斤深 15 厘米,然后将其转移到干净的塑料容器中。准备装有 18.2 克土壤和 130 毫升 APW 的单个塑料杯,用手将土壤充分混合,然后将经过抗生素处理或未经处理的鱼转移到杯子中,在 25 摄氏度下放置三天,同时记录任何死亡率。
抗生素处理后在 APW 中休息 10 小时后,将鱼转移到含有每毫升 17.5 毫克氯化钠和 APW 的单独杯子中,观察鱼在 36 小时内的死亡率,进行硝酸盐毒性挑战,像以前一样休息 10 小时后,将鱼分入含有每毫升 10 或 17.5 毫克硝酸钠和 130 毫升 APW 的单独杯中。观察鱼在高剂量硝酸钠下 1 天的死亡率,在低剂量下观察鱼 4 天的死亡率。在完成 3 天的抗生素或分组对照暴露后,对于单条鱼,在 8 盎司聚苯乙烯泡沫塑料杯中装满 150 毫升 APW,称量装满的杯子后,将鱼转移到杯子中,然后记录总体重量以进行初步评估。
每天用每条鱼两粒食物喂鱼,通过目视记录未食用的颗粒来监测消耗量。在四个星期的每周结束时,首先称量一杯新鲜的 APW 并记录重量,然后将鱼倒入浸网中,转移到新杯中,然后再次称量杯子。对于成群的鱼,将 150 毫升 APW 放入杯中并去皮。
将鱼转移到新的 APW 容器中时,将鱼放在两组中,然后记录总组重量。在一个月的时间里,每周结束时重复称重。为了分析肠道通过时间,将 360 微升无菌去离子水和 52 毫克明胶加入无菌 1.7 毫升试管中,然后将其放在 60 摄氏度的加热块上,直到明胶融化并完全溶解。
用研钵和杵将金鱼食品薄片研磨成细粉,然后将 40 毫克粉末和 20 微升鱼油加入管中。混合后,加入 1.6 毫克 FitC 葡聚糖。将 20 微升热液体滴到实验室工作台上的封口膜上,让它们快速冷却和凝固。
将封口膜放在培养皿的一半上,并将其漂浮在密封塑料容器内的无菌水上。将凝固的滴剂存放在冰箱中最多四天,以免它们变得太硬以至于鱼无法食用。在喂食之前,用剃须刀片将滴剂切成四分之一段。
让鱼适应单独的泡沫塑料杯两天而不喂食,将四分之四的食物放入鱼杯中,观察鱼 30 分钟,看看它们各自吃了多少块食物。要开始监测,将每条鱼转移到装有 80 毫升 APW 的杯子中,每两小时取 1 毫升样品。将其储存在贴有标签的 1.7 毫升管中,温度为 4 摄氏度。
测定完成后,将整个 1 毫升样品放入比色皿中,并使用荧光分光光度计记录 495 纳米激发的荧光,同时记录所有样品的 520 纳米发射。如此处所示,具有抗生素改变微生物组的鱼比对照鱼更容易受到 E.Ictaluri 感染。处理鱼与对照鱼的平均死亡时间差异不显著。
这可能是由于小组规模小。该图表明,暴露于利福平的鱼比对照鱼更容易受到渗透压,通过这种测定,盐度水平高于每毫升 18 毫克会导致鱼快速死亡。如下表所示,当暴露于水柱中的硝酸盐毒素时,暴露前抗生素治疗不会影响生存。
在 10 毫克/毫升时,抗生素治疗组和对照组在 90 小时时均观察到 50% 的致死率。在这个使用水族箱中的对照鱼的实验中,将两段 FitC 葡聚糖标记的食物或一段喂给鱼,通过测量周围水中随时间变化的荧光来检查食物的运输时间。遵循此程序,可以执行其他方法,例如测量全身脂肪储存和量化皮肤粘液生成,以了解机制,并缩小可能导致负面宿主效应的混杂因素。
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本研究考察了在抗生素处理后,如何影响皮肤和肠道微生物组组成,从而对模型鱼宿主产生负面副作用。该方法提供了关于如何破坏微生物组影响宿主健康的见解。
Disruption of the host microbiome by antibiotics presents a critical challenge for early-stage drug discovery, impacting host-pathogen interactions and physiological phenotypes. This tractable vertebrate model enables rapid, quantitative assessment of host responses to microbiome alteration, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in target validation. The approach informs portfolio decisions by clarifying the biological consequences of microbiome perturbation across diverse host challenges.
This model system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of microbiome disruption effects on host phenotype and disease susceptibility.